袁昕 高四書(shū) 羅凱明 項(xiàng)守奎 華飛
蘇州大學(xué)附屬第三醫(yī)院內(nèi)分泌科,常州 213003
維生素D是一種類(lèi)固醇激素,通過(guò)與靶細(xì)胞維生素D受體(VDR)結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)作用,經(jīng)典作用是調(diào)節(jié)鈣、磷代謝[1]。近年來(lái)全世界人群維生素D缺乏越來(lái)越普遍,隨著研究的深入,已發(fā)現(xiàn)維生素D與腫瘤、心血管疾病、自身免疫性疾病、糖尿病等的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān),還有研究表明維生素D可調(diào)節(jié)女性生殖過(guò)程[2-5]。
研究發(fā)現(xiàn),敲除VDR基因或維生素D活化所需的1α-羥化酶基因的小鼠,除有低鈣、低磷及佝僂病樣表現(xiàn)外,還出現(xiàn)性激素紊亂、卵泡生成受損、子宮發(fā)育不全、不育等,而補(bǔ)充鈣、磷后可糾正生殖異常,因此認(rèn)為,維生素D對(duì)雌鼠生育系統(tǒng)的影響是通過(guò)調(diào)節(jié)鈣、磷水平實(shí)現(xiàn)的[6]。本研究擬建立正常鈣、磷水平的維生素D缺乏大鼠模型,觀察維生素D對(duì)雌性大鼠代謝、性激素、卵巢形態(tài)及功能的直接影響。
1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 48只健康SPF級(jí)3周齡Sprague-Dawley(SD)雌性大鼠,體重(59.0±7.1)g,由江蘇常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供[許可證號(hào):SCXK(蘇)2016-0010,合格證編號(hào):201821081]。飼養(yǎng)環(huán)境:12 h白熾燈光照/12 h夜晚,溫度22℃,濕度50%~60%,大鼠自由飲食、飲水。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,將大鼠按隨機(jī)數(shù)字法隨機(jī)分為對(duì)照組(n=24)和維生素D缺乏組(n=24),分別予標(biāo)準(zhǔn)飼料、維生素D缺乏飼料喂養(yǎng)。標(biāo)準(zhǔn)飼料(按AIN-93標(biāo)準(zhǔn)配方生產(chǎn),維生素D1 000 IU/kg,0.5%鈣,0.3%磷)和維生素D缺乏飼料(幾乎不含維生素D,2%鈣,1.2%磷)由江蘇南通特洛菲飼料公司提供。
1.2 試劑 25-羥維生素D[25(OH)D]檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海羅氏診斷產(chǎn)品公司。睪酮、雌二醇、孕酮、黃體生成素(LH)、卵泡刺激素(FSH)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物科技公司??姑缋展芗に?AMH)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Cusabio公司。大鼠胰島素ELISA試劑盒購(gòu)自美國(guó)Millipore公司。
1.3 實(shí)驗(yàn)方法 每周檢測(cè)攝食量及體重變化。第6、14、22周兩組分別按隨機(jī)數(shù)字法取8只大鼠,每日行陰道涂片,在顯微鏡下觀察,記錄涂片中的細(xì)胞類(lèi)型,判斷動(dòng)情周期的階段,共14 d。第8、16、24周,將已觀察動(dòng)情周期的大鼠禁食12 h,戊巴比妥鈉麻醉后打開(kāi)腹腔,腹主動(dòng)脈取血,摘取雙側(cè)卵巢。血標(biāo)本離心后收集血清,于-80℃保存。卵巢組織用4%甲醛溶液固定,常規(guī)石蠟包埋,沿卵巢長(zhǎng)軸最大截面切片,HE染色后光鏡下觀察病理學(xué)結(jié)構(gòu)。大鼠血清室溫復(fù)溶后用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)空腹血糖、甘油三酯、總膽固醇、血鈣、血磷,ELISA法檢測(cè)空腹胰島素、睪酮、雌二醇、孕酮、LH、FSH、AMH,電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)25(OH)D水平。計(jì)算穩(wěn)態(tài)模型評(píng)估-胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)=空腹血糖×空腹胰島素/22.5。
2.1 大鼠血清25(OH)D、血鈣、磷的比較 第8、16、24周維生素D缺乏組血清25(OH)D水平均顯著低于對(duì)照組(t=9.69、3.69、4.04,P均<0.05)。3個(gè)時(shí)間點(diǎn)兩組血鈣、磷水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見(jiàn)圖1。
2.2 大鼠體重及血脂、血糖、胰島素、HOMA-IR的比較 維生素D缺乏組與對(duì)照組的體重差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。第8周時(shí)兩組甘油三酯、空腹血糖、空腹胰島素、HOMA-IR差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,第16、24周維生素D缺乏組血清甘油三酯、空腹血糖、空腹胰島素、HOMA-IR均較對(duì)照組升高(t=-2.45、-2.50、-3.08、2.93、-4.02、-3.94、3.87、3.86,P均<0.05)。3個(gè)時(shí)間點(diǎn)兩組血清總膽固醇水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見(jiàn)圖2。
2.3 大鼠性激素水平的比較 維生素D缺乏組血清睪酮、雌二醇、孕酮、LH與對(duì)照組相比均無(wú)明顯差異。第8、16周兩組大鼠FSH水平無(wú)顯著差異,第24周維生素D缺乏組FSH水平較對(duì)照組顯著降低(t= 2.35,P<0.05)。3個(gè)時(shí)間點(diǎn)維生素D缺乏組LH/FSH比值均高于對(duì)照組(t=-2.29、-2.45、-3.12,P均<0.05),見(jiàn)圖3。
表1 大鼠動(dòng)情周期各階段持續(xù)時(shí)間的比較
2.4 大鼠血清AMH水平的比較 第8、16、24周維生素D缺乏組AMH水平均較對(duì)照組升高(t=-2.54、-2.99、-2.39,P均<0.05),見(jiàn)圖4。
2.5 動(dòng)情周期 第8、16、24周兩組的動(dòng)情前期、動(dòng)情期、動(dòng)情后期、動(dòng)情間期持續(xù)的時(shí)間差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見(jiàn)表1。
2.6 卵巢形態(tài) 對(duì)照組和維生素D缺乏組的卵巢切片均可見(jiàn)處于各個(gè)發(fā)育階段的卵泡和黃體,還可見(jiàn)囊狀擴(kuò)張的卵泡,見(jiàn)圖5(封3)。通過(guò)對(duì)各階段卵泡計(jì)數(shù)并比較,發(fā)現(xiàn)第24周維生素D缺乏組卵巢的囊狀卵泡數(shù)量顯著高于對(duì)照組(P<0.05),見(jiàn)表2。
表2 大鼠囊狀卵泡數(shù)量的比較(個(gè),
2.7 相關(guān)性分析 相關(guān)性分析的結(jié)果顯示,血清25(OH)D水平與甘油三酯水平和LH/FSH比值呈負(fù)相關(guān)(r=-0.378、 -0.362,P均<0.05);但與總膽固醇、睪酮、雌二醇、孕酮、LH、FSH及AMH沒(méi)有顯著相關(guān)性(P均>0.05)。
維生素D缺乏往往合并鈣、磷水平降低,既往有研究對(duì)敲除VDR基因或1α-羥化酶基因的小鼠補(bǔ)充鈣、磷后,小鼠出現(xiàn)的生殖功能異常得到糾正,維生素D對(duì)雌鼠生育的影響是通過(guò)調(diào)節(jié)鈣、磷水平實(shí)現(xiàn)的[6]。還有研究發(fā)現(xiàn),增加鈣攝入可改善多囊卵巢綜合征(PCOS)患者的高雄激素血癥,增加高密度脂蛋白-膽固醇(HDL-C)水平[7]。這些研究結(jié)果均表明,血鈣、磷可影響代謝、性激素水平及生殖功能。
維生素D缺乏的飼料喂養(yǎng)聯(lián)合不含紫外線(xiàn)光照環(huán)境是建立維生素D缺乏動(dòng)物模型較為常用的方法之一,且符合現(xiàn)代人由于飲食結(jié)構(gòu)不平衡及戶(hù)外光照時(shí)間減少所致維生素D水平降低的特征[6]。Stavenuiter等[8]通過(guò)增加大鼠維生素D缺乏飼料中鈣、磷的含量,在引起維生素D缺乏的同時(shí),維持了血清鈣、磷水平的穩(wěn)定。Sun等[6]給予1α-羥化酶基因敲除大鼠高鈣、高磷飲食,使大鼠維持正常的鈣、磷水平。本實(shí)驗(yàn)結(jié)合既往文獻(xiàn),在不含紫外線(xiàn)的白熾燈光照環(huán)境下,給予維生素D缺乏組幾乎不含維生素D的飼料,其中鈣和磷的含量較對(duì)照組標(biāo)準(zhǔn)飼料均升高4倍。喂養(yǎng)8、16、24周后,維生素D缺乏組維生素D水平顯著降低,鈣、磷水平較對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
臨床觀察性研究表明,維生素D水平與代謝綜合征的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)及嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)[9-10]。研究發(fā)現(xiàn),PCOS女性血清25(OH)D水平與HOMA-IR呈負(fù)相關(guān),補(bǔ)充維生素D則可以降低PCOS女性甘油三酯水平,改善糖代謝[11-12]。筆者研究發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比,維生素D缺乏組甘油三酯、空腹血糖、HOMA-IR增加,且血清25(OH)D水平與甘油三酯水平呈負(fù)相關(guān),提示維生素D缺乏會(huì)影響糖、脂代謝。關(guān)于維生素D作用機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn),維生素D缺乏會(huì)加重細(xì)胞氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng),損害肝臟和胰腺對(duì)糖、脂代謝的調(diào)節(jié)功能[4, 13]。
VDR不僅存在于下丘腦、垂體,也存在于卵巢、子宮、胎盤(pán)等外周生殖器官[5]。提示維生素D可能作用于靶組織VDR,影響生殖功能。敲除VDR基因或1α-羥化酶的大鼠,性腺功能低下,卵泡形成受損,子宮發(fā)育不良[5-6]。卵巢顆粒細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),維生素D在細(xì)胞氧化應(yīng)激和細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)中起作用,影響顆粒細(xì)胞的增殖與凋亡[14]。與性激素合成密切相關(guān)的類(lèi)固醇合成酶的表達(dá)也受維生素D影響,如維生素D可上調(diào)3β-羥基類(lèi)固醇激素脫氫酶、類(lèi)固醇合成快速調(diào)節(jié)因子、細(xì)胞色素P450羥化酶mRNA表達(dá),增加孕酮、雌二醇的合成[14-15]。本研究中,維生素D缺乏大鼠雌二醇水平有降低的趨勢(shì),可能是維生素D缺乏后導(dǎo)致類(lèi)固醇合成酶相關(guān)基因表達(dá)降低的結(jié)果。但兩組之間雌二醇、孕酮、睪酮差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,可能是因?yàn)椋?1)大鼠體內(nèi)存在復(fù)雜的反饋機(jī)制及其他可能影響類(lèi)固醇激素合成的因素,與單獨(dú)顆粒細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)維生素D對(duì)類(lèi)固醇激素的調(diào)節(jié)作用可能有差異。(2)本實(shí)驗(yàn)維持了正常的鈣、磷水平,與既往一些研究的條件有所不同。
PCOS是育齡期女性最常見(jiàn)的生殖內(nèi)分泌疾病,也是無(wú)排卵性不孕最常見(jiàn)的原因[12]。臨床特點(diǎn)包括高雄激素血癥、月經(jīng)異常、不孕、卵巢多囊樣改變等,可伴有肥胖、胰島素抵抗、血脂紊亂等代謝異常[16]。研究發(fā)現(xiàn),與健康育齡期女性相比,PCOS患者合并維生素D缺乏的比例更高[17]。且維生素D水平與PCOS患者的代謝及生殖異常具有相關(guān)性[17-18]。PCOS患者常存在高LH伴正?;虻退降腇SH,LH/FSH比值升高,影響卵泡發(fā)育,出現(xiàn)生殖功能障礙[19]。本研究發(fā)現(xiàn),維生素D缺乏大鼠LH水平有升高趨勢(shì),F(xiàn)SH水平降低,LH/FSH比值升高,這與PCOS患者垂體促性腺激素的變化特點(diǎn)一致,且大鼠LH/FSH比值與25(OH)D水平呈負(fù)相關(guān)。既往也有研究發(fā)現(xiàn),PCOS女性L(fǎng)H/FSH比值與25(OH)D水平具有相關(guān)性[20]。筆者推測(cè)維生素D缺乏與性激素水平失調(diào)有關(guān),可能影響性激素分泌的中樞機(jī)制。
本研究還發(fā)現(xiàn),大鼠維生素D缺乏的同時(shí)伴有AMH水平升高,卵巢囊狀卵泡數(shù)量增加。既往研究發(fā)現(xiàn),維生素D與AMH水平密切相關(guān)[21]。維生素D通過(guò)抑制AMH水平,降低AMH受體、FSH受體的基因表達(dá),調(diào)節(jié)AMH信號(hào)通路,參與卵泡的發(fā)育成熟過(guò)程[22]。維生素D缺乏后AMH與性激素的異常,可能共同參與了多囊卵巢卵泡異常的發(fā)生。
本研究結(jié)果提示,維生素D缺乏可影響雌性大鼠糖、脂代謝、性激素及AMH水平,卵巢出現(xiàn)多囊樣改變。維生素D缺乏可能參與PCOS代謝、生殖功能異常的發(fā)生,具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。