金友蘭，劉 安，肖文軍,

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學 茶學教育部重點實驗室，國家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，湖南 長沙 410128；2.湖南省植物功能成分利用協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 長沙 410128）

茶葉深加工主要是指以茶葉生產(chǎn)過程中的茶鮮葉、茶籽、茶樹修剪葉以及由其加工而來的半成品、成品或加工副產(chǎn)品等為原料，通過集成應(yīng)用生物化學、生物工程、分離純化工程、營養(yǎng)與衛(wèi)生學與酶制劑等領(lǐng)域的先進技術(shù)及加工工藝[1]。隨著茶葉深加工領(lǐng)域的不斷拓展, 無論是茶飲料、速溶茶或是茶多酚等功能成分的提取都會產(chǎn)生大量的茶渣[2]。目前茶葉深加工中提取分離的有效成分尚局限于約占茶葉干重35%的水溶性物質(zhì)[3]，而且在提取這些水溶性物質(zhì)的過程中，也僅能獲得其80%～90%的得率。茶葉中的不溶性多糖類物質(zhì)占茶葉干重的20%～25%，主要是纖維素、半纖維素、淀粉和果膠等。通過生物降解技術(shù)，使不溶性糖轉(zhuǎn)化為水溶性糖，并使水溶性糖得率最大化，是提高茶渣的綜合利用效率、避免因茶渣的丟棄而造成環(huán)境污染的重要發(fā)展方向。我國目前對于茶渣的研究仍處于初級階段，已有的研究集中在茶渣的成分分析、茶蛋白的初步提取及茶渣用作飼料、肥料等的研究[4]。

本試驗采用的輻照處理，作為一種物理手段，可使纖維素聚合度下降、結(jié)構(gòu)松散、反應(yīng)可及度提高，具有處理時間短、操作簡單、能耗低、不污染環(huán)境等優(yōu)點[5]。目前鮮見此類研究，為此探索輻照預處理輔助纖維素酶降解綠茶水提茶渣制備水溶性糖的可行性，對資源綜合利用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

綠茶茶渣由湖南金農(nóng)生物資源股份有限公司提供；蒽酮、醋酸、醋酸鈉均由國藥集團化學試劑有限公司提供；纖維素酶（4×105U·g-1，其最佳作用pH值為4.8 左右，上海瑞永生物科技有限公司）；硫酸（80%，株洲市星空化玻有限責任公司）；WFJ-7200 型可見分光光度計（尤尼柯上海儀器有限公司）；全溫培養(yǎng)搖床（上海蘇坤實業(yè)有限公司）；恒溫水浴鍋（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 輻照處理

提前將原料分裝于玻璃瓶內(nèi)，以60Co 為輻照源分別采用0 kGy、200 kGy、600 kGy、800 kGy、1000 kGy 和1200 kGy 的輻照劑量對其進行輻照處理。輻照后的樣品封于鐵盒中，室溫下避光保存。

輻照后水提茶渣中還原糖提?。焊鞣Q取1.5 g經(jīng)上述劑量輻照后的茶渣放入10 mL離心管中，加入30 mL 的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液，將離心管放入搖床，在50℃，130 r·min-1的條件下進行振蕩，分別在反應(yīng)后的52 h、54 h、56 h、58 h和60 h 時吸取上清液1 mL，過膜后裝于2 mL離心管，制成待測液，分別測定其還原糖的含量。

1.2.2 茶渣酶解

分別稱取0.15 g、0.25 g、0.35 g 的纖維素酶于10 mL 離心管中，并做好標記，加入30 mL的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液和1.5 g 未經(jīng)輻照預處理的茶渣，蓋好后置于50 ℃、130 r/min 可控溫搖床中進行酶解，分別在反應(yīng)后的4 h、6 h、8 h、10 h、24 h、29 h、48 h、72 h 和96 h 時統(tǒng)一提取1 mL 茶液樣，測定其還原糖的含量。

分別稱取未經(jīng)輻照預處理的茶渣1.5 g 放入10 mL 離心管中，將離心管放入搖床，分別設(shè)置30℃、40℃、50℃、60℃，在130 r/min 的條件下進行反應(yīng)，再統(tǒng)一對還原糖含量進行檢測。

1.2.3 輻照預處理輔助纖維素酶水解

茶渣經(jīng)不同劑量輻照處理后，分別稱取1.5 g 茶渣樣品加入已配有30 mL 緩沖液、0.25 g 纖維素酶的離心管中，于130 r/min、50℃的全溫培養(yǎng)搖床中進行酶解反應(yīng)，分別于第52 h、54 h、56 h、58 h 和60 h 進行取樣，統(tǒng)一進行還原糖含量檢測。

1.2.4 還原糖測定分析

還原性糖含量：待測液經(jīng)適當倍數(shù)稀釋后進行采樣，用DNS 法對還原糖含量進行測定[6-7]。測定方法與步驟：將茶渣還原糖稀釋適當倍數(shù)后備用。吸取上述待測液后用超純水補至1 mL并加入4 mL DNS 試劑，同時以蒸餾水作空白對照，沸水浴顯色10 min，取出冷卻，以空白調(diào)零，在620 nm 處測定ABS值。

文中圖表均采用origin 制圖軟件進行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 纖維素酶對綠茶茶渣還原糖含量的影響

2.1.1 加酶量對茶渣還原糖含量的影響

在相同反步增加至0.35 g 時，還原糖產(chǎn)量水平與0.25 g 酶量的酶解效果相當。由此可知，增加酶量有利于在相同酶解時間段內(nèi)的還原糖含量增加。當酶量由0.15 g 增加至0.25 g 時，還原糖產(chǎn)量呈上升趨勢，當酶量達到0.35 g 時，由于受到底物的限制，還原糖含量不再提高。從經(jīng)濟節(jié)約的角度來考慮，加酶量可采用0.25 g。酶量對茶渣還原糖含量的影響如圖1所示：

圖1 加酶量對還原糖含量的影響Fig.1 Effectof the amount of enzyme on the content of reducing sugar

2.1.2 酶解時間對茶渣還原糖含量的影響

在酶解過程的前29 h，還原糖產(chǎn)量上升趨勢較平緩，29 h～48 h 時，隨著酶解時間的增加，還原糖的產(chǎn)量快速提高，48 h 達到最高，還原糖含量為214.649 mg，48 h 后呈下降趨勢，96 h還原糖含量為153.847 mg。48 h 之后由于酶解時間過長，底物和酶量均減少，故還原糖含量逐漸減少，因此最適酶解時間應(yīng)在48 h 左右，如圖2所示。

2.1.3 酶解溫度對茶渣還原糖含量的影響

隨著酶解溫度由30℃升高到50℃，還原糖含量明顯上升，說明此時溫度升高有利于酶解，而當溫度進一步升高至60℃時，對酶解反應(yīng)產(chǎn)生了明顯的抑制作用，導致還原糖產(chǎn)量大幅度下降，主要是因為過高的溫度使部分纖維素酶失活，由此可知纖維素的最佳酶解溫度在50℃左右。酶解溫度對茶渣還原糖含量的影響如圖3所示。

圖2 酶解時間對還原糖含量的影響Fig.2 Effect of enzymolysis time on the content of reducing sugar

圖3 酶解溫度對還原糖含量的影響Fig.3 Effect of enzymolysis temperature on the content of reducing sugar

2.2 輻照對綠茶茶渣還原糖含量的影響

隨著輻照劑量的增大，還原糖含量呈增加趨勢，當采用1200 kGy 輻照處理，茶渣中的還原糖含量急劇增加，增加到98.610 mg/g，未經(jīng)輻照的綠茶茶渣還原糖含量僅為9.611 mg/g，提高926.01%，該結(jié)果與何源祿等[8]研究結(jié)果一致。低劑量的輻照作用主要導致大分子聚合，高劑量的輻照作用會使物質(zhì)結(jié)構(gòu)變得疏松，使大分子降解為小分子物質(zhì)，由此可知高劑量輻照對纖維素有更加明顯的降解作用。輻照劑量對茶渣還原糖含量的影響如圖4所示。

圖4 輻照劑量對還原糖含量的影響Fig.4 Effect of irradiation dose on the content of reducing sugar

2.3 輻照預處理輔助纖維素酶水解對綠茶茶渣還原糖含量的影響

輻照處理能顯著提高茶渣酶解效率。圖5所示，對照樣品在纖維素酶作用60 h 后，其還原糖含量僅為147.47 mg，而經(jīng)不同輻照劑量處理的茶渣還原糖含量顯著提高，較對照分別提高了1.2倍、1.2倍、1.5倍、1.5倍、1.3倍。在200～1200 kGy 劑量范圍內(nèi)，還原糖含量隨劑量增大而增加，經(jīng)800 kGy 輻照的茶渣和經(jīng)1000 kGy 輻照的茶渣還原糖含量都在220 mg 左右，1200 kGy 輻照的茶渣還原糖含量反而較1000 kGy 低，約為194.60 mg。

圖5 輻照-酶解對還原糖含量的影響Fig.5 Effects of irradiation and enzymatic hydrolysis on the content of reducing sugar

輻照預處理能提高茶渣酶解最開始的反應(yīng)速度。52 h 對照組的還原糖含量僅為70.72 mg，而經(jīng)200 kGy、600 kGy、800 kGy、1000 kGy、1200 kGy 輻照后的茶渣還原糖含量分別為131.71 mg、143.86 mg、128.57 mg、209.90 mg和175.71 mg。如圖所示，輻照可以使酶解達到最大效率的時間縮短，800 kGy、1000 kGy 處理的茶渣反應(yīng)58 h 后接近其反應(yīng)60 h 時的水平，而1000 kGy 處理的茶渣則在56 h 時已經(jīng)達到其最大的還原糖生產(chǎn)量。由此可見輻照輔助纖維素酶降解工藝要優(yōu)于單獨輻照處理或者酶解處理工藝，輻照預處理輔助酶解有利于提高纖維素的轉(zhuǎn)化率。

3 討論

以綠茶茶渣纖維素制備還原性糖，由于纖維質(zhì)結(jié)構(gòu)緊密，纖維素酶無法與其接觸充分，酶解效率低且成本高。本試驗采用輻照處理茶渣，使綠茶茶渣的主要組分物質(zhì)發(fā)生了變化，其中一部分纖維素被直接降解為糖，同時改變了綠茶茶渣復雜的纖維素結(jié)構(gòu)，增大了酶解反應(yīng)時的物質(zhì)接觸面積，從而茶渣中水溶性還原糖含量增加。未經(jīng)輻照預處理的對照處理茶渣還原糖含量僅為9.611 mg/g，而經(jīng)1200 kGy 輻照處理的茶渣還原糖含量可以達到98.610 mg/g，提升926.01%，對照的還原糖含量達到最大值147.47 mg 需要60 h，而經(jīng)過最佳輻照劑量1000 kGy 處理的茶渣酶解56 h 就能達到最大還原糖含量。

一方面輻照作為一種便捷高效的清潔能源，應(yīng)用于纖維素材料的處理上，能有效提高轉(zhuǎn)化率，降低轉(zhuǎn)換成本。另一方面輻照處理也會對酶解反應(yīng)起抑制作用。因此，輻照劑量并非越大越理想，試驗結(jié)果也表明經(jīng)800 kGy、1000 kGy 輻照處理的茶渣其反應(yīng)效率要大于1200 kGy 輻照處理的茶渣。同時本研究表明輔助纖維素酶降解茶渣制備水溶性糖的工藝可行，該工藝具有一定的行業(yè)實用價值。