楊子榮，劉 城，丁麗敏，張 孟，于慶功

(大連大學附屬中山醫(yī)院 消化內(nèi)科，遼寧 大連116001)

Dickkopf-3(DKK-3)是具有較高Wnt抑制活性的分泌性糖蛋白Dickkopf (DKK)家族中的一員，在胚胎發(fā)生過程中對細胞命運、增殖和極性等的控制有重要的作用[1]。近來研究表明DKK-3的表達可能參與一些腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，本文通過檢測DKK-3在人結(jié)腸癌組織芯片中的表達，分析結(jié)腸癌間質(zhì)微血管內(nèi)皮細胞和腫瘤細胞中DKK-3表達與其臨床病理因素的關(guān)系，探討其在結(jié)腸癌發(fā)生及侵襲轉(zhuǎn)移中的作用。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

購自桂林泛普生物技術(shù)有限公司的人結(jié)腸癌組織芯片(產(chǎn)品編號：COC1501+COC1502)包括133例結(jié)腸腺癌組織和10例非癌結(jié)腸黏膜組織，雙芯布陣，經(jīng)過公司病理專業(yè)人員檢查證實。在133例結(jié)腸腺癌組織中，女58例，男75例，年齡19-92歲，平均年齡(58.05±14.28) 歲。組織標本經(jīng)10%中性甲醛緩沖液固定24 h，固定于美國Superfrost Plus防脫載玻片上，4℃保存。

1.2 免疫組化染色

羊抗人DKK-3多克隆抗體(AF1118)購自美國R&D公司，工作濃度為1∶50。SP免疫組化染色按SP試劑盒實驗步驟操作。

1.3 結(jié)果判斷

微血管內(nèi)皮細胞染色陽性判斷標準：陽性信號位于細胞間質(zhì)微血管，不論染色強度，微血管染色達90%以上為陽性，微血管染色不足10%為陰性，其余均為中間染色[2]。

腫瘤細胞染色陽性判斷標準：陽性信號位于細胞質(zhì)，根據(jù)陽性細胞百分數(shù)和染色強度對每張切片進行分級：細胞數(shù)計分0分(無)，1分(<10%)，2分(<10%-50%)，3分(<51%-80%)，4分(>80%)；染色強度0分(不著色)，1分(弱)，2分(中)，3分(強)；組織化學染色積分(細胞數(shù)計分和染色強度計分的乘積)：>4分為陽性[3]。

1.4 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 結(jié)腸癌及非癌結(jié)腸黏膜組織中DKK-3的表達

淡黃色至棕黃色顆粒沉淀主要分布于結(jié)腸癌間質(zhì)微血管內(nèi)皮細胞和腫瘤細胞細胞質(zhì)，DKK-3在上述兩者中表達陽性率分別為72.93%(97/133)和41.35%(55/133)。DKK-3在10例非癌結(jié)腸黏膜組織間質(zhì)微血管內(nèi)皮細胞中均不表達，而在正常組織細胞中的8例表達為陽性，見圖1。

2.2 DKK-3的表達與結(jié)腸癌臨床病理特征的關(guān)系

結(jié)腸癌間質(zhì)微血管內(nèi)皮細胞中DKK-3的表達與其分化程度相關(guān)(P<0.05)，而與性別、年齡、TNM分期、浸潤深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)(P>0.05)。結(jié)腸癌腫瘤細胞中DKK-3的表達與TNM分期、浸潤深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05)，而與性別、年齡及分化程度無關(guān)(P>0.05)，見表1。

3 討論

結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)的發(fā)病率在過去的數(shù)十年中增加了2-4倍[4]。CRC的侵襲和轉(zhuǎn)移是影響預后的主要因素之一，同時也是導致CRC患者死亡的重要原因[5]，但是現(xiàn)在對于CRC侵襲轉(zhuǎn)移涉及的分子機制仍不十分清楚。

近來研究顯示[6,7]，Wnt 信號轉(zhuǎn)導通路包括通過Wnt/Ca2+和Wnt/JNK(平面細胞極性)調(diào)控的非經(jīng)典Wnt信號通路和經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路，對細胞的增殖、命運、極性和遷移起到重要的調(diào)節(jié)作用。Wnt拮抗因子主要包括分泌性sFRP 家族(the secreted Frizzled-related family)和DKK家族[8]，這些拮抗因子直接結(jié)合Wnt，并改變它們結(jié)合Wnt受體復合物的能力，DKK家族在理論上特異性抑制β-catenin依賴的經(jīng)典Wnt信號轉(zhuǎn)導。

人DKK相關(guān)基因包括DKK-1、DKK-2、DKK-3和DKK-4以及一種獨特的稱為Soggy(Sgy)的DKK-3相關(guān)蛋白[1]。DKK-3，即REIC(Reduced Expression in Immortalized Cells)，是DKK家族最有分歧的一員，普遍被認為可能是一種分泌性腫瘤抑制基因，因為其在很多腫瘤細胞中表達下調(diào)[8]。有趣的是，DKK-3在人胃腺體深部和結(jié)腸隱窩基底部強表達[9]，而這些部位是胃腸道干細胞所在的位置，因此DKK-3可能是胃腸道組織中一種重要的Wnt信號調(diào)節(jié)因子，對于干細胞池自身穩(wěn)定的維持可能起到一定的作用，DKK-3可能是胃腸道增殖調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的重要組件。

Zhang等[10]通過免疫組織化學SP法檢測了DKK-3 在食管癌中的表達及其與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系，結(jié)果顯示DKK-3在食管鱗癌微血管中的陽性表達率為65.7%(44/67)，其陽性表達與纖維膜浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度和TNM分期的相關(guān)性均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，推測DKK-3可能通過調(diào)控食管癌血管形成而在食管癌進展中發(fā)揮作用。2010年，Muhlmann等[11]通過免疫組織化學的方法檢測了DKK-3在136例人胃癌組織樣本中的表達，結(jié)果分別在94.9%(129/136)的樣本腫瘤血管內(nèi)皮細胞和62.5%(85/136)樣本腫瘤細胞中檢測到了DKK-3的表達；其中DKK-3在30.1%(41例)的樣本腫瘤細胞中過表達，并與pT分期和UICC分期呈顯著相關(guān)(P<0.05)；生存分析顯示DKK-3在腫瘤血管內(nèi)皮細胞中的表達是患者無瘤生存的一個獨立預測指標。2008年，Untergasser等[12]應用免疫組化、Westeron Blotting、定量PCR在35例結(jié)腸癌組織、30例神經(jīng)膠質(zhì)瘤、80例非霍奇金淋巴瘤和30例黑色素瘤中研究發(fā)現(xiàn)DKK-3在這些腫瘤的微血管內(nèi)皮細胞中的表達增加，而且在正常結(jié)腸黏膜組織細胞以及血管中DKK-3只有很弱的陽性表達(P<0.05)，結(jié)果表明DKK-3可能參與

A：DKK-3在非癌結(jié)腸黏膜組織中的陰性表達；B：DKK-3在非癌結(jié)腸黏膜組織中的陽性表達；C：DKK-3在高分化結(jié)腸癌間質(zhì)微血管內(nèi)皮細胞中的陽性表達；D：DKK-3在高分化結(jié)腸癌腫瘤細胞中的陽性表達；E：DKK-3在中分化結(jié)腸癌間質(zhì)微血管內(nèi)皮細胞中的陽性表達；F：DKK-3在中分化結(jié)腸癌腫瘤細胞中的陽性表達；G：DKK-3在低分化結(jié)腸癌間質(zhì)微血管內(nèi)皮細胞中的陽性表達；H：DKK-3在低分化結(jié)腸癌腫瘤細胞中的陽性表達

表1 DKK-3在結(jié)腸癌間質(zhì)微血管內(nèi)皮細胞和腫瘤細胞中的表達與結(jié)腸癌患者臨床病理特征之間的關(guān)系

并促進了腫瘤的血管重塑和形成。同年，Zitt等[2]研究發(fā)現(xiàn)在結(jié)直腸癌及其癌旁組織中，DKK-3陽性樣本的平均微血管計數(shù)明顯高于DKK-3陰性樣本，且DKK-3的表達隨微血管數(shù)增加而增加，而所有微血管在正常黏膜樣本表現(xiàn)為DKK-3陰性，推測DKK-3可能是新生血管形成中的一種前血管原性蛋白，或是結(jié)直腸癌新生血管形成的一種標記。2009年，F(xiàn)ong等[13]分析了DKK-3在胰腺癌中表達的臨床意義及其對體外內(nèi)皮細胞生長的作用，同CD31染色相比較，只在腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)DKK-3陽性血管，DKK-3微血管密度同腫瘤分級呈明顯負相關(guān)；在生存分析中，低DKK-3微血管密度患者的平均存活時間是7個月，而高DKK-3微血管密度患者的平均存活時間是15個月(P=0.0013)；接受吉西他濱治療患者的亞組分析結(jié)果顯示低DKK-3微血管密度組的總生存率同高DKK-3微血管密度組相比明顯降低(P=0.009)；在Cox回歸中，DKK-3顯示出是一個很重要的獨立參數(shù)(P=0.024)；內(nèi)皮細胞中DKK-3過表達同正常內(nèi)皮細胞和腫瘤細胞系相比增強了5-氟尿嘧啶或吉西他濱治療后的生長抑制作用，DKK-3低血管密度同腫瘤進展和臨床預后較差相關(guān)。本實驗通過組織芯片和免疫組化染色技術(shù)，顯示在結(jié)腸癌組織間質(zhì)微血管內(nèi)皮細胞和腫瘤細胞中表達陽性率分別為72.93%和41.35%，這與以往研究結(jié)果基本一致。本次試驗也證實腫瘤細胞中DKK-3的低表達與結(jié)腸癌的TNM分期、浸潤深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，同上述結(jié)果部分一致。DKK-3在結(jié)腸癌間質(zhì)微血管內(nèi)皮細胞和腫瘤細胞中不同的表達模式提示DKK-3可能在腫瘤細胞和微血管內(nèi)皮細胞具有不同的功能。

目前DKK-3在機體內(nèi)影響結(jié)腸癌發(fā)生和發(fā)展的生物學機制仍不十分清楚，還需要我們進一步研究。DKK-3有可能成為一種新的反映結(jié)腸癌生物學行為的客觀指標，有望成為結(jié)腸癌治療的新靶點。