任雨虹(綜述) 劉 澎(審校)

(復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院血液科 上海 200032)

慢性淋巴細(xì)胞白血病(chronic lymphocytic leukemia,CLL)是一種成熟B淋巴細(xì)胞克隆增殖性腫瘤,以淋巴細(xì)胞在外周血、骨髓、脾臟和淋巴結(jié)聚集為特征,在西方國(guó)家的年發(fā)病率為4.2/10萬,80歲以上人群年發(fā)病率甚至超過30/10萬[1]。CLL的治療方案經(jīng)歷了從傳統(tǒng)化療到化學(xué)免疫治療的轉(zhuǎn)變,但CLL的首要治療目標(biāo)仍是獲得更深程度的緩解和更持久的無進(jìn)展生存(progression free survival,PFS)。能達(dá)到更深檢測(cè)程度的微小殘留病灶(minimal residual disease,MRD)監(jiān)測(cè)逐漸成為了療效評(píng)估的重要指標(biāo)。不同于其他白血病,CLL預(yù)后的高度異質(zhì)性和累及多部位的特點(diǎn)使得針對(duì)其MRD的監(jiān)測(cè)比其他白血病更復(fù)雜。本文將對(duì)目前MRD監(jiān)測(cè)在CLL中的應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行介紹。

MRD在CLL中的檢測(cè)方法 作為一項(xiàng)評(píng)估療效深度的監(jiān)測(cè)指標(biāo),理想的MRD檢測(cè)方法需滿足可定量、標(biāo)準(zhǔn)化、便捷性的要求。目前最常見的是流式細(xì)胞學(xué)(flow cytometry,FCM)和PCR兩大類,但只有靈敏度高于10-4才能被納入標(biāo)準(zhǔn)化評(píng)估[2]。

流式細(xì)胞學(xué) FCM檢測(cè)的優(yōu)劣與細(xì)胞計(jì)數(shù)、儀器、解讀方式等密切相關(guān)。研究者試圖通過檢測(cè)CD5/19共表達(dá)和κ/λ限制性表達(dá)的方法在3色FCM上檢測(cè)殘留病灶,然而3色FCM的靈敏度只能達(dá)到10-3,尤其當(dāng)B細(xì)胞計(jì)數(shù)較低時(shí),限制性更顯著[3-4]。Rawstron等[5]通過優(yōu)化4色FCM,不僅在骨髓和外周血CLL細(xì)胞上能檢測(cè)到不同于正常B、T細(xì)胞的異常表達(dá)抗原,同時(shí)還實(shí)現(xiàn)了定量檢測(cè)及高于10-4的檢測(cè)靈敏度[5-6]。但在后續(xù)應(yīng)用中,4色FCM的檢測(cè)靈敏度在低細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)仍難以保證。經(jīng)利妥昔單抗治療的CLL患者亦會(huì)低表達(dá)CD20,與CLL特征性的弱表達(dá)CD20可能難以鑒別,對(duì)操作人員的解讀要求較高。鑒于3色、4色FCM的局限性,目前部分中心采用6色、8色或10色FCM,不僅可以達(dá)到≥10-4的靈敏度,還可以將多種所需抗體同時(shí)放進(jìn)單管中,準(zhǔn)確性和可靠性更高,更適合經(jīng)過多次治療的CLL患者。當(dāng)細(xì)胞總數(shù)為1.8×106時(shí),單管10色FCM的檢測(cè)靈敏度可達(dá)10-5[7]。

基于PCR法的分子學(xué)檢測(cè) PCR檢測(cè)對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)和解讀方式的要求相對(duì)較低,但在引物設(shè)計(jì)上亦有其限制性。采用能結(jié)合到IGHV基因的保守區(qū)域的通用型引物的PCR在MRD檢測(cè)中靈敏度僅能達(dá)到10-2[6]。甚至在部分IGHV變異的CLL克隆上,由于通用型引物無法結(jié)合IGHV,導(dǎo)致克隆擴(kuò)增失敗。目前常用的是采用等位基因特異性寡核苷酸(allele-specific oligonucleotide,ASO)探針的實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè),可以對(duì)異?？寺〉腎GHV基因進(jìn)行測(cè)序,并設(shè)計(jì)IGHVCDR3區(qū)域特異性的ASO探針擴(kuò)增異常IGHV基因,以及定量檢測(cè),其靈敏度可達(dá)10-5程度[8]。所以ASO-PCR法相比FCM有靈敏度更高、更穩(wěn)定可靠的優(yōu)勢(shì),但同時(shí)它的操作更繁瑣,價(jià)格也更高。

另有一種基于PCR法的分子學(xué)檢測(cè)方法——高通量測(cè)序(high-throughput sequencing,HTS),又稱為下一代測(cè)序(next-generation sequencing,NGS)。目前HTS主要包括以下3種:(1)焦磷酸測(cè)序,即應(yīng)用發(fā)光計(jì)量法檢測(cè)當(dāng)單個(gè)核苷酸在微乳液PCR中被添加到DNA模板時(shí)所釋放的焦磷酸產(chǎn)物;(2)多元合成測(cè)序技術(shù),即檢測(cè)DNA小片段在重新合成時(shí)所釋放的光信號(hào);(3)離子半導(dǎo)體測(cè)序,即檢測(cè)DNA聚合時(shí)所釋放的氫離子。通過這些技術(shù)可以檢測(cè)B細(xì)胞抗原受體(B cell receptor,BCR)重排和T細(xì)胞受體(T-cell receptor,TCR)基因[9-10]。在治療前對(duì)患者的克隆型基線水平先進(jìn)行測(cè)序,在治療后用通用型引物對(duì)IGHV全片段進(jìn)行擴(kuò)增,再進(jìn)行HTS檢測(cè),通過特定算法即可在多克隆背景下對(duì)異?？寺∵M(jìn)行定量檢測(cè)[9],HTS的檢測(cè)靈敏度可達(dá)到10-5～10-6,操作方法相較于ASO-PCR也更簡(jiǎn)單[11]。但在應(yīng)用HTS檢測(cè)稀釋標(biāo)本的MRD時(shí),約有10%的標(biāo)本在第一步PCR擴(kuò)增階段即無法識(shí)別其克隆性重排[12],而且HTS測(cè)得的MRD定量?jī)H為近似值[13]。HTS對(duì)操作技術(shù)要求較高,費(fèi)用較貴,目前僅在移植后CLL患者的研究中有所應(yīng)用,尚未廣泛開展。

MRD監(jiān)測(cè)在CLL治療中的應(yīng)用 起初研究者們僅在應(yīng)用阿侖單抗(alemtuzumab)治療CLL的一系列臨床研究中監(jiān)測(cè)MRD,發(fā)現(xiàn)MRD陰性的CLL患者有更長(zhǎng)的無治療生存(treatment free survival)和總生存(overall survival,OS)[15-16]。2008年,國(guó)際CLL工作組(iWCLL)在指南中提出CLL療效評(píng)估中除了外周淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、影像學(xué)檢查、骨髓形態(tài)學(xué)檢查之外,還應(yīng)檢測(cè)MRD,并確定了MRD<10-4為MRD陰性[17]。隨著CLL患者危險(xiǎn)分層的完善和治療方案的進(jìn)步,進(jìn)行MRD監(jiān)測(cè)的意義也在更大范圍內(nèi)得到拓展。

初治CLL患者 B?ttcher等[18]在德國(guó)CLL研究組(German CLL Study Group,GCLLSG)CLL8研究中對(duì)493例隨機(jī)進(jìn)入FC (氟達(dá)拉濱+環(huán)磷酰胺)或FCR (氟達(dá)拉濱+環(huán)磷酰胺+利妥昔單抗)治療組的初治CLL患者分別在初發(fā)分期、3療程后評(píng)估分期、末次療程后1個(gè)月、末次療程后3個(gè)月和此后每3個(gè)月隨訪一次,一共至少在5個(gè)時(shí)間點(diǎn)用4色FCM定量監(jiān)測(cè)外周血MRD;在末次療程后1個(gè)月對(duì)達(dá)到完全緩解(complete remission,CR)的患者取骨髓測(cè)MRD。研究發(fā)現(xiàn)不伴有del(17p)和具有突變IGHV基因的患者測(cè)得的MRD定量值更低。MRD陰性的患者PFS更長(zhǎng),低(<10-4)、中(≥10-4,<10-2)、高(≥10-2)MRD3組的中位PFS分別為68.7、40.5和15.4個(gè)月。MRD是獨(dú)立于患者基線特征和治療方案的預(yù)后影響因素[18]。Kovacs等[19]進(jìn)一步對(duì)CLL8和CLL10兩項(xiàng)研究中的554位患者在末次療程后1個(gè)月和3個(gè)月的外周血MRD進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)MRD陰性CR,MRD陰性部分緩解(partial remission,PR),MRD陽性CR和MRD陰性PR的患者,其中位PFS分別為61、54、35和21個(gè)月,其中MRD陰性CR和MRD陰性PR患者的PFS并無顯著差異。研究中對(duì)351位同步完成骨髓MRD檢測(cè)的患者進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),外周血和骨髓MRD均為陰性的患者的PFS比僅有外周血MRD陰性、骨髓MRD陽性的患者長(zhǎng)[19]。該研究對(duì)MRD陰性PR患者進(jìn)一步分析,發(fā)現(xiàn)治療后仍有淋巴結(jié)腫大的MRD陰性PR患者的PFS比MRD陰性CR患者顯著縮短,但治療后仍有脾大,骨髓形態(tài)學(xué)PR或仍有多灶累及的MRD陰性PR患者的PFS與MRD陰性CR患者并無顯著差異[19]。所以MRD定量監(jiān)測(cè)對(duì)經(jīng)一線治療后獲得CR的患者具有判斷預(yù)后的價(jià)值,但CLL累及多部位的特點(diǎn)使得其對(duì)PR患者的療效評(píng)估仍存在難度。Kwok等[20]對(duì)536位經(jīng)各線治療至少達(dá)到PR的CLL患者在治療結(jié)束時(shí)檢測(cè)骨髓MRD,并進(jìn)行10年隨訪,發(fā)現(xiàn)MRD陰性是PFS和OS的預(yù)后影響因素,獨(dú)立于治療方案和已知的具有預(yù)后意義的遺傳分子學(xué)改變,將其對(duì)CLL療效評(píng)估和預(yù)后意義從僅接受一線治療的患者基礎(chǔ)上進(jìn)一步拓寬。

在探索MRD定量監(jiān)測(cè)對(duì)CLL預(yù)后意義的同時(shí),部分研究亦分析了誘導(dǎo)治療期間的中期評(píng)估中MRD的意義。GCLLSG CLL8研究中493位患者均接受了6周期FC/FCR治療,其中經(jīng)3周期治療后外周血達(dá)到MRD陰性的患者和經(jīng)6周期治療后外周血達(dá)到MRD陰性的患者的PFS并無差異[18]。Strati等[21]對(duì)初治CLL患者應(yīng)用FCR方案治療,分別有17%的患者在3周期后獲得骨髓MRD陰性,43%的患者在6周期后獲得骨髓MRD陰性。前者中有部分患者因治療相關(guān)毒性停止了后續(xù)治療,但這部分僅接受了3周期一線治療的患者的PFS與3周期后達(dá)到骨髓MRD陰性且完成了6周期治療的患者,以及3周期后骨髓MRD陽性但在6周期后達(dá)到骨髓MRD陰性的患者的PFS并無顯著差異[21]。上述研究提示MRD陰性或可成為FC/FCR誘導(dǎo)治療的治療終點(diǎn),但在新藥時(shí)代仍需更多臨床研究協(xié)助驗(yàn)證MRD可替代傳統(tǒng)的疾病進(jìn)展或復(fù)發(fā)點(diǎn),作為臨床試驗(yàn)新的治療終點(diǎn)。

除此之外,多個(gè)研究提出對(duì)經(jīng)一線方案誘導(dǎo)治療后未達(dá)到MRD陰性的患者加用阿侖單抗或利妥昔單抗作為鞏固/維持治療,可使部分CR患者進(jìn)一步獲得MRD陰性,這部分患者的臨床反應(yīng)持續(xù)有效期比MRD陽性的CR患者和MRD陰性但未接受鞏固/維持治療的患者更長(zhǎng)。但與此同時(shí),增加鞏固/維持治療后所帶來的治療風(fēng)險(xiǎn)如感染、骨髓毒性、繼發(fā)腫瘤等發(fā)生率也相應(yīng)增加[22]。由于CLL細(xì)胞原本就可導(dǎo)致正常免疫功能受損,增加感染、自身免疫紊亂和繼發(fā)腫瘤的風(fēng)險(xiǎn),所以如何在規(guī)避治療不良反應(yīng)和追求深度緩解之間尋得平衡仍值得進(jìn)一步研究。在決定是否追加后續(xù)治療時(shí),除MRD之外,同時(shí)需結(jié)合提示預(yù)后不良的遺傳分子學(xué)改變,以及患者年齡、治療耐受性等多因素綜合考量。在評(píng)價(jià)MRD定量監(jiān)測(cè)用于評(píng)價(jià)鞏固/維持治療的意義時(shí),PFS可能不再是最合適的研究終點(diǎn),但MRD對(duì)于后續(xù)治療的獨(dú)立指導(dǎo)作用仍有待商榷。

移植后CLL患者 由于異基因造血干細(xì)胞移植(allogenic stem cell transplantation,allo-SCT)的目的是治愈疾病,其治療深度往往大于普通化學(xué)免疫治療,所以對(duì)CLL移植后患者的疾病監(jiān)測(cè)要求更高。Logan等[10]對(duì)40名高危CLL患者在移植預(yù)處理前(d-12)和移植后1、3、6、9、12、18、24、30、36個(gè)月分別留取外周血的單個(gè)核細(xì)胞標(biāo)本,應(yīng)用IGH ASO-PCR法和IGH-HTS法對(duì)共計(jì)403個(gè)標(biāo)本檢測(cè)MRD以進(jìn)行回顧性分析。其中25名患者的174個(gè)樣本同時(shí)應(yīng)用兩種方法檢測(cè),16個(gè)標(biāo)本在ASO-PCR下為陰性,但在IGH-HTS下為陽性,這16個(gè)標(biāo)本的疾病負(fù)荷大多<10-4,符合IGH-HTS具有更高檢測(cè)深度的預(yù)期。在40名患者中有9名在不到12個(gè)月時(shí)即出現(xiàn)疾病復(fù)發(fā),于是研究者們用IGH-HTS對(duì)其余31名患者在移植后12個(gè)月的MRD進(jìn)行檢測(cè)和分析,發(fā)現(xiàn)其中10名MRD陽性的患者中僅20%仍保持無疾病狀態(tài),而在MRD陰性的患者中,86%的人保持長(zhǎng)期緩解;當(dāng)對(duì)移植后9個(gè)月及更早的標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn),由于受到免疫抑制和植入動(dòng)力學(xué)的影響,MRD定量檢測(cè)十分困難;移植后9個(gè)月及以后的標(biāo)本如檢測(cè)到MRD>10-6則提示有復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。所以MRD可作為判斷接受allo-SCT后CLL患者的預(yù)后指標(biāo)。Logan等[14]還提出MRD倍增時(shí)間的概念,在20名復(fù)發(fā)患者中18名的MRD倍增時(shí)間小于12個(gè)月,進(jìn)一步佐證了移植后12個(gè)月可能是allo-SCT后CLL患者最有意義的監(jiān)測(cè)點(diǎn)。而且MRD值波動(dòng)多出現(xiàn)于allo-SCT后12個(gè)月內(nèi),12個(gè)月后多數(shù)患者已脫離免疫抑制[2],allo-SCT后12個(gè)月MRD陰性患者有更好的無事件生存(event-free survival,EFS)[23]。

移植后12個(gè)月測(cè)得MRD陽性是否可作為預(yù)防復(fù)發(fā)的治療干預(yù)指標(biāo)則仍尚未明確[10]。在GCLLSG CLL3X研究中,對(duì)52 名allo-SCT后CLL患者進(jìn)行移植后MRD監(jiān)測(cè),27名在12個(gè)月時(shí)為MRD陰性的患者中僅2名出現(xiàn)復(fù)發(fā),1名為非復(fù)發(fā)相關(guān)死亡。同時(shí)對(duì)6名MRD陽性的患者進(jìn)行預(yù)防性供體淋巴細(xì)胞輸注,僅3人獲得MRD陰性的CR,尚不足以證明MRD指導(dǎo)的預(yù)防性治療是否有意義。針對(duì)MRD的移植后干預(yù)治療的大樣本研究目前較少,MRD或可協(xié)助判斷CLL移植后患者的預(yù)后,其對(duì)移植后患者治療的指導(dǎo)意義仍待探究。

結(jié)語 在過去的十幾年里,CLL的治療目標(biāo)已發(fā)生了巨大轉(zhuǎn)變,不再僅滿足于傳統(tǒng)意義的CR,更要求達(dá)到深度緩解,尤其是對(duì)可以耐受一線治療的患者。MRD監(jiān)測(cè)在血液惡性腫瘤中早已不陌生,但CLL累及多部位的特點(diǎn)和預(yù)后異質(zhì)性導(dǎo)致臨床分期不平行于MRD,使其應(yīng)用和推廣仍存在困難。目前多色FCM和ASO RQ-PCR是檢測(cè)MRD較為主流的方法,隨著檢測(cè)技術(shù)發(fā)展和檢測(cè)靈敏度提高,將來MRD陰性的標(biāo)準(zhǔn)可能進(jìn)一步降低。由于移植后患者的特殊性,更高靈敏度的MRD檢測(cè)方法如HTS更具應(yīng)用價(jià)值,移植后第12個(gè)月是應(yīng)用MRD監(jiān)測(cè)疾病復(fù)發(fā)的首選時(shí)間點(diǎn),但針對(duì)MRD陽性患者進(jìn)行早期干預(yù)的意義尚未明確。誘導(dǎo)治療中期MRD評(píng)估陰性或可縮短接受一線方案治療的CLL患者治療療程,以減輕治療不良反應(yīng)。對(duì)誘導(dǎo)治療后MRD持續(xù)陽性的CLL患者,需結(jié)合分子遺傳學(xué)異常等指標(biāo)探索合適的鞏固/維持治療方案以達(dá)到深度緩解和不良反應(yīng)之間的平衡,并且隨訪MRD在治療過程中的變化趨勢(shì)。