吳忠坤，趙紫薇，王遠亮，3，*李宗軍，3，*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長沙410128；2.食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點實驗室，湖南長沙410128；3.國家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，湖南長沙410128）

檳榔（Areca catechu L.），棕櫚科熱帶常綠喬木，是一種可食用的干燥成熟種子[1]。形狀橢圓，含有多種營養(yǎng)元素及藥理活性成分，其主要有效成分包括生物堿、酚類、油脂、多種氨基酸及礦物質(zhì)[2]，其中檳榔堿、檳榔多酚等有效成分均可與水任何比例混溶。檳榔生長區(qū)域主要分布在東南亞和南亞地區(qū)，并且我國福建、海南、臺灣等地均有大面積的種植。2017年我國檳榔產(chǎn)業(yè)總產(chǎn)值超過150億，較上年增長25%左右。檳榔具有較高的藥用價值，有殺蟲消積、降氣、行水、截瘧等功效。并且入藥歷史悠久，在中藥中常作為驅(qū)蟲、消積藥物來使用[3]。與此同時，咀嚼檳榔是一種古老的習(xí)俗，在亞、非、歐洲的許多國家及北美地區(qū)都很常見。檳榔被列為第四大最常用的精神活性物質(zhì)，需求量僅次于咖啡因、尼古丁和酒精[4]。其常見主要食用方式分為：鮮檳榔、鮮檳榔+蔞葉、鮮檳榔+蔞葉+煙絲3種。2003年國際癌癥研究中心（International Agency for Research on Cancer，IARC）正式認定檳榔為一級致癌物[5]。至此，檳榔的食用性安全受到廣泛的關(guān)注。與此同時國內(nèi)外學(xué)者對檳榔生物堿的藥理、毒副作用機制等方面做出了大量的研究，主要集中在檳榔生物堿對口腔、生殖細胞毒性、肝臟毒性以及免疫抑制毒性這些方面[6-10]。然而，鮮檳榔整體食用及其食用方式方面的研究較少。本文探究不同鮮檳榔食用方式對小鼠免疫功能的影響，通過3種常見鮮檳榔食用方式的水提物對小鼠進行灌胃飼養(yǎng)，初步的探究其不同食用方式之間的差異，并為鮮檳榔的食用安全性提出參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 檳榔、蔞葉和煙絲等材料的制備

鮮檳榔：海南省萬寧市。檳榔水提物制備：鮮檳榔洗凈晾干后切碎，冷凍干燥36 h。凍干后的檳榔塊用萬能粉碎機粉碎。檳榔粉按質(zhì)量1∶10的比例水提，水提過程中先超聲30 min，后60℃水浴1 h。水浴后5 000 r/min離心10 min取上清液濃縮。

蔞葉：海南省萬寧市。蔞葉水提物制備：選取大小一致的蔞葉洗凈晾干，按一顆鮮檳榔兩片蔞葉比例選取所需蔞葉。60℃恒溫?zé)犸L(fēng)干燥4 h。干燥后的蔞葉用萬能粉碎機粉碎。蔞葉粉按質(zhì)量1∶10的比例水提，水提過程中先超聲30 min，后60℃水浴1 h。水浴后5 000 r/min離心10 min取上清液濃縮。

煙絲：長沙市煙草研究所。煙絲水提物制備：按照鮮檳榔重量的10%選取所需的煙絲，60℃恒溫?zé)犸L(fēng)干燥2 h。干燥后的煙絲用萬能粉碎機粉碎，煙絲按質(zhì)量1∶10的比例水提，水提過程中先超聲30 min，后60℃水浴1 h。水浴后5 000 r/min離心10 min取上清液濃縮。

1.1.2 試驗儀器

一斤搖擺式高速萬能粉碎機（QE-500克）：浙江屹立工貿(mào)有限公司；離心機（LXJ-IIB）：上海安亭科學(xué)儀器廠；電熱恒溫水浴鍋（DZKW-S-8）：北京市永光明醫(yī)學(xué)儀器有限公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱（WGL-125B）：天津市泰斯特儀器有限公司；冷凍干燥儀（FD-IA-50）：北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司。

1.2 實驗動物

KM小鼠：由湖南斯萊克景達試驗動物有限公司提供，小鼠生產(chǎn)證號為SCXK（湘）2013-0004。本次試驗過程中遵循《實驗動物管理條例》進行試驗研究。

1.3 試驗設(shè)計

引進40只健康4周齡的SPF級雄性KM小鼠，置于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院試驗動物房灌胃飼養(yǎng)。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度（22±4）℃、相對濕度：50%～70%、光照時長為12 h，進行為期1周的環(huán)境適應(yīng)飼養(yǎng)，并在期間觀察其綜合情況。環(huán)境適應(yīng)飼養(yǎng)過后隨機將小鼠分為4個組，每組10只。每只體重在（19±2）g之間。各組均采用灌胃給藥，每天定時灌胃1次，相同環(huán)境下飼養(yǎng)4周。4個試驗組分別是：

鮮檳榔組：鮮檳榔水提物給藥量為0.1mL/（10g·d）。相當于70 kg成人每天食用4個鮮檳榔。

蔞葉組：檳榔蔞葉混合水提物給藥量為0.1 mL/（10 g·d）。相當于70 kg成人每天食用4顆鮮檳榔、8片蔞葉。

煙絲組：選取10只體重在（19±2）g的雄性小鼠作為煙絲試驗組，采用灌胃法給藥，檳榔煙絲混合水提物給藥量為0.1 mL/（10 g·d）。相當于70 kg成人每天食用4顆鮮檳榔、8片蔞葉、12 g煙絲。

對照組：純水給藥量為0.1 mL/（10 g·d）。

1.4 結(jié)果測定

1.4.1 小鼠體重

試驗期間，第一次灌胃前稱重并記錄其初始體重，后在每次灌胃前稱重記錄，并觀察記錄存活現(xiàn)狀。

1.4.2 血液指標

灌胃飼養(yǎng)28 d后，禁食12 h，采用眼球摘除法取小鼠血液于EDTA-K2抗凝管中，混勻后12 h內(nèi)送檢。

1.4.3 臟器指數(shù)

灌胃飼養(yǎng)28 d后，禁食12 h，先稱量其體重，后脫頸處死，取其肝臟和脾臟。取出的肝臟和脾臟用試紙吸取表面水分后稱重記錄。

1.4.4 免疫球蛋白以及細胞因子

灌胃飼養(yǎng)28 d后，禁食12 h，采用眼球摘除法取小鼠血液于滅菌離心管中，靜止后送檢。

1.5 數(shù)據(jù)處理

本次試驗使用SSPS21.0軟件進行差異統(tǒng)計分析，采用Duncan檢驗方法檢驗其顯著性，結(jié)果用平均值±標準差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 對小鼠體重的影響

3種不同食用方式對小鼠體重的影響見表1。

表1 3種不同食用方式對小鼠體重的影響Table 1 Effect of three different eating modes on body weight of mice

由表1可知，在灌胃飼養(yǎng)一周后，可以明顯的看出鮮檳榔組的小鼠體重是顯著低于對照組的，在灌胃后的第二周，鮮檳榔組小鼠的體重與蔞葉組和煙絲組也呈現(xiàn)出顯著性的降低（p＜0.05），與對照組差異更是明顯（p＜0.01或p＜0.05）。后兩周雖在增長但其趨勢不明顯，仍然與對照顯著性降低。蔞葉組的小鼠在灌胃飼養(yǎng)一周后也明顯小于對照組的小鼠體重，但其在第三周與對照小鼠體重?zé)o顯著差異（p＞0.05）。對煙絲組來說，灌胃一周后其體重與對照組小鼠體重也是顯著性降低（p＜0.05）。第四周仍然顯著低于對照組小鼠體重。

2.2 對小鼠肝臟指數(shù)和脾臟指數(shù)的影響

3種不同食用方式對小鼠臟器指數(shù)的影響見表2。由表2可知，煙絲組和鮮檳榔組的肝臟臟器指數(shù)與蔞葉組的臟器指數(shù)有著明顯的增高（p＜0.05）。然而對脾臟來說，只有鮮檳榔組與對照組相比顯著增高（p＜0.05），其他各組間均無差異。

2.3 對小鼠血液指標的影響

3種不同食用方式對小鼠血液指標的影響見表3。

表2 3種不同食用方式對小鼠臟器指數(shù)的影響Table 2 Effects of three different eating methods on organ index in mice

表3 3種不同食用方式對小鼠血液指標的影響Table 3 Effects of three different eating methods on blood parameters in mice

如表3所示，3種不同的食用方式對小鼠紅細胞計數(shù)（red blood cell，RBC）并無明顯的影響。對于白細胞計數(shù)（white blood cell，WBC）而言，其中煙絲組的白細胞計數(shù)（WBC）是要明顯高于鮮檳榔組和對照組的（p＜0.05），相對上升了80.82%。蔞葉組的白細胞計數(shù)（WBC）也是明顯高于這兩組（p＜0.05），相對上升了32.05%。對鮮檳榔組來說，其白細胞計數(shù)（WBC）與對照組并無顯著性差異。

2.4 對小鼠免疫球蛋白以及細胞因子的影響

3種不同食用方式對小鼠免疫球蛋白的影響見圖1～圖 3。

圖1 3種不同食用方式的小鼠血清IgA的含量Fig.1 Serum IgA levels in mice with three different modes of consumption

如圖1、2所示：鮮檳榔的3種不同食用方式對小鼠血清免疫球蛋白A（immune globulin A，IgA）和免疫球蛋白G（immune globulin G，IgG）的含量均呈顯著性下降（p＜0.05）。由圖3可知：煙絲組小鼠血清免疫球蛋白（immune globulin M，IgM）與對照組相比呈顯著性升高（p＜0.05）。其余各組見均無明顯差異。

圖2 3種不同食用方式的小鼠血清IgG的含量Fig.2 Serum IgG levels in mice with three different modes of consumption

圖3 3種不同食用方式的小鼠血清IgM的含量Fig.3 Serum IgM levels in mice with three different modes of consumption

3種不同食用方式對小鼠細胞因子的影響見表4。

表4 3種不同食用方式對小鼠細胞因子的影響Table 4 Effect of three different eating modes on cytokines in mice

從表4可知，對于小鼠血清腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor，TNF-α）的含量來說，只有煙絲組與對照組相比呈顯著性上升（p＜0.05），其他組分之間均無明顯差異。對于小鼠血清白介素1（interleukin-1，IL-1）的含量來說，蔞葉組和煙絲組與對照組相比呈極顯著差異（p＜0.01），鮮檳榔組與蔞葉組和煙絲組之間呈極顯著下降（p＜0.01），同時鮮檳榔組與對照組相比則是呈極顯著上升（p＜0.01）。

3 討論

3.1 不同食用方式對小鼠體重的影響

本次試驗結(jié)果表明：鮮檳榔的3種不同食用方式對小鼠體重均有著不同程度的影響，經(jīng)過一周灌胃飼養(yǎng)后所有試驗組分的小鼠體重與對照組小鼠體重相比均呈現(xiàn)顯著性下降。在灌胃飼養(yǎng)的過程中，灌胃15 min至20 min后3個試驗組的小鼠均有不同程度的腹瀉現(xiàn)象，Chuan bao LI等[11]研究表明，檳榔中的檳榔堿對離體大鼠遠端結(jié)腸平滑肌肌條具有收縮作用，并且其促收縮作用隨著檳榔堿劑量的增加而增強，從而會造成不同程度的腹瀉，因此所有實驗組的小鼠在長期腹瀉作用下，造成其體重與對照組相比較呈顯著性下降。劉書偉等[12]指出鮮檳榔和蔞葉同時食用時可以抑制小鼠體重的增加，但其可以減弱對小鼠生理指標的毒性作用。故蔞葉組小鼠體重相對于鮮檳榔組來說，其對小鼠體重的抑制作用相對減弱。從本次試驗結(jié)果來看煙絲組和蔞葉組對小鼠體重抑制作用大相徑庭，然而煙絲對腸道的具體影響尚不明確，其對小鼠體重是否也存在抑制作用有待進一步的研究。

3.2 對小鼠臟器指數(shù)的影響

肝臟作為身體中最大的解毒器官，其在排毒代謝中有著重要的地位。本次試驗中只有蔞葉組肝臟臟器指數(shù)與對照組之間存在顯著性差異，其他各組均無明顯差異。孫瑩等[13]試驗結(jié)果表明檳榔堿飲水法喂養(yǎng)小鼠會造成小鼠肝臟組織損傷，且在一定時間內(nèi)，隨時間變化損傷會加重，造成小鼠肝臟組織出血、細胞腫脹、肝細胞核分裂的現(xiàn)象逐漸加重。但其對肝臟臟器指數(shù)的影響并不明確，本次試驗結(jié)果也僅僅表明蔞葉組小鼠肝臟臟器指數(shù)出現(xiàn)顯著性下降，其他兩組并無明顯差異。

脾臟是重要的免疫器官，其臟器指數(shù)可以反映其免疫器官的發(fā)育和免疫細胞的功能狀況，本次試驗中，鮮檳榔組對小鼠脾臟臟器指數(shù)顯著升高，其他各組均無明顯差異。但本次試驗結(jié)果卻與譚樹華等[14]試驗結(jié)果相反，其試驗結(jié)果表明，檳榔水提物經(jīng)過90 d自由食用后的小鼠脾臟臟器指數(shù)與對照組相比呈顯著性下降。故檳榔對小鼠脾臟臟器指數(shù)的影響有待進一步的研究證實。

3.3 不同食用方式對小鼠紅、白細胞計數(shù)的影響

紅細胞和白細胞通常在骨髓中產(chǎn)生，最終由多能造血干細胞產(chǎn)生。白細胞包括粒細胞（中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞）、單核細胞和淋巴細胞。紅細胞在輸送氧氣方面起主要作用，在調(diào)節(jié)局部血流和二氧化碳輸送方面起次要作用。中性粒細胞和單核細胞是吞噬細胞，是先天和適應(yīng)性免疫反應(yīng)的一部分[15]。本次試驗結(jié)果表明，鮮檳榔3種不同食用方式對小鼠紅細胞計數(shù)（RBC）并無明顯影響。但是其對白細胞計數(shù)（WBC）卻有著不同程度的影響，煙絲組和蔞葉組小鼠的白細胞計數(shù)（WBC）與對照組和鮮檳榔組小鼠的白細胞計數(shù)（WBC）呈顯著性上升。白細胞計數(shù)的顯著上升說明了，蔞葉組和煙絲組的混合提取液對小鼠體液免疫有不同程度的影響，白細胞計數(shù)的上升也說明了，這兩組小鼠體內(nèi)可能存在一定的炎癥，具體是哪個部位的炎癥目前尚不明確。

3.4 不同食用方式對小鼠細胞因子和免疫球蛋白的影響

3.4.1 對小鼠細胞因子的影響

腫瘤壞死因子（TNF-α）是一種能夠直接殺傷腫瘤細胞而對正常細胞無明顯毒性的細胞因子，在人體免疫中有著無可厚非的作用。白介素1（IL-1）是一種細胞因子，屬于白細胞介素，是指在白細胞或免疫細胞間相互作用的淋巴因子，在傳遞信息，介導(dǎo)T、B細胞活化、增殖與分化以及在炎癥反應(yīng)中起重要作用。本次試驗結(jié)果表明：煙絲組小鼠血清中癌癥壞死因子（TNF-α）的含量與對照組相比較有顯著性上升，其余各組之間均無差異。然而對于白介素1（IL-1）的含量而言，所有試驗組分的白介素1（IL-1）的含量與對照組相比較均呈現(xiàn)顯著性上升，與此同時煙絲組和蔞葉組的白介素1（IL-1）的含量與鮮檳榔組相比較也呈顯著性升高。Sindy hu等[16]研究顯示，在長期咀嚼檳榔的男性與健康男性在癌癥壞死因子（TNF-α）和白介素1（IL-1）的含量之間存在著顯著差異，健康男性這兩個指標的含量均要顯著低于長期咀嚼檳榔的男性。李霞等[17]試驗結(jié)果指出：檳榔提取物干預(yù)角朊細胞12 h后，TNF-α的量開始增加，并以劑量依賴關(guān)系增加角朊細胞產(chǎn)生TNF-α的量，從而誘發(fā)口腔黏膜下纖維性變。這也很好的說明了檳榔確實對小鼠這兩種細胞因子的含量存在明顯的影響。然而胡怡秀等[18]的試驗結(jié)果卻指出檳榔對細胞免疫無明顯影響，其結(jié)果與本次試驗結(jié)果截然相反，造成其結(jié)果截然不同的原因可能是因為其當初設(shè)計的劑量并未能使檳榔對細胞免疫產(chǎn)生顯著影響。

3.4.2 對小鼠免疫球蛋白 A（IgA）、G（IgG）、M（IgM）的影響

IgG和IgA參與多種免疫功能和過程，包括對微生物感染的保護、體液免疫、免疫穩(wěn)態(tài)和癌癥監(jiān)測[19-20]。本次試驗結(jié)果表明：鮮檳榔的3種不同食用方式對小鼠血清免疫球蛋白A（IgA）和免疫球蛋白G（IgG）的含量均呈顯著性下降。高華北等[21]報道指出檳榔加工者在檳榔加工過程中由于接觸檳榔其免疫功能受到一定程度的損害，檳榔工作者組與正常人組免疫球蛋白A（IgA）和免疫球蛋白G（IgG）的含量呈顯著性下降，并且檳榔加工者免疫功能隨環(huán)境變差而降低，同時也隨著工齡增長而減低。張志軍等[22]研究表明，小鼠血清免疫球蛋白A（IgA）和免疫球蛋白G（IgG）的含量與茯苓多糖劑量呈正相關(guān)，其研究指出小鼠血清免疫球蛋白A（IgA）和免疫球蛋白G（IgG）的含量增高具有一定的免疫增強的效果。熊政委等[23]的研究結(jié)果表明，菊糖能夠刺激酸奶中乳酸菌的增加。與普通酸奶相比，菊糖酸奶能夠更好地提高小鼠免疫功能，經(jīng)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)IgG、IgA與酸奶中乳酸菌的含量顯著相關(guān)。這也進一步印證了小鼠血清免疫球蛋白A（IgA）和免疫球蛋白G（IgG）的含量增高與小鼠免疫功能增強存在著必然聯(lián)系。本次試驗中小鼠血清免疫球蛋白A（IgA）和免疫球蛋白G（IgG）的含量與對照組相比均呈顯著性下降，這3種不同食用方式均對小鼠免疫功能呈負面影響。

免疫球蛋白M（IgM）是所有脊椎動物物種中唯一存在的一類抗體，占血清免疫球蛋白總量的5%～10%[24]。王素英[25]、鄭敏華等[26]試驗結(jié)果表明，免疫球蛋白A（I-gA）和免疫球蛋白G（IgG）的含量顯著性降低，然而免疫球蛋白M（IgM）的含量顯著性上升，均出現(xiàn)在免疫功能低下與功能紊亂的情況中，故此說明了可以用免疫球蛋白含量變化為標準來評價其對小鼠免疫功能的影響。本次試驗結(jié)果顯示，煙絲組小鼠血清免疫球蛋白M（IgM）與對照組相比呈顯著性升高（p＜0.05）。煙絲組小鼠血清免疫球蛋白A（IgA）和免疫球蛋白G（IgG）的含量均呈顯著性下降。

4 結(jié)論

鮮檳榔的3種不同食用方式對小鼠體重增長均有一定的抑制性，其中鮮檳榔單獨食用對其抑制作用明顯。對于白細胞計數(shù)（WBC）而言，煙絲組和蔞葉組這兩種食用方式可以明顯的增加小鼠血清白細胞計數(shù)（WBC），而鮮檳榔單獨食用則不會增加小鼠血清白細胞計數(shù)（WBC）。對于細胞因子和免疫球蛋白而言，3種不同食用方式對其存在著不同程度的影響，其中煙絲組的食用方式會明顯增加小鼠血清癌癥壞死因子（TNF-α）、白介素 1（IL-1）以及免疫球蛋白 M（IgM）的含量，然而蔞葉組的食用方式則只會增加小鼠血清白介素1（IL-1）的含量，與此同時鮮檳榔單獨食用也會增加小鼠血清白介素1（IL-1）的含量，但是鮮檳榔組的白介素1（IL-1）的含量還是要顯著低于煙絲組和蔞葉組。綜合以上各種結(jié)果而言，煙絲組的食用方式對降低小鼠免疫功能最為明顯，其次就是蔞葉組的食用方式，相對影響較小就是鮮檳榔組的食用方式。為此本次試驗只能為這3種不同食用方式對小鼠免疫功能損害程度提供最基礎(chǔ)的建議，如需更詳細的結(jié)果論證，還有待進一步的研究.