李 爽鄒建華葉曉鷗張光霽陳 喆

多發(fā)性骨髓瘤（Multiple myeloma，MM）是一種常見(jiàn)的血液系統(tǒng)漿細(xì)胞惡性腫瘤，以漿細(xì)胞異常增生伴有單克隆免疫球蛋白或者輕鏈蛋白過(guò)度增生為特征。MM常以骨痛為主要臨床表現(xiàn)，屬中醫(yī)“骨痹”、“虛勞”、“骨蝕”等范疇。近年來(lái)由于MM化療耐藥，患者多數(shù)因耐藥復(fù)發(fā)而死亡[1-2]。三氧化二砷（Arsenictrioxide，As2O3）為中藥砒霜的有效成分，具有蝕瘡、去腐、殺蟲(chóng)、劫痰定喘、劫瘧功效。我國(guó)學(xué)者首先發(fā)現(xiàn)As2O3治療急性早幼粒細(xì)胞性白血?。╝cute promyelocytic leukemia，APL）效果顯著，并闡明其主要作用機(jī)制是通過(guò)促進(jìn)PML-RAR融合蛋白的降解[3-4]。研究表明，無(wú)機(jī)砷（As2O3）在體內(nèi)通過(guò)肝臟甲基轉(zhuǎn)移酶作用下生成單甲基亞砷酸（monomethylarsenous acid，MMAⅢ）、二甲基亞砷酸（dimethylarsenous acid，DMAⅢ）等活性代謝產(chǎn)物從而發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)[5-6]。丹參具有活血化瘀、涼血消癰作用，主治癥瘕積聚、瘡瘍腫痛，為臨床抗腫瘤的常用中藥。隱丹參酮（Cryptotanshinone，CPT）是丹參的有效活性成分，具有較強(qiáng)的抗腫瘤作用。體外研究表明，CPT能明顯誘導(dǎo)肝癌、肺癌、乳腺癌等多種腫瘤細(xì)胞凋亡[7]。本研究觀察隱丹參酮聯(lián)合MMA III協(xié)同抗多發(fā)性骨髓瘤U266細(xì)胞的作用機(jī)制，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材 料 多發(fā)性骨髓瘤U266細(xì)胞和單甲基砷酸（MMAV）由浙江大學(xué)藥學(xué)院那仁滿都拉教授饋贈(zèng)。隱丹參酮（CPT）分子式C19H20O3，相對(duì)分子質(zhì)量296.35，購(gòu)置于Selleck（中國(guó)上海藍(lán)木化工有限公司）（批次：S228502）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 多發(fā)性骨髓瘤U266細(xì)胞用含10%gibco胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

1.3 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力 常規(guī)培養(yǎng)多發(fā)性骨髓瘤U266細(xì)胞。按隱丹參酮單藥組、MMAIII單藥組、聯(lián)合組分別加藥處理。隱丹參酮組加入不同濃度的隱丹參酮（0、5、10、15、30、50μM）、MMAIII組加入不同濃度的單甲基亞砷酸（0、0.5、1、2、5、10μM），聯(lián)合組加入濃度為15μM的隱丹參酮和1μM的單甲基亞砷酸。加入CCK-8并在培養(yǎng)箱中孵育后，檢測(cè)吸光度值(OD值)，并計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.4 PI/Annexin-V流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 隱丹參酮單藥組（15μM）、MMAIII單藥組（1μM）和聯(lián)合組分別處理細(xì)胞后，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中孵育24h。收集細(xì)胞，AnnexinⅤ-FITC和PI染料處理并孵育后流式細(xì)胞儀FITC-PI模式下檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.5 Western Blot檢測(cè)PARP凋亡蛋白 研究共分為隱丹參酮單藥組（15μM）、MMAIII單藥組（1μM）、聯(lián)合組。十二烷基磺酸鈉（SDS）-聚丙烯酰胺凝膠后進(jìn)行蛋白印跡（Western Blot）檢測(cè)。特異性一次抗體為抗 Parp、Cleaved-parp、Cleaved-Caspase3（分別 1:1000稀釋）；特異性二次抗體為HRP標(biāo)記的抗兔或抗小鼠二次抗體。QuantityOne軟件進(jìn)行量化分析蛋白表達(dá)水平，β-actin蛋白水平作為內(nèi)參。

1.6 酸性鞘磷脂酶活性測(cè)定 凍融法裂解細(xì)胞，應(yīng)用BCA法測(cè)定蛋白濃度，用1mMPMSF稀釋樣品。每孔加入20μL被PMSF稀釋的含20μg蛋白的樣品液。向96孔板中加入樣品液每孔20μL含20μg蛋白，每組兩復(fù)孔。每孔加入30μL底物緩沖液K-3203水平搖床混合5min后每孔加入50μL稀釋好的酸性鞘磷脂酶底物（酸性鞘磷脂酶底物k-3202：底物緩沖液k-3203=1：40）混合均勻后水平恒溫?fù)u床37℃孵育3h。在室溫下每孔加入50μL終止緩沖液k-3204避光室溫水平搖床孵育10min，多功能酶標(biāo)儀激發(fā)波長(zhǎng)360nm發(fā)射波長(zhǎng)460nm下檢測(cè)讀板，軟件Prism 6.0繪制曲線。

1.7 免疫熒光檢測(cè)神經(jīng)酰胺生成與聚集情況 隱丹參酮單藥組、MMAIII單藥組、聯(lián)合應(yīng)用組分別加藥處理，0、1、2、4、8h 后收集細(xì)胞。用細(xì)胞涂片離心機(jī)（1500rpm，2min）將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到細(xì)胞爬片上晾干。干燥后的細(xì)胞爬片放入4%多聚甲醛固定15min，再用PBS洗3次，5min/次動(dòng)作輕柔避免細(xì)胞從爬片上脫落。封閉液（含5%BSA的PBS溶液）封閉1h。一抗神經(jīng)酰胺（ceramide，1：100稀釋）4℃過(guò)夜。再用 PBS洗3次，5min/次。室溫避光孵育二抗1h。再用PBS避12光洗3次，5min/次。在暗室中取出細(xì)胞爬片濾紙吸干多余的水分，將載玻片上滴加約10μL的不含DAPI的封片劑（Southern Biotech），將含有細(xì)胞側(cè)的玻片輕輕覆蓋在封片劑上，避免出現(xiàn)氣泡。熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.8 免疫熒光檢測(cè)脂筏聚集情況 常規(guī)培養(yǎng)人多發(fā)性骨髓 U266細(xì)胞，接種于 24孔板中（4×104個(gè)/孔）待細(xì)胞生長(zhǎng)至50～60%融合率后按空白對(duì)照組，聯(lián)合應(yīng)用組，F(xiàn)ilipin組（filipin預(yù)處理2h后再加入隱丹參酮15μM和單甲基亞砷酸1μM）分別加藥處理3h后收集細(xì)胞PBS洗2遍后。用細(xì)胞涂片離心機(jī)（1500rpm，2min）將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到細(xì)胞爬片上晾干。干燥后的細(xì)胞爬片放入4%多聚甲醛固定15min，再用PBS洗3次，5min/次動(dòng)作輕柔避免細(xì)胞從爬片上脫落。封閉液（含5%BSA的PBS溶液）封閉1h。脂筏特異性熒光標(biāo)記物霍亂毒素B（choleratoxinB，CTB）：37℃避光孵育1h，再用PBS避光洗3次，5min/次。在暗室中取出細(xì)胞爬片濾紙吸干多余的水分，將載玻片上滴加約10μL的含DAPI的封片劑（Southern Biotech），將含有細(xì)胞側(cè)的玻片輕輕覆蓋在封片劑上，避免出現(xiàn)氣泡。激光共聚焦微鏡下觀察并拍照。

2 結(jié)果

2.1 單甲基亞砷酸聯(lián)合隱丹參酮協(xié)同應(yīng)用顯著抑制多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞增殖 隱丹參酮濃度為15μM時(shí)細(xì)胞存活率為 （80.9±5.4）%（24h）、（60.0±8.4）%（48h），單甲基亞砷酸濃度為1μM時(shí)細(xì)胞存活率為（82.5±5.8）%（24h）、（67.7+9.7）%（48h），隱丹參酮（15μM）聯(lián)合單甲基亞砷酸（1μM）作用于多發(fā)性骨髓瘤U266細(xì)胞24h、48h后細(xì)胞存活率為（29.1±7.0）%（24h）、（18.0±2.7）%（48h）。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隱丹參酮、單甲基亞砷酸對(duì)多發(fā)性骨髓瘤的增殖抑制作用呈濃度及時(shí)間依賴性，且隱丹參酮（15μM）及單甲基亞砷酸（1μM）聯(lián)合作用U266具有顯著的協(xié)同效應(yīng)，其對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用明顯優(yōu)于單獨(dú)應(yīng)用（P＜0.01）（見(jiàn)插頁(yè)圖 1）。

圖1 隱丹參酮單藥組、單甲基亞砷酸單藥組及聯(lián)合用藥組對(duì)人多發(fā)性骨髓瘤U266細(xì)胞增殖抑制作用

2.2 單甲基亞砷酸聯(lián)合隱丹參酮協(xié)同作用顯著促進(jìn)多發(fā)性骨髓瘤U266細(xì)胞凋亡發(fā)生 單甲基亞砷酸單藥組（MMAIII，1μM），隱丹參酮單藥組（CPT，5μM），聯(lián)合用藥組（CPT15μM+MMAIII1μM）及空白對(duì)照組分別作用于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的多發(fā)性骨髓瘤U266細(xì)胞24h，經(jīng)AnnexinV-FITC/PI染色后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果顯示，聯(lián)合用藥組細(xì)胞凋亡率為（41.7±4.4）%、單甲基亞砷酸組為（10.6±4.0）%、隱丹參酮組為（10.5±3.0）%。上述結(jié)果顯示聯(lián)合用藥組較單甲基亞砷酸單藥組、隱丹參酮單藥組能顯著促進(jìn)多發(fā)性骨髓瘤U266細(xì)胞發(fā)生凋亡（P＜0.01）（見(jiàn)插頁(yè)圖 2）。

圖2 隱丹參酮聯(lián)合單甲基亞砷酸協(xié)同作用顯著誘導(dǎo)U266細(xì)胞凋亡發(fā)生

2.3 單甲基亞砷酸聯(lián)合隱丹參酮協(xié)同作用能夠活化多發(fā)性骨髓瘤U266細(xì)胞凋亡標(biāo)記蛋白 單甲基亞砷酸單藥組（MMAIII，1μM），隱丹參酮單藥組（CPT，15μM），聯(lián)合用藥組（CPT15μM+MMAIII1μM）及空白對(duì)照組分別作用于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的多發(fā)性骨髓瘤U266細(xì)胞24h后，收集細(xì)胞提取細(xì)胞總蛋白Western Blot法檢測(cè)PARP凋亡蛋白活化情況，結(jié)果顯示，聯(lián)合作用組凋亡蛋白PARP剪切活化水平較單甲基亞砷酸單藥組及隱丹參酮單藥組有顯著升高（見(jiàn)插頁(yè)圖3）。上述結(jié)果說(shuō)明單甲基亞砷酸聯(lián)合隱丹參酮通過(guò)活化凋亡標(biāo)記蛋白進(jìn)而誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤U266細(xì)胞凋亡發(fā)生。

圖3 隱丹參酮聯(lián)合單甲基亞砷酸協(xié)同作用促進(jìn)U266細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白剪切活化

2.4 單甲基亞砷酸聯(lián)合隱丹參酮協(xié)同作用促進(jìn)多發(fā)性骨髓瘤U266細(xì)胞神經(jīng)酰胺的生成 單甲基亞砷酸單藥組（MMAIII，1μM），隱丹參酮單藥組（CPT，15μM），聯(lián)合用藥組（CPT15μM+MMAIII1μM）及空白對(duì)照組分別作用于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的多發(fā)性骨髓瘤U266細(xì)胞。收集細(xì)胞處理樣本后，激光共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞膜上神經(jīng)酰胺生成聚集情況。結(jié)果顯示，上述藥物作用2h，單甲基亞砷酸及隱丹參酮單獨(dú)作用組神經(jīng)酰胺熒光亮度與對(duì)照組無(wú)明顯差別，聯(lián)合用藥組熒光亮度則明顯增強(qiáng)（見(jiàn)插頁(yè)圖4），上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明藥物聯(lián)合作用較單獨(dú)作用顯著促進(jìn)人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞神經(jīng)酰胺的生成。

圖4 隱丹參酮聯(lián)合單甲基亞砷酸協(xié)同作用促進(jìn)U266細(xì)胞膜上神經(jīng)酰胺生成

2.5 單甲基亞砷酸聯(lián)合隱丹參酮協(xié)同作用顯著增加多發(fā)性骨髓瘤U266細(xì)胞的酸性鞘磷脂酶活性 單甲基亞砷酸單藥組（MMAIII，1μM），隱丹參酮單藥組（CPT，15μM），聯(lián)合用藥組（CPT15μM+MMAIII1μM）及空白對(duì)照組分別作用于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的多發(fā)性骨髓瘤U266細(xì)胞。收集細(xì)胞處理樣本后，檢測(cè)酸性鞘磷脂酶活性。結(jié)果顯示，聯(lián)合用藥1h，能顯著激活酸性鞘磷脂酶活性（見(jiàn)插頁(yè)圖5）。上述結(jié)果說(shuō)明單甲基亞砷酸聯(lián)合隱丹參酮聯(lián)合用藥能夠激活多發(fā)性骨髓瘤U266細(xì)胞的酸性鞘磷脂酶活性，進(jìn)而促進(jìn)神經(jīng)酰胺的生成。

圖5 隱丹參酮聯(lián)合單甲基亞砷酸協(xié)同作用活化U266細(xì)胞酸性鞘磷脂酶

2.6 脂筏抑制劑Filipin能夠干預(yù)單甲基亞砷酸聯(lián)合隱丹參酮誘導(dǎo)的多發(fā)性骨髓瘤U266細(xì)胞凋亡標(biāo)記蛋白的剪切活化 空白對(duì)照組，聯(lián)合用藥組（CPT15μM+MMAIII1μM）及 Filipin組（脂筏抑制劑Filipin1μg/mL預(yù)處理 2h后再加入 15μMCPT和1μMMMAIII）分別作用于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的多發(fā)性骨髓瘤U266細(xì)胞24h后，收集細(xì)胞提取細(xì)胞總蛋白Western Blot法檢測(cè) cleaved-Parp，cleaved-Caspase3凋亡蛋白活化情況，結(jié)果顯示，脂筏抑制劑Filipin能夠抑制凋亡蛋白cleaved-Parp，cleaved-Caspase3活化水平（見(jiàn)插頁(yè)圖6）。

圖6 脂筏抑制劑Filipin干預(yù)隱丹參酮聯(lián)合單甲基亞砷酸誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤U266細(xì)胞凋亡的作用效應(yīng)

2.7 脂筏抑制劑Filipin能夠干預(yù)單甲基亞砷酸聯(lián)合隱丹參酮引起的脂筏聚集 空白對(duì)照組，聯(lián)合用藥組（CPT15μM+MMAIII1μM）及 Filipin組（脂筏抑制劑Filipin1μg/mL預(yù)處理2h后再加入 15μMCPT和1μMMMAIII）分別作用于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的多發(fā)性骨髓瘤U266細(xì)胞3h后，收集處理樣本，激光共聚焦顯微鏡觀察。結(jié)果顯示，聯(lián)合用藥后多發(fā)性骨髓瘤U266細(xì)胞膜上熒光強(qiáng)度增加，加入Filipin后熒光強(qiáng)度較聯(lián)合用藥減少。上述結(jié)果說(shuō)明脂筏抑制劑Filipin能夠抑制聯(lián)合用藥引起的脂筏在細(xì)胞膜上的聚集（見(jiàn)插頁(yè)圖7）。

圖7 脂筏抑制劑Filipin能夠干預(yù)單甲基亞砷酸聯(lián)合隱丹參酮引起的脂筏聚集

3 討論

已有文獻(xiàn)報(bào)道，As2O3可以抑制多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)其凋亡發(fā)生，研究結(jié)果顯示，As2O3引起MM細(xì)胞線粒體膜電位發(fā)生變化，增大線粒體內(nèi)膜通透性促進(jìn)細(xì)胞色素C的釋放激活Caspase家族蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生[8-9]。MMAIII是中藥砒霜As2O3在體內(nèi)的活性代謝產(chǎn)物，其生物學(xué)活性遠(yuǎn)強(qiáng)于后者。As2O3進(jìn)入人體后迅速在肝臟砷甲基轉(zhuǎn)移酶的作用下轉(zhuǎn)化為有機(jī)形態(tài)的活性代謝產(chǎn)物單甲基亞砷酸[10]。Wang等[11]發(fā)現(xiàn)MMAIII能夠促進(jìn)線粒體細(xì)胞色素C的釋放誘導(dǎo)小鼠肝細(xì)胞凋亡發(fā)生。Chen等[12]報(bào)道，有機(jī)活性代謝產(chǎn)物MMAIII抗白血病和淋巴瘤細(xì)胞活性明顯強(qiáng)于無(wú)機(jī)形態(tài)的As2O3，且對(duì)正常骨髓組織無(wú)毒副作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，隱丹參酮（CPT）聯(lián)合As2O3協(xié)同作用于多發(fā)性骨髓瘤U266細(xì)胞較單藥作用具有更加顯著的促凋亡效應(yīng)[13]，在此基礎(chǔ)上本課題組進(jìn)一步探究As2O3活性代謝產(chǎn)物單甲基亞砷酸聯(lián)合隱丹參酮的協(xié)同作用效果。

神經(jīng)酰胺是重要的生物活性鞘脂類，作為第二信使廣泛參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[14-15]，在促進(jìn)和調(diào)節(jié)許多包括細(xì)胞凋亡、分化、衰老等細(xì)胞過(guò)程中扮演著重要的角色[16-19]。有研究表明，這種調(diào)節(jié)作用與細(xì)胞膜上的神經(jīng)酰胺，尤其與脂筏密切相關(guān)[20]。脂筏是一種筏狀的膜結(jié)構(gòu)域，由鞘磷脂及膽固醇聚集形成。膽固醇填充在鞘磷脂雙層中的疏水空間內(nèi)形成這種更緊湊的微區(qū)膜結(jié)構(gòu)[21]。研究證實(shí)，脂筏在細(xì)胞信號(hào)跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮著重要作用。大量受體分子或刺激分子可以引起酸性鞘磷脂酶（ASMase）的激活導(dǎo)致神經(jīng)酰胺的釋放，促使細(xì)胞膜上小的無(wú)活性的脂筏逐漸形成大的有活性的富含神經(jīng)酰胺的平臺(tái)結(jié)構(gòu)，使得受體等信號(hào)分子跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)[21-23]。脂筏抑制劑Filipin能夠破壞脂筏的結(jié)構(gòu)，阻止富含神經(jīng)酰胺的脂筏平臺(tái)形成，抑制信號(hào)的跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)效應(yīng)[24-25]。

本研究發(fā)現(xiàn)，隱丹參酮聯(lián)合單甲基亞砷酸協(xié)同作用能夠活化多發(fā)性骨髓瘤U266細(xì)胞酸性鞘磷脂酶活性，促進(jìn)細(xì)胞膜上神經(jīng)酰胺生成，迫使細(xì)胞膜上脂筏增大。聯(lián)合用藥1h能夠顯著活化U266細(xì)胞酸性鞘磷脂酶活性，聯(lián)合用藥2h能夠促進(jìn)U266細(xì)胞膜上神經(jīng)酰胺的生成，酸性鞘磷脂酶的活化早于神經(jīng)酰胺的生成，隨著細(xì)胞膜上神經(jīng)酰胺的增多脂筏不斷的形成增大，并且下游凋亡蛋白的表達(dá)被激活。

綜上所述，本研究得出隱丹參酮聯(lián)合單甲基亞砷酸協(xié)同作用能夠上調(diào)多發(fā)性骨髓瘤U266細(xì)胞酸性鞘磷脂的活性，促進(jìn)細(xì)胞膜上鞘磷脂水解生成神經(jīng)酰胺，進(jìn)一步形成富集神經(jīng)酰胺的脂筏并激活U266細(xì)胞下游凋亡信號(hào)通路。本研究結(jié)果表明，隱丹參酮聯(lián)合MMAIII具有協(xié)同抗MM作用，有望為MM的臨床治療帶來(lái)新思路。