沈茹 任保艷 蔣鴻超 王曉巖

智力障礙（intellectual disability，ID），又稱為智力低下、精神發(fā)育遲滯（mental retardation，MR）、腦發(fā)育遲緩（developmental delay，DD），其主要表現(xiàn)為智力功能、適應(yīng)性行為和相關(guān)系統(tǒng)的損害[1]。ID在全世界發(fā)病率約為1%～3%，已經(jīng)成為一個世界范圍內(nèi)的社會問題[2-3]。ID病因復(fù)雜，主要影響因素有環(huán)境因素和遺傳因素。其中，環(huán)境因素約占20%，有研究顯示約三分之二的ID是由遺傳因素所致[4]。隨著社會文明的進步，衛(wèi)生保健事業(yè)的發(fā)展，做好智力障礙的診斷與篩查工作，明確ID病因成為各界關(guān)注要點。常用遺傳診斷方法G帶核型分析、熒光原位雜交技術(shù)（fluorescent in situ hybridization，F(xiàn)ISH）、多重連接探針擴增技術(shù)（multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA）、染色體微芯片（chromosomal microarray，CMA）技術(shù)以及下一代測序技術(shù)（nextgeneration sequencing，NGS）[5]，前 2 種方法以低分辨率檢查一個人的整個基因組，后2種雖然分辨率提高了但僅限于檢測到一個人整個基因組的一小部分。而下一代測序因其高通量、診斷精確可提供廣泛和高分辨率遺傳變異鑒定，不但能明確診斷還能發(fā)現(xiàn)新的病變基因，因此具有巨大的應(yīng)用前景。

1 智力障礙概述

ID，是指各種原因?qū)е碌?8歲前出現(xiàn)認知及社會適應(yīng)能力明顯障礙。按照美國智力與發(fā)育障礙協(xié)會（The American Association on Intellectual and Developmental Disability，AAIDD）建議應(yīng)從智力、適應(yīng)性行為和給予個體的支持系統(tǒng)（systems of ID supports afforded the individual）等3個方面來定義ID[6]。智力是指一般的智力功能，如學(xué)習(xí)、推理、解決問題等。適應(yīng)性行為是人們在日常生活中學(xué)習(xí)和執(zhí)行的概念（語言和識字）、社會技能（人際交往技能、社會責(zé)任）和實踐技能（日常生活和個人護理活動、職業(yè)技能、醫(yī)療保健）的集合。ID在臨床上表型多樣，智力異?；蛘甙殡S其他癥狀，如先天畸形、癲癇、語言發(fā)育遲緩、學(xué)習(xí)障礙等行為、運動異常。ID是世界范圍內(nèi)主要致殘原因之一[7]。ID患病率受各種因素影響，包括性別、年齡、種族、經(jīng)濟、文化、科學(xué)發(fā)展水平、所處環(huán)境等[8]。因此，做好ID的預(yù)防及診斷工作，防止或減少ID患兒的出生；明確ID的病因，提高ID的診斷水平及遺傳學(xué)篩查率，以達到降低和消除高危人群再生育風(fēng)險及預(yù)防ID患兒出生的目的。

2 智力障礙病因分析

ID的病因按照來源可分為環(huán)境因素與遺傳因素，環(huán)境因素包括外源性感染、中毒、外傷、缺氧、藥物性損傷、營養(yǎng)不良、心理疾病等；遺傳因素包括各類染色體異常、單基因突變或多基因異常、先天性代謝缺陷疾病等。隨著醫(yī)療技術(shù)水平和生活質(zhì)量的提高，遺傳因素逐漸成為ID的主導(dǎo)因素，占25%～50%[9]。而染色體異常在已經(jīng)探明原因的ID中約占11%[4]。染色體數(shù)目異常中唐氏綜合征（發(fā)病率1∶800）、愛德華茲綜合征（發(fā)病率1∶7 000）及帕陶氏綜合征（發(fā)病率 1∶6 000～1∶29 000）在ID中最為常見，常伴有重度智力障礙、先天畸形等[10]。單基因突變也常常導(dǎo)致ID的發(fā)生，包括常染色體的單基因突變與性染色體的單基因突變。據(jù)報道目前已知的ID致病基因達528個，候選致病基因達628個[11]。同時研究顯示單基因突變所致的ID發(fā)病率存在男女差異，比例為1.3～1.4∶1，臨床上最為常見的性別相關(guān)ID綜合征為脆性X綜合征（發(fā)病率1∶5 000）[5]。多基因異常及遺傳性代謝缺陷疾病在ID中也占了一定比例，常見的如腦積水、胼胝體發(fā)育不全和Dandy-Walker畸形等[12]。隨著研究深入及檢測技術(shù)的發(fā)展，有研究數(shù)據(jù)證實染色體亞端粒拷貝數(shù)變異也是ID的重要病因之一，占遺傳性ID的5%～10%[13]。這可能與亞端粒區(qū)含有大量功能基因容易發(fā)生重組相關(guān)，但具體機制未明[14]。

3 NGS在遺傳性智力障礙診斷中的應(yīng)用

隨著大數(shù)據(jù)、高通量時代的來臨，加速了分子生物學(xué)診斷方法的不斷革新。近年來，NGS技術(shù)用在智力障礙病人的診斷越來越多，不但對不明原因診斷的病例提供診斷依據(jù)，而且還能發(fā)現(xiàn)新的致病基因，為后續(xù)智力障礙的研究以及藥物研發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

3.1 在染色體數(shù)目或結(jié)構(gòu)異常所致ID中的應(yīng)用

染色體異常是導(dǎo)致ID的重要原因，文獻報道約30%重度ID、10%中度ID是由染色體異常所致，輕度智力障礙較少見[15]。ID中常見的染色體數(shù)目異常有21三體（T21）、18三體（T18）和13三體（T13）。目前臨床上應(yīng)用NGS技術(shù)進行無創(chuàng)產(chǎn)前診斷（noninvasive prenatal Testing，NIPT）已經(jīng)非常成熟，國內(nèi)外已發(fā)表了多篇大規(guī)模臨床應(yīng)用數(shù)據(jù)[16，17-20]，且早在 2014 年已有 meta分析數(shù)據(jù)證實T21、T18、T13在單胎妊娠中的檢出率分別為99.2%、96.3%、91.0%，假陽性率分別為0.09%、0.13%、0.13%[21]。這些數(shù)據(jù)均表明基于 NGS 的NIPT較傳統(tǒng)的染色體非整倍體篩查方法更靈敏，結(jié)果更可靠準確，假陽性率更低，完善了染色體異常的檢測體系。隨著技術(shù)的應(yīng)用與發(fā)展，也有研究發(fā)現(xiàn)NGS用于NIPT的檢測還受到一些因素的影響，如嵌合體、胎兒DNA濃度、孕婦本身攜帶微缺失微重復(fù)或患有婦科腫瘤、雙胎消失綜合征等[22]，因此，在進行ID病因探索時應(yīng)全面分析問題，根據(jù)不同患者的信息進行多種方法的聯(lián)合檢測，為ID的準確診斷提供更全面的信息。

染色體拷貝數(shù)變異（copy number variations，CNVs）為常見的染色體結(jié)構(gòu)異常，因染色體微小片段缺失或重復(fù)而引起染色體疾病，統(tǒng)稱為染色體微缺失/微重復(fù)綜合征。常見臨床表現(xiàn)為發(fā)育遲緩、智力障礙、精神行為異常等。目前有約300種微缺失/微重復(fù)綜合征被報道，發(fā)病率在1/200 000～1/4 000，合并發(fā)病率近 1/600[23]，因此盡早明確病因尤為重要。NGS應(yīng)用于CNV的檢測日漸成熟，Liang等[24]的研究證實基于NGS的CNV測序（copy number variation sequencing，CNV-seq）可取得與SNP array完全一致的檢測結(jié)果，甚至在有些方面優(yōu)于SNP array；Dong等[25]則表明CNV-seq可應(yīng)用于產(chǎn)前或產(chǎn)后的染色體微重復(fù)或微缺失的遺傳學(xué)診斷。目前在許多發(fā)展中國家，ID乃至其他遺傳病的診斷仍主要依賴于傳統(tǒng)的檢測方式進行。CMA（choromosome micro analysis）技術(shù)由于普及性差、價格高昂，僅限于小部分人作為輔助手段進行檢測。隨著NGS技術(shù)成本的迅速下降，加之工作流程簡單，NGS有望更加廣泛的應(yīng)用于遺傳相關(guān)性的ID的診斷，以便更全面地檢測遺傳性ID。

3.2 在單基因缺陷病所致ID中的應(yīng)用

搜索OMIM及NCBI上的數(shù)據(jù)，已明確與ID相關(guān)的致病基因共有818個[26]。荷蘭內(nèi)梅亨大學(xué)醫(yī)學(xué)中心Joris Veltman和研究團隊對50例重度智力障礙患者，以及他們沒有智力障礙的父母進行了全基因組測序，發(fā)現(xiàn)這些在其他測試中的結(jié)果都為陰性的病人在和這次分析中出現(xiàn)了84個全新的單核苷酸變異（single nucleotide variations，SNVs）和8個全新的CNVs，這些全新的變異與重度ID相關(guān)[14]。該研究數(shù)據(jù)突出了NGS技術(shù)作為診斷ID工具的價值。朱麗娜等[27]則創(chuàng)新性地采用了基于NGS的靶向捕獲技術(shù)對40例ID患者進行了384個ID相關(guān)基因進行全序列分析及對ID相關(guān)的CNVs進行探索，發(fā)現(xiàn)了23個國內(nèi)外首發(fā)的新發(fā)突變。英屬哥倫比亞大學(xué)BC兒童醫(yī)院的科學(xué)家們[28]通過基于NGS的全基因組測序技術(shù)精確診斷了一些傳統(tǒng)方法無法確診ID背后的遺傳疾病，碳酸酐酶VA缺乏癥和谷草轉(zhuǎn)氨酶2缺乏癥，研究人員指出特定的藥物可以改善患兒癥狀。ID是一個比較復(fù)雜的問題。有些兒童的ID是因為某種罕見遺傳病干擾了機體的代謝功能，這種代謝障礙會使大腦和機體出現(xiàn)能量缺陷和有毒物質(zhì)累積，最終導(dǎo)致發(fā)育遲緩、認知缺陷、癲癇和器官功能不全等。在細胞水平針對靶標代謝紊亂進行治療對ID是很有幫助的，比如調(diào)整膳食、補充維生素、服用藥物和骨髓移植。因此，盡早確診ID病因，早期干預(yù)能為這些患兒提供很大的幫助，顯著改善他們和家人的生活質(zhì)量。

3.3 在尚未明確致病基因?qū)е轮橇φ系K病人中的應(yīng)用

有些智力障礙的致病基因尚未明確，對于這樣的病人不可能進行單個基因的逐一排查，目前可以使用基因Panel，全外顯子測序或者全基因組測序來進行診斷。下面是一個具體病例：9歲男童因嚴重智障于6歲開始隨訪，所有跡象顯示有頻發(fā)癲癇發(fā)作和智力倒退。到了8歲時，他無法按住頭或咽下去，開始吃鼻飼。他不認識他的母親，癲癇持續(xù)發(fā)作。顯著性神經(jīng)檢查表現(xiàn)為痙攣性攣縮，無器質(zhì)性腫大。MRI表現(xiàn)為腦萎縮和腦室周圍白質(zhì)改變。經(jīng)廣泛評價，甲狀腺形態(tài)、氨、乳酸、MS-MS、尿GCMS均正常，但后者表現(xiàn)為乳酸升高。神經(jīng)傳導(dǎo)、VEP、腦干誘發(fā)反應(yīng)測聽（BERA）、眼底檢查均正常。對變性表型進行了大量的酶類分析，如對變異型白質(zhì)營養(yǎng)不良、Krabbe、神經(jīng)元類脂褐質(zhì)增多癥、Tay Sachs等酶進行了檢測，但均為正常，核型正常。在鑒別診斷的基礎(chǔ)上進行特異性疾病相關(guān)單基因檢測，其中包括Leigh病的突變、Angelman綜合征的甲基化以及SURF 1和PANK 2基因的測序。然而，所有結(jié)果均正常。全外測序結(jié)果顯示，GLB 1基因有一個復(fù)合雜合子突變，即c.1310delA和c.1769G＞A。這證實了GM1型神經(jīng)節(jié)苷脂病的診斷。這個結(jié)果體現(xiàn)了NGS技術(shù)在結(jié)束家庭無效診斷方面的力量。對ID患者的大量單個基因進行Sanger測序?qū)嶋H上是不可能的。外顯子測序只捕獲編碼基因，而全基因組測序，其中30億個核苷酸被測序，以確定基因與疾病一致。自2010年以來，新的ID基因被快速識別出來，大大提高了ID基因檢測的診斷率。

在不太可能獲得的明確表型的背景下，外顯子測序用于病因?qū)W診斷的能力得到了很好的證實，附加診斷率為 25%～32.5%[29，30]。在一個家族中特定的常染色體或X連鎖遺傳模式的臨床背景下，對特定靶向基因的Panel測序是一種實用的方法[30，31]。Gilissen 等人[32]在一組 ID 患者中使用全基因組測序，在60%的患者中確定了致病變異。

3.4 NGS用于目前臨床及市場應(yīng)用的情況

目前，主要有3種基于NGS的ID檢測方法[33]：panel測序、外顯組測序（whole exome sequencing，WES）和全基因組測序（whole genome sequencing，WGS）。由于WGS數(shù)據(jù)量龐大，價格昂貴，在臨床分子診斷中應(yīng)用較多的是panel測序和WES。Panel測序可根據(jù)研究者需求自主設(shè)計探針對目的基因進行捕獲，且價格適中，分析簡單；但該方法只能針對已知致病基因進行檢測，對探針以外的新發(fā)突變無能為力。WES能捕獲所有的外顯子區(qū)域，突破了Panel測序不能檢測新發(fā)突變的局限；尤其是針對遺傳性智障這類疾患，進行家系WES可以減少后續(xù)驗證，提高診斷效率。

自2014年7月國家食品藥品監(jiān)督管理局批準了第一批測序儀器和部分測序產(chǎn)品以及2015年3月開始進行測序技術(shù)臨床應(yīng)用試點申報工作，標志著NGS迅速進入市場。目前尚未有經(jīng)國家食品藥品監(jiān)督管理局批準的基于NGS的ID測序產(chǎn)品，但提供Panel測序及WES基因測序服務(wù)規(guī)模比較大的公司有華大基因、達安基因、貝瑞和康、博奧生物、諾禾致源等，這些企業(yè)在該測序服務(wù)領(lǐng)域都已經(jīng)涉足，但由于涉及的基因個數(shù)不同，市場價格也從幾百元到上千元不等。

4 小結(jié)與展望

ID病因復(fù)雜，目前仍有半數(shù)以上的ID患者病因不明[34]，了解ID病因及其臨床檢測手段有助于ID的診斷。NGS是近年來新興的檢測技術(shù)，其簡單、快速、高分辨率、高通量的特點使得其在臨床上得到越來越多的嘗試。然而，NGS產(chǎn)生的大數(shù)據(jù)目前并沒有得到充分的利用，仍然有許多未知的數(shù)據(jù)等待挖掘。目前已有的ID數(shù)據(jù)庫有包括收集相關(guān)ID基因以及其表型、疾病之間的關(guān)聯(lián)展示的DBDB數(shù)據(jù)庫；對已知ID基因及其對應(yīng)的蛋白相互作用信息和相關(guān)通路信息進行了整合的ID基因庫；提供相關(guān)基因的查詢和檢索，展示基因的名稱位點、功能和對應(yīng)疾病的信息的GeneQuest工具；收集ID相關(guān)基因和相關(guān)疾病的信息，并提供了基因描述、基因信息（包括EntrezID，Ensembl ID，HUGO gene名稱，OMIM ID信息等）的SysID數(shù)據(jù)庫等。這些數(shù)據(jù)庫為ID的研究提供了證據(jù)與工具，但這些數(shù)據(jù)庫均只提供ID基因的簡單檢索和查詢及基因基本信息的展示。建立完善的數(shù)據(jù)庫，為ID的研究提供更全面準確的信息十分必要。目前，全外顯子測序逐漸成為全面深入了解遺傳相關(guān)性ID的常規(guī)方法，而這種基于NGS的panel檢測將產(chǎn)生更大量DNA序列信息，這些數(shù)據(jù)的分析依賴于數(shù)據(jù)庫的建立與健全以及生物信息分析方法的不斷優(yōu)化，這將不斷地促進研究人員提出更有效的針對遺傳相關(guān)性ID的分子診斷方案，為以數(shù)據(jù)挖掘和基礎(chǔ)科研為導(dǎo)向的聯(lián)合性新發(fā)致病性遺傳突變分析提供助益。