劉祥舉

自然流產(chǎn)（Spontaneous Abortion，SA）發(fā)病率占確診妊娠案例的10%～15%，其病因復(fù)雜，相關(guān)研究認(rèn)為遺傳特別是染色體異常是導(dǎo)致SA的主要因素[1-2]。染色體異常包括染色體數(shù)目異常、結(jié)構(gòu)異常、多倍體以及嵌合體等[3]。目前臨床上染色體異常的遺傳學(xué)檢測(cè)方法包括G顯帶染色體核型分析、熒光原位雜交技術(shù)（fluorescent in situ hybridization，F(xiàn)ISH）、熒光定量PCR（quantitative fluorescent polymerase chain reaction，QF-PCR）、多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)（multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA）、染色體微芯片技術(shù)（chromosomal microarray，CMA）以及下一代測(cè)序技術(shù)（nextgeneration sequencing，NGS）等[4]。SA 能增加再次妊娠失敗的發(fā)生率及其他妊娠合并癥的發(fā)病率。采用合適的檢測(cè)方法對(duì)染色體情況進(jìn)行分析，闡明SA病因，對(duì)再次妊娠有重要的指導(dǎo)意義。因此，本文就SA的遺傳學(xué)檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，旨在為臨床選擇合適的染色體異常檢測(cè)方法提供參考。

1 自然流產(chǎn)概述

SA是產(chǎn)科最常見的妊娠合并癥。據(jù)報(bào)道大約有10%～15%已確診的妊娠會(huì)在妊娠20周前發(fā)生自然流產(chǎn)[1-5]。根據(jù)流產(chǎn)發(fā)生時(shí)間的不同，將孕12周前流產(chǎn)稱為早期流產(chǎn)，孕12周及以后的自然流產(chǎn)稱為晚期流產(chǎn)。根據(jù)流產(chǎn)次數(shù)將與同一性伴侶連續(xù)遭受2次或2次以上的自然流產(chǎn)稱為復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)[6]。目前已知的自然流產(chǎn)誘發(fā)因素眾多，涉及遺傳、免疫、感染、內(nèi)分泌、環(huán)境及其他未知因素等[7]。遺傳因素中染色體異常是目前公認(rèn)的導(dǎo)致SA的最主要因素，超過(guò)50%的SA是由染色體異常引起的[8]。染色體異常的類型有染色體數(shù)目異常、染色體結(jié)構(gòu)異常、嵌合體及多倍體等。在SA病例中，染色體數(shù)目異常出現(xiàn)頻率最高（高達(dá)90%），結(jié)構(gòu)異常約占6%，其他嵌合體約占1-2%，而多倍體出現(xiàn)頻率較低[9-10]。SA并發(fā)癥眾多，不利于孕婦的身心健康，且隨著流產(chǎn)次數(shù)的增加，提升了再次妊娠流產(chǎn)的幾率[11]。目前，對(duì)于遺傳因素引起的SA尚無(wú)有效診治方法。對(duì)流產(chǎn)物及孕婦夫妻雙方進(jìn)行染色體排查，并結(jié)合遺傳咨詢和輔助生殖手段，對(duì)再次妊娠的指導(dǎo)具有重要的意義。

2 自然流產(chǎn)的主要遺傳學(xué)檢測(cè)技術(shù)

染色體異常是SA的主要原因，其檢測(cè)常通過(guò)采集流產(chǎn)組織、刮宮組織、引產(chǎn)組織等樣品，從中挑取由受精卵發(fā)育成的胎兒、胚胎或絨毛等組織進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)或者DNA提取，采用分子生物學(xué)檢測(cè)方法對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)對(duì)其染色體異常狀況進(jìn)行分析，再結(jié)合夫妻雙方的遺傳背景輔助分析發(fā)生SA的遺傳因素，為后續(xù)的生育提供科學(xué)依據(jù)和合理指導(dǎo)。臨床上常見的SA遺傳學(xué)檢測(cè)方法有以下幾種。

2.1 G顯帶染色體核型分析

G顯帶染色體核型分析是流產(chǎn)物染色體檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”[4]。該方法通過(guò)對(duì)流產(chǎn)物進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)后制備染色體標(biāo)本，利用顯微鏡觀察染色體數(shù)目及形態(tài)結(jié)構(gòu)進(jìn)而分析檢測(cè)結(jié)果。核型分析技術(shù)優(yōu)點(diǎn)在于能夠檢測(cè)染色體的數(shù)目異常（如三體、單體或多倍體）和5兆堿基（mega base，Mb）以上的結(jié)構(gòu)異常（如易位、倒位）[12]，尤其是對(duì)染色體平衡易位的檢測(cè)是其他分子生物學(xué)方法無(wú)法取代的。此外，G帶帶型的相對(duì)穩(wěn)定也使得該技術(shù)仍在臨床上應(yīng)用最為普遍[13]。張建林、朱蕊等[2，14]通過(guò)對(duì)自然流產(chǎn)絨毛細(xì)胞培養(yǎng)及染色體核型分析證實(shí)了胚胎染色體異常是造成自然流產(chǎn)的重要原因；邱惠國(guó)、王瑾等[15-16]分別通過(guò)G顯帶染色體核型分析技術(shù)檢測(cè)出了染色體數(shù)目異常、染色體結(jié)構(gòu)異常（包括平衡易位、羅伯遜易位、倒位、插入和缺失等）及染色體多態(tài)性，證實(shí)染色體核型異常是導(dǎo)致不孕不育、SA的主要原因。由此可見，G顯帶核型分析技術(shù)可以檢出多種染色體異常類型，為SA病因分析提供了全面指導(dǎo)，同時(shí)對(duì)流產(chǎn)夫婦雙方的染色體核型輔助分析也為胚胎停育的病因分析提供了依據(jù)。G顯帶染色體核型分析技術(shù)雖然有其不可替代的優(yōu)勢(shì)，但該技術(shù)主要依賴于細(xì)胞培養(yǎng)，培養(yǎng)過(guò)程容易受到母體細(xì)胞污染，且在實(shí)際臨床應(yīng)用中常常出現(xiàn)因?yàn)樗×鳟a(chǎn)物過(guò)于陳舊影響染色體的制備情況，進(jìn)而影響檢測(cè)結(jié)果；甚至因?yàn)槠淙唛L(zhǎng)的培養(yǎng)過(guò)程使檢測(cè)周期可長(zhǎng)達(dá)一個(gè)月，這些都在一定程度上限制了其在臨床上的應(yīng)用，同時(shí)也促進(jìn)了其他分子生物學(xué)技術(shù)的誕生。

2.2 熒光原位雜交技術(shù)

核型分析技術(shù)的局限性使得FISH技術(shù)逐漸應(yīng)用于流產(chǎn)物的檢測(cè)。FISH技術(shù)是將熒光標(biāo)記的已知核酸序列作為探針，與待檢測(cè)染色體中的靶序列進(jìn)行雜交，然后在熒光顯微鏡下觀察熒光信號(hào)從而分析待測(cè)樣本染色體情況[17]。該技術(shù)免去了細(xì)胞培養(yǎng)這一復(fù)雜且失敗率高的步驟，從標(biāo)本制備到患者拿到報(bào)告這一過(guò)程僅需24～48 h，極大程度地縮短了臨床報(bào)告時(shí)間，這些優(yōu)勢(shì)在一定程度上彌補(bǔ)了G顯帶染色體核型分析技術(shù)的不足，使其在流產(chǎn)物的檢測(cè)中得到一定程度的應(yīng)用[4，17]。Leung 等[18]對(duì)大樣本研究結(jié)果顯示的極高成功率更是證實(shí)了FISH技術(shù)應(yīng)用于流產(chǎn)物檢測(cè)的可行性，國(guó)內(nèi)近年來(lái)的研究也顯示了該技術(shù)用于流產(chǎn)物檢測(cè)的高成功率[19，20]，這些證據(jù)為FISH的臨床應(yīng)用提供了信心。然而，F(xiàn)ISH技術(shù)的高成功率僅表現(xiàn)于對(duì)染色體數(shù)目異常的檢測(cè)，其對(duì)染色體的結(jié)構(gòu)異常亦無(wú)能為力。而且由于該技術(shù)探針的局限性，常常僅針對(duì)常見的已知染色體異常進(jìn)行檢測(cè)。綜合其檢測(cè)成功率、成本、操作及實(shí)驗(yàn)周期等因素，該技術(shù)目前在臨床上仍有一定的應(yīng)用比例。

2.3 熒光定量PCR

QF-PCR技術(shù)是采用多對(duì)經(jīng)熒光標(biāo)記的引物對(duì)染色體特異的多態(tài)性短串聯(lián)重復(fù)序列（short tandem repeat，STR）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)管電泳，再根據(jù)引物熒光信號(hào)強(qiáng)度比較雜合性STR位點(diǎn)雙峰的比值，進(jìn)而診斷染色體數(shù)目。該技術(shù)在1993年首次應(yīng)用于染色體異常的檢測(cè)，因其報(bào)告時(shí)間短、自動(dòng)化程度高、價(jià)格相對(duì)便宜，迅速在臨床上得到廣泛應(yīng)用[21]。Coelho等[22]采用QF-PCR對(duì)130例流產(chǎn)樣本的染色體異常檢測(cè)結(jié)果（54.6%）顯示了其與常規(guī)染色體核型分析結(jié)果（48%）的一致性，且檢出8例（11.3%）多倍體亦與傳統(tǒng)的細(xì)胞遺傳學(xué)檢測(cè)結(jié)果（12%）相符，證實(shí)了QF-PCR技術(shù)用于染色體非整倍體及多倍體檢測(cè)的可靠性。此外，該技術(shù)還可以根據(jù)STR位點(diǎn)判斷染色體的來(lái)源，排除母體污染情況，為下次妊娠提供更多的遺傳咨詢信息[23]。目前國(guó)內(nèi)外已經(jīng)有成熟的商品化試劑盒，如Aneufast、TrueScienceTMAneuploidy STR Kits以及達(dá)安基因自主研發(fā)生產(chǎn)的21三體和性染色體多倍體檢測(cè)試劑盒等。然而，這些試劑盒都只對(duì)21、18、13及X和Y 5條染色體進(jìn)行檢測(cè)，并不能檢測(cè)剩余染色體的數(shù)目異常，也不能檢測(cè)染色體的結(jié)構(gòu)異常，同時(shí)，尚未有基于中國(guó)人群STR位點(diǎn)的大樣本研究數(shù)據(jù)，這也是目前QF-PCR多被應(yīng)用于產(chǎn)前診斷的原因。

2.4 多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)

2002年，Schouten 等[24]報(bào)道了一種可于同一反應(yīng)管中同時(shí)檢測(cè)40個(gè)不同核苷酸序列的拷貝數(shù)變化的新方法。MLPA為一種定性和半定量技術(shù)，每一個(gè)待測(cè)基因均包含一長(zhǎng)一短的兩個(gè)熒光標(biāo)記探針，這對(duì)探針能夠與染色體靶序列進(jìn)行分子雜交，經(jīng)連接酶連接、多重PCR擴(kuò)增后將產(chǎn)物用序列基因分析儀電泳分析檢測(cè)結(jié)果。MLPA技術(shù)具有通量相對(duì)高（可同時(shí)檢測(cè)幾十個(gè)樣本）、速度快（24～48 h可得到檢測(cè)結(jié)果）、分辨率高（可識(shí)別50～70 bp的拷貝數(shù)變異）的特點(diǎn)[4]。該技術(shù)自誕生后已在基因拷貝數(shù)分析、異倍體檢測(cè)、產(chǎn)前診斷、突變?nèi)笔?、單核苷酸多態(tài)性等多方面檢測(cè)研究中廣泛應(yīng)用[25]。早在2009年國(guó)外就將MLPA與FISH及染色體核型分析檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行了比對(duì)，結(jié)果顯示MLPA檢測(cè)靈敏度、特異度可達(dá)100%，證實(shí)了MLPA用于染色體非整倍體檢測(cè)的有效性[26]。隨著MLPA技術(shù)的推廣運(yùn)用，研究者逐漸發(fā)現(xiàn)MLPA應(yīng)用于SA組織染色體異常的檢測(cè)具有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值，但也存在一定的局限性，如無(wú)法檢測(cè)多倍體、平衡易位以及無(wú)法對(duì)探針不涉及的未知染色體變異進(jìn)行檢測(cè)等。MLPA技術(shù)存在自身的優(yōu)勢(shì)與劣勢(shì)，應(yīng)從實(shí)驗(yàn)室自身具體情況出發(fā)，選擇合適的檢測(cè)分析方法，以期為患者提供更全面的遺傳咨詢信息。

2.5 染色體微芯片技術(shù)

CMA技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的高通量檢測(cè)技術(shù)，主要包括兩大類：微陣列比較基因組雜交技術(shù)（array comparative genomic hybridization，array-CGH）和單核苷酸多態(tài)性微陣列技術(shù)（single nucleotide polymorphism array，SNP-array）。

比較基因組雜交技術(shù)（comparative genomic hybridization，CGH）是自1992年后發(fā)展起來(lái)的一種分子細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)，其基本原理將待測(cè)DNA和對(duì)照DNA分別標(biāo)記不同的熒光素后與正常染色體雜交，經(jīng)熒光數(shù)字成像系統(tǒng)掃描后通過(guò)比較兩種熒光素的相對(duì)濃度來(lái)檢測(cè)兩種DNA拷貝數(shù)的變化。CGH 檢測(cè)分辨率約為 3～10Mb[27]，與核型分析技術(shù)檢測(cè)分辨率相當(dāng)，為了提高分辨率，研究者將微陣列技術(shù)引入，誕生了array-CGH技術(shù)。Array-CGH技術(shù)通量高，分辨率可達(dá)200 kb，并且能一次性掃描全基因組拷貝數(shù)變異（copy number variation，CNV），尤其是對(duì)全基因組微小染色體異常的檢測(cè)更是將染色體病的診斷提高到基因水平。臨床已將該技術(shù)應(yīng)用于發(fā)育遲緩/智障、自閉癥、先天畸形等方面的病因篩查[28]。而 Gao J等[29]的研究則證實(shí)了該技術(shù)用于流產(chǎn)病因分析的可靠性和適用性，但該研究結(jié)果也表明array-CGH技術(shù)并不適用于多倍體的檢測(cè)。同時(shí)，基于其檢測(cè)原理，array-CGH技術(shù)對(duì)于芯片探針無(wú)法覆蓋的染色體區(qū)段將無(wú)法檢測(cè)，這將限制了發(fā)現(xiàn)新發(fā)疾病或突變的可能；對(duì)于單親二倍體（uniparental disomy，UPD）的檢測(cè)也受到限制。Agilent公司的芯片是目前array-CGH技術(shù)的主流平臺(tái)。

與array-CGH技術(shù)檢測(cè)原理不同，SNP-array技術(shù)只需將雜交后的待測(cè)樣本與一整套正?；蚪M對(duì)照資料進(jìn)行對(duì)比即可獲得診斷。除了array-CGH技術(shù)的檢測(cè)范圍以外，SNP-array技術(shù)還能夠檢出核型分析、MLPA、FISH及array-CGH都無(wú)能為力的雜合性缺失（Loss of Heterozygosity，LOH）和UPD[30]。UPD與完全性葡萄胎相關(guān)，也是導(dǎo)致流產(chǎn)的原因之一[31]。雖然SNP-array技術(shù)具有獨(dú)一無(wú)二的檢測(cè)能力，但高昂的成本阻礙了該技術(shù)在臨床上的普及，目前只有有限的臨床科室在使用該技術(shù)。與array-CGH技術(shù)局限相同的是，SNP-array技術(shù)也不能檢測(cè)未知的突變或疾病。此外，SNP-array技術(shù)對(duì)于染色體的平衡易位、倒位、多倍體（除三倍體外）等也無(wú)法檢測(cè)。Affymetrix公司的芯片是目前SNP-array技術(shù)的主流平臺(tái)。

CMA技術(shù)具備其他檢測(cè)技術(shù)所不能達(dá)到的檢測(cè)能力，且對(duì)樣本要求低，對(duì)于流產(chǎn)物樣本常為陳舊標(biāo)本尤為適宜。但其高分辨率也是一把“雙刃劍”，雖然能為流產(chǎn)病因分析提供全面的信息，但檢測(cè)出的小片段CNV常常也給臨床報(bào)告解讀醫(yī)生帶來(lái)困擾，尤其是對(duì)于現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫(kù)中尚未明確的CNV的解讀需要更加謹(jǐn)慎。

2.6 下一代測(cè)序技術(shù)

自2005年以來(lái)，NGS從生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域逐漸應(yīng)用到臨床診斷，將臨床分子診斷推進(jìn)一個(gè)新高潮。NGS技術(shù)的基本原理是基于PCR擴(kuò)增，將帶有標(biāo)志物的堿基加入反應(yīng)中，根據(jù)堿基互補(bǔ)原則，堿基結(jié)合DNA模板時(shí)采集生物標(biāo)志物發(fā)出的信號(hào)進(jìn)行序列信息的讀取，以達(dá)到測(cè)序的目的。根據(jù)采集信號(hào)的不同，目前臨床上常用的NGS平臺(tái)分別有以采集光信號(hào)為代表的Illumina公司的Solexa測(cè)序平臺(tái)及以采集H+流信號(hào)為主Life Technologies公司的 Ion torrent半導(dǎo)體測(cè)序平臺(tái)[32]。NGS最早用于臨床染色體異常檢測(cè)為無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前診斷（noninvasive prenatal testing，NIPT），其檢測(cè)的準(zhǔn)確性及可靠性已得到大規(guī)模臨床應(yīng)用數(shù)據(jù)的支持[33，34]。隨著NGS技術(shù)的進(jìn)步和測(cè)序成本的大幅下降，NGS在臨床各領(lǐng)域的應(yīng)用如雨后春筍般普及開來(lái)。受益于其成本的下降及操作的簡(jiǎn)便，NGS也在流產(chǎn)物檢測(cè)中得到應(yīng)用。Shen等[35]采用436例早期自然流產(chǎn)的樣本評(píng)估array-CGH技術(shù)和NGS技術(shù)流產(chǎn)物檢測(cè)的應(yīng)用效能，結(jié)果顯示array-CGH和NGS檢出率高，能夠檢測(cè)出傳統(tǒng)核型分析漏檢的對(duì)于復(fù)發(fā)性流產(chǎn)夫婦遺傳咨詢尤為重要的染色體的微重復(fù)和微缺失。郭依琳等[36]的研究結(jié)果也證明了NGS技術(shù)用于流產(chǎn)物遺傳學(xué)分析的價(jià)值。與前面介紹的幾項(xiàng)技術(shù)相比，NGS除了具有高分辨率、高敏感性和準(zhǔn)確性、自動(dòng)化程度高、成本低、對(duì)樣本要求低、能夠一次性掃面全基因組等優(yōu)點(diǎn)以外，還可以發(fā)現(xiàn)CMA平臺(tái)未能覆蓋的CNV以及尚未有報(bào)道的新發(fā)突變，這對(duì)于流產(chǎn)的病因分析，尤其是反復(fù)性流產(chǎn)夫婦的遺傳咨詢尤為重要。盡管NGS在流產(chǎn)物檢測(cè)上有眾多的優(yōu)勢(shì)，該技術(shù)平臺(tái)也存在自身的局限，如NGS不能檢出UPD及多倍體異常，而且NGS分辨較CMA平臺(tái)更高，因此，在臨床應(yīng)用時(shí)應(yīng)該了解技術(shù)平臺(tái)的局限性，為患者的遺傳咨詢提供準(zhǔn)確信息。

3 小結(jié)與展望

染色體異常為SA的主要病因。目前臨床上用于染色體異常檢測(cè)的分子生物學(xué)技術(shù)已經(jīng)大幅度提高染色體異常檢出率，但各具局限性。已有研究將NGS和QF-PCR技術(shù)進(jìn)行聯(lián)合檢測(cè)，有效地檢出了染色體多倍體。這提示我們?cè)谌粘ＥR床工作中，應(yīng)了解各項(xiàng)檢測(cè)技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)，通過(guò)聯(lián)合檢測(cè)手段，在現(xiàn)有技術(shù)基礎(chǔ)上增加染色體異常檢出率，為后續(xù)遺傳咨詢提供更多更準(zhǔn)確的信息。