楊瓊，鄧?yán)^輝，王振華，俞寧

（成都農(nóng)業(yè)科技職業(yè)學(xué)院，四川 溫江 611130）

根據(jù)某些活體染料能夠區(qū)別細(xì)胞死活的特點(diǎn)，本試驗(yàn)利用臺盼藍(lán)、次甲基藍(lán)、健那綠三種染液分別對豬精子進(jìn)行染色，在不同的染色條件下統(tǒng)計數(shù)據(jù)，制表分析，篩選出合適的染料、合理的染色時間和染色濃度，從而使精子更容易觀察到，測得的精子活率更為準(zhǔn)確。

1 材料與方法

1.1 精液的采集和處理 本試驗(yàn)使用的豬精液來自崇州某豬場。借助光學(xué)顯微鏡將精液高倍稀釋（采用BTS稀釋液），在顯微鏡下用肉眼觀測法估測，以清楚地觀察到精子輪廓且精子間有一定的間距為宜[1]。將稀釋后的豬精液放入17℃冰箱中保存，待用。

1.2 主要試劑 臺盼藍(lán)、次甲基藍(lán)、健那綠購自上海士鋒生物科技有限公司；PBS緩沖液（pH值7.4）、0.9%NaCl溶液、BTS 稀釋液（pH 值 7.2）來自四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物遺傳與胚胎工程實(shí)驗(yàn)室。

1.3 主要儀器設(shè)備 恒溫恒濕箱、恒溫臺、冰箱、超凈工作臺、實(shí)驗(yàn)室干燥箱、超聲波清洗機(jī)、電子天平、計時器等，Zealway全自動高壓滅菌鍋、奧林巴斯CH-2正立顯微鏡等。

1.4 方法

1.4.1 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備工作 將載玻片、蓋玻片在酸缸中浸泡至少1周，撈出后用清水沖洗掉酸液，反復(fù)幾次。將玻片放入超聲波清洗機(jī)中清洗20min（20℃），之后再用純水漂洗，以不掛水珠為準(zhǔn)，晾干。超凈工作臺經(jīng)過紫外線照射至少15min，紫外線消毒后，將紫外線殺菌燈換成工作燈，打開風(fēng)機(jī)。實(shí)驗(yàn)人員戴上干凈的一次性聚乙烯手套和口罩，用酒精噴霧器噴灑手套外表面、移液槍槍頭和槍頭盒，消毒滅菌，用酒精棉球?qū)⑴_面擦拭干凈，結(jié)束后再打開紫外滅菌燈，滅菌30min。

使用干凈的牛皮紙將載玻片、蓋玻片、槍頭盒包好，用馬克筆標(biāo)記姓名、指導(dǎo)老師、實(shí)驗(yàn)室、日期等信息，將包好的物品放置在高壓蒸汽滅菌鍋中滅菌（30min，120℃）。滅菌完成后，待顯示面板顯示壓力降到0Pa，顯示溫度＜80℃，才能開蓋，取出物品后關(guān)閉電源，在干燥箱中烘干，24h后取出、待用。

1.4.2 溶液配制

（1）臺盼藍(lán)染液的配制：用電子天平稱取4g臺盼藍(lán)，加入PBS緩沖液至100 mL，溶解、過濾后，裝入塑料試管中，用塑料杯封口膜密封，包裹錫箔紙，4℃保存。使用時用PBS液稀釋成0.2%、0.3%、0.35%、0.4%、0.45%、0.5%的濃度梯度。

（2）次甲基藍(lán)染液的配制：取次甲基藍(lán)2.0g，加0.9%NaCl溶液100mL，溶解后過濾，配制成2%次甲基藍(lán)染液。使用時用生理鹽水稀釋成0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1%、1.5%、2%的濃度梯度。

（3）健那綠染液的配制：將0.5g健那綠溶解于50mL生理鹽水中，加溫至30～40℃，使其充分溶解，經(jīng)濾紙過濾后，裝入塑料試管中，用塑料杯封口膜密封，包裹錫箔紙。按照此法將健那綠分別配成0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1%、1.2%的濃度梯度，再用生理鹽水將1%的健那綠染液稀釋為0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.1%的濃度梯度。

（4）BTS稀釋液的配制：依次稱取葡萄糖3.700g、檸檬酸鈉 0.300g、EDTA 0.125g、碳酸氫鈉0.125g、KCl 0.075 g溶解到100 mL滅菌水中，然后用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值到7.2，使用時加青霉素125μL、鏈霉素 200μL。

1.4.3 染色方法

（1）臺盼藍(lán)抹片染色法：染液、顯微鏡玻片先在37℃恒溫箱中預(yù)熱[2]。將精液樣品充分混勻，用移液槍（量程為 10～100 μL）吸取 5 μL 精液樣品和5μL臺盼藍(lán)染液于微量離心管中，攪拌混勻，置于37℃恒溫箱，待鏡檢。

鏡檢時搖勻待測液，取5μL滴于載玻片的右端，取另一張邊緣光滑平直的載玻片呈35°角自待測液的左面向右接觸，待測液即呈條狀分布在兩個載玻片接觸邊緣之間，將上面的載玻片貼著平置的載玻片表面，自右向左移動，帶著待測液均勻地涂抹在載玻片上，切忌直接將待測液“推”過去，人為造成精子損傷[3]。置于400倍顯微鏡下觀察，隨機(jī)選取多個視野，對染色死亡細(xì)胞與非染色存活精子數(shù)量進(jìn)行計數(shù)[4]，保證所有視野中的精子總數(shù)≥200個，根據(jù)“精子活率=所有視野中存活精子數(shù)目/所有視野中總精子數(shù)目”公式計算精子的活率，重復(fù)數(shù)次，取平均值。

（2）臺盼藍(lán)滴壓染色法：用移液槍取上述待測液3μL于載玻片上，然后蓋上蓋玻片（22 mm×22 mm），直接用400倍光學(xué)顯微鏡檢驗(yàn)，統(tǒng)計染色精子數(shù)目和未染色精子數(shù)目，計算精子的活率，重復(fù)數(shù)次，取平均值[4]。

（3）次甲基藍(lán)抹片染色法：用移液槍吸取5μL精液樣品和5 μL次甲基藍(lán)染液于微量離心管中，使用移液槍攪拌、混勻，然后吸取5μL于37℃載玻片上，待反應(yīng)30～40s后，用另一潔凈載玻片制作抹片（抹片方式同臺盼藍(lán)抹片染色法），然后鏡檢、計數(shù)，計算精子活率。

（4）次甲基藍(lán)滴壓染色法：將稀釋后的豬精液混勻，取2μL中層精液與2μL次甲基藍(lán)染液于37℃載玻片上，在載玻片上用移液槍充分?jǐn)嚢杈鶆?，蓋上蓋玻片，反應(yīng) 30～40 s，然后鏡檢、計數(shù)，計算精子活率。

（5）健那綠染色方法：同次甲基藍(lán)染色法。1.4.4 制作空白對照組 將未加染液的精液樣品單獨(dú)制片，置于血球計數(shù)板上，在恒溫（37～38℃）載物臺上觀察，對不活動的精子進(jìn)行計數(shù)，然后置于恒溫干燥箱內(nèi)（100℃ 2 min）處死所有精子，并計數(shù)[5]。精子活率=（所有視野中總精子數(shù)目-不活動精子數(shù)目）/所有視野中總精子數(shù)目。

1.5 統(tǒng)計分析 取稀釋后的精液用不同濃度的臺盼藍(lán)（0.2%、0.3%、0.35%、0.4%、0.45%、0.5%）、次甲基藍(lán)（0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1%、1.5%、2%）、健那綠（0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.1%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1%、1.2%）于室溫下染色，臺盼藍(lán)染液又分設(shè) 5、10、15、20 min 4個不同的染色時間。染色結(jié)束后鏡檢，計算各樣本的精子活率。試驗(yàn)數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，用SPSS22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用Duncan's單因素方差分析比較不同染液濃度及不同染色時間下的精子活率。

2 結(jié)果與分析

2.1 精子的染色特征 用臺盼藍(lán)染液對豬精液染色后，在顯微鏡下觀察到活精子的細(xì)胞膜界限分明，呈無色透明狀；死精子體積較大，著藍(lán)色，細(xì)胞界限模糊難辨。經(jīng)次甲基藍(lán)染色后，可以觀察到絕大部分精子被染上色，整個精子著藍(lán)色，精子細(xì)胞膜界限分明，極少數(shù)精子透明不著色。經(jīng)健那綠染色后，可以觀察到絕大部分精子被染上藍(lán)色，細(xì)胞界限分明，精子尾部中段略膨大，極少數(shù)精子不著色，無色透明。

2.2 不同染色條件下豬精子活率的比較

2.2.1 臺盼藍(lán)染色后精子活率的比較 采用Duncan's單因素方差分析，比較不同染液濃度及不同染色時間下的精子活率，結(jié)果如表1所示。

同一染色時間下，隨著臺盼藍(lán)染液濃度的提高，精子頭部著藍(lán)色的精子數(shù)目逐漸增加，由此判斷死精子數(shù)目不斷增加，得出豬精子活率逐漸降低，且降低的幅度大（P＜0.05），表明染液濃度對精子活率的影響較大，但染色15 min以內(nèi)，0.35%、0.4%、0.45%濃度之間的差異不明顯。在相同染色濃度下，作用時間越長，被染上色的精子數(shù)目越多，即死精子數(shù)目增多，精子活率下降。5～10 min內(nèi)，精子活率下降幅度小（P＞0.05），10 min之后，隨著時間的延長，精子活率下降幅度增大（P＜0.05），表明染色時間對精子活率的影響較大。將測得的精子活率與空白對照組進(jìn)行對比，得出0.4%臺盼藍(lán)染色15 min與對照組差異不顯著（P＞0.05）。對照組的精子活率為77.87%±0.33%。2.2.2 健那綠、次甲基藍(lán)染色后精子活率的比較 不同染色濃度下，次甲基藍(lán)和健那綠染色后精子活率的測定結(jié)果如表2所示。

表1 不同濃度臺盼藍(lán)在不同染色時間下測得的精子活率

次甲基藍(lán)染液和健那綠染液對精子的染色時間為30～40 s，光學(xué)顯微鏡下觀察到視野中絕大多數(shù)精子被染上色，極少數(shù)精子無色透明、不著色，根據(jù)著色情況判斷精子的死活，即染色30～40s精子全部死亡。與對照組相比，次甲基藍(lán)、健那綠染色后的精子活率不超過4%。

表2 次甲基藍(lán)、健那綠染色后精子活率的測定結(jié)果

3 討論

精子質(zhì)膜是精子最外層的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，膜的完整性是精子維持正常生理功能的基礎(chǔ)和基本條件，因此精子膜的完整性常作為評價精子質(zhì)量的最基本指標(biāo)，而活體染色劑是目前判斷精子質(zhì)膜完整性最簡便的方法之一，臺盼藍(lán)則是其中常用的精子活體染色劑之一[6]。

3.1 本次試驗(yàn)對不同染色條件下的精子活率進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)染色時間越長、染液濃度越大，精子活率越低。臺盼藍(lán)染色時間從5min延長到10 min時，測得的精子活率差異不顯著，表明染色時間在10min以內(nèi)的染色效果差異不明顯。染色時間越短，精子染色不充分，部分死精子沒有染上色，導(dǎo)致測得的精子活率高于實(shí)際精子活率。不同染液濃度下，精子活率差異顯著。染液濃度越高，染色越充分，染上色的死精子數(shù)目越多，測得的精子活率越低，但染液濃度過大對活精子也有損害，最終使測得的精子活率低于實(shí)際精子活率。

3.2 次甲基藍(lán)染液常用于區(qū)分酵母細(xì)胞的死活，且區(qū)分酵母細(xì)胞死活的最適染色時間為8 min、最適染色濃度為2%。為了探究次甲基藍(lán)是否可用于精子活率的測定，前期設(shè)置的時間梯度為3、5、8、12 min，濃度梯度為 1%、1.5%、2%、2.5%、3%。鏡檢觀察到，絕大部分精子染上了藍(lán)色，隨著濃度的增加，染色背景越深，越不易區(qū)分染色與否，染上色的精子數(shù)目不隨著時間的變化而變化。調(diào)整染色濃度為0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1%、1.5%、2%，采用立即染色的方式，即在 30～40 s范圍內(nèi)完成染色。結(jié)果顯示：精子染色效果很明顯，整個精子染上藍(lán)色，細(xì)胞界限清晰，但是即使用低濃度的次甲基藍(lán)染色，視野中的絕大部分精子也被染上了藍(lán)色，根據(jù)染色情況，計算出的精子活率不超過4%，而空白對照組的精子活率為87.67%。所以，次甲基藍(lán)不能用于豬精子活率的測定。

3.3 健那綠屬于活體染色劑，專一性染色線粒體，線粒體中的細(xì)胞色素氧化酶使健那綠保持在氧化狀態(tài)呈現(xiàn)藍(lán)綠色，而線粒體周圍細(xì)胞質(zhì)中的染料被還原為無色，從而使線粒體顯色[7]。為了探究健那綠是否可用于精子活率的測定，前期設(shè)置的時間梯度為5、10、15 min，濃度梯度為0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1%、1.2%。采用抹片法或者滴壓法制片后，觀察到視野中精子混為一體，無法辨別精子形態(tài)，健那綠染液吸附精子呈團(tuán)狀，背景雜亂不易觀察，且濃度越大，絮狀物越多。調(diào)整染色濃度為0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.10%、0.20%、0.40%、0.60%、0.80%、1.00%、1.20%，于30～40s內(nèi)完成染色。鏡檢比較各個濃度下的染色情況，發(fā)現(xiàn)當(dāng)濃度大于0.08%時，染色效果差，精液和染液聚集，精子形態(tài)不易辨別；當(dāng)染液濃度小于0.08%時，染色效果好，可以清晰地看到精子頸部、尾部中段膨大，精子染上藍(lán)色，細(xì)胞界限清晰。隨著濃度降低，精子染色越好，但計算得出的精子活率不超過4%，而空白對照組的精子活率為72.37%。所以，健那綠也不能用于豬精子活率的測定。

次甲基藍(lán)和健那綠在即染方式下幾乎對所有精子都染上色，且視野中沒有活動的精子，分析原因可能是精子對次甲基藍(lán)和健那綠的毒性很敏感，導(dǎo)致染色30～40s內(nèi)精子全部死亡，所以通過這兩種染料染色與否來判斷精子死活并計算精子活率，是不可行的。

4 結(jié)論

本次試驗(yàn)得出：當(dāng)臺盼藍(lán)的染色濃度為0.4%、作用時間為15 min時所測得的精子活率較為準(zhǔn)確，次甲基藍(lán)、健那綠不能用于豬精子活率的測定。