陳 麗，張逸之，葛金文，趙思如，林飛陽(yáng)，譚 瀅，周忠志

皮膚作為人體最大最外部的器官具有調(diào)節(jié)體溫、免疫、分泌和屏障等重要功能，但同時(shí)也極易遭受創(chuàng)傷[1]。如何加快并改善皮膚創(chuàng)傷修復(fù)逐漸成為人們生活中迫切需要解決的問(wèn)題和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。皮膚創(chuàng)傷修復(fù)可以大致分成凝血止血期、炎癥反應(yīng)階段、細(xì)胞增殖期和組織重塑期這4個(gè)階段[2]。研究表明，凝血止血期的縮短對(duì)炎癥反應(yīng)的發(fā)展有重要作用，可減少全身多器官功能障礙綜合征的發(fā)生，使創(chuàng)傷傷口加速愈合[3-5]，成為救治創(chuàng)傷患者的重要方法。

復(fù)方微粉ANBP是由仙鶴草(A)，乳香(N)，藕節(jié)(B)和蒲黃(P)這4種中草藥按一定比例制成的粉末混合物，是治療傷口愈合的經(jīng)典良方，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、止血、凝血的作用。已知仙鶴草和乳香可被用于快速止血，緩解疼痛，傷口愈合和消除炎癥。但關(guān)于復(fù)方微粉ANBP促進(jìn)創(chuàng)傷愈合的具體研究機(jī)制目前尚未完全清楚。

機(jī)體的凝血系統(tǒng)包括凝血和抗凝血兩方面，兩者的共同作用保證機(jī)體出血時(shí)既可有效止血，又能防止血栓形成堵塞血流，從而維持機(jī)體內(nèi)血液正常的生理流動(dòng)狀態(tài)[6]。本實(shí)驗(yàn)的目的是通過(guò)對(duì)小鼠背部創(chuàng)面在24h內(nèi)進(jìn)行肉眼觀察和檢測(cè)血清凝血因子(FⅦ)和抗凝血酶Ⅲ(ATⅢ)的含量變化，為進(jìn)一步研究復(fù)方微粉ANBP對(duì)皮膚創(chuàng)傷模型小鼠的凝血與抗凝血功能的影響奠定基礎(chǔ)，完善其對(duì)創(chuàng)傷愈合的研究機(jī)制。

材料與方法

1 材料與動(dòng)物模型建立

鼠齡6～8周齡的無(wú)特定病原體(SPF級(jí)別)雌性C57BL/6小鼠30只，體重18～22g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司供給；水合氯醛(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司,250g/瓶，批號(hào)Q/12HB 4218-2009；復(fù)方微粉ANBP從湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院購(gòu)買(mǎi)仙鶴草、藕節(jié)、乳香和蒲黃4味中藥，制備受專(zhuān)利權(quán)保護(hù)(201210467065.8)；FⅦ、ATⅢ酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(CSB-E17817m、CSB-EL021079MO)購(gòu)自武漢華美生物工程有限公司；多功能酶標(biāo)儀(Enspire,美國(guó)Perkinelmer公司生產(chǎn))；生化培養(yǎng)箱(SPX-250B-2,上海?，敼旧a(chǎn))；高速冷凍離心機(jī)(Z32HK,德國(guó)生產(chǎn))。

建立小鼠背部全層皮膚缺損模型[6]：將30只小鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組(n=15)和對(duì)照組(n=15)。腹腔注射10%水合氯醛全身麻醉并維持。于小鼠背部脫毛消毒，用直徑1cm打孔器制備皮膚缺損模型。實(shí)驗(yàn)組小鼠背部傷口予以復(fù)方微粉涂撒0.2g，盡量覆蓋全部傷口。對(duì)照組不予任何處理。兩組喂食、飲水、環(huán)境溫度等其他條件相同。并于傷后1～3h、6h、12～24h(各10只)眼眶取血進(jìn)行指標(biāo)檢測(cè)。

2 觀察指標(biāo)及方法

肉眼觀察創(chuàng)面基本情況，用大小、厚度相同的濾紙貼于傷口，通過(guò)濾紙浸潤(rùn)面積來(lái)判斷創(chuàng)面滲出及其干燥程度。小鼠全血FⅦ、ATⅢ濃度測(cè)定：眼眶取血后在8℃下靜置2h后用低溫離心機(jī)4℃ 3 000r/s 離心15min離心取得血清。嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作。終止顯色反應(yīng)后，5min內(nèi)使用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在450nm波長(zhǎng)下的光密度(OD值)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

1 肉眼觀察

由圖1可見(jiàn)，對(duì)照組小鼠背部創(chuàng)面在1～3h和6h時(shí)并無(wú)較大差別，濕潤(rùn)有少量滲出液體，在12～24h時(shí)存在輕微出血。實(shí)驗(yàn)組小鼠背部創(chuàng)面因有復(fù)方微粉覆蓋，與對(duì)照組相比，在1～3h時(shí)液體滲出少，12～24h時(shí)創(chuàng)面無(wú)出血，粉末貼合，整體情況較對(duì)照組良好，而6h時(shí)創(chuàng)面較表現(xiàn)最為干燥，滲出最少。

圖1 小鼠背面創(chuàng)面肉眼觀

2 小鼠全血血清FⅦ含量檢測(cè)結(jié)果

ELISA結(jié)果顯示在創(chuàng)傷后24h內(nèi)，對(duì)照組FⅦ含量持續(xù)上升。實(shí)驗(yàn)組FⅦ含量先上升后下降，呈開(kāi)口向下拋物線狀，于6h時(shí)達(dá)到(97.32±12.11)ng/mL，為觀察期間含量高峰(P<0.05,見(jiàn)圖2，表1)，較對(duì)照組(71.09±63.73)ng/mL含量表達(dá)增高，而12～24h時(shí)為(58.29±18.10)ng/mL，較對(duì)照組(89.87±61.34)ng/mL含量表達(dá)降低。

3 小鼠全血血清ATⅢ含量檢測(cè)結(jié)果

ELISA結(jié)果表明，對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組ATⅢ濃度變化趨勢(shì)相同，呈開(kāi)口向上拋物線狀，6h降至(17.36±7.89)ng/mL，為觀察期間含量表達(dá)最低點(diǎn)(P<0.05,見(jiàn)圖3，表1)，較對(duì)照組(22.55±6.48)ng/mL含量表達(dá)低。

表1 兩組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)FⅦ與ATⅢ濃度

*代表不同時(shí)間組的凝血因子Ⅶ濃度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

圖2全血血清凝血因子Ⅶ實(shí)驗(yàn)組濃度變化圖

*代表不同時(shí)間組的抗凝血酶Ⅲ濃度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

圖3全血血清抗凝血酶Ⅲ實(shí)驗(yàn)組濃度變化圖

討 論

前期研究發(fā)現(xiàn)：(1)復(fù)方微粉ANBP具有促進(jìn)人體皮膚創(chuàng)傷以及糖尿病小鼠創(chuàng)面愈合的療效；(2)復(fù)方微粉ANBP具有減輕創(chuàng)面炎癥反應(yīng)的作用；(3)蛋白質(zhì)組學(xué)分析表明跟凝血相關(guān)的蛋白在6h表達(dá)增加[7-9]。其中，第3點(diǎn)發(fā)現(xiàn)與本次實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果基本符合。然而關(guān)于復(fù)方微粉ANBP是否能夠通過(guò)影響創(chuàng)傷早期凝血與抗凝血功能尚未有確切研究。本研究通過(guò)對(duì)C57BL/6小鼠進(jìn)行急性全層皮膚缺損創(chuàng)傷模型建立，探討復(fù)方微粉ANBP對(duì)急性大面積創(chuàng)傷FⅦ與ATⅢ的動(dòng)態(tài)影響分析。已知ATⅢ是主要的血漿抗凝物質(zhì)，在血栓栓塞性疾病的形成和發(fā)展過(guò)程中起重要作用。當(dāng)其含量增高時(shí)，則起抗凝作用，降低時(shí)則起促凝作用。FⅦ作為外源性凝血途徑關(guān)鍵因子，其含量與血液凝血狀態(tài)呈正相關(guān)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，肉眼觀察：與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組6h時(shí)創(chuàng)面滲出液減少，更為干燥，不易出血；12～24h時(shí)創(chuàng)面粉末貼合，無(wú)出血無(wú)滲出。這可能與復(fù)方微粉在6h時(shí)FⅦ含量增加，之后逐漸降低的同時(shí)，ATⅢ含量逐漸上升有關(guān)。

FⅦ、ATⅢ含量：對(duì)照組FⅦ濃度漸增至12～24h，而實(shí)驗(yàn)組呈開(kāi)口向下拋物線狀，以6h為高峰出現(xiàn)說(shuō)明實(shí)驗(yàn)組在創(chuàng)傷發(fā)生初時(shí)具有一定的促進(jìn)FⅦ釋放作用；在3～6h具有快速促FⅦ釋放的作用。由此得出復(fù)方微粉ANBP可使得FⅦ在創(chuàng)傷修復(fù)過(guò)程中的高峰期提前，提示藥物可能在創(chuàng)傷早期快速濃聚FⅦ而達(dá)到迅速止血目的，而后降低FⅦ濃度并與ATⅢ共同作用避免血栓形成；而兩組ATⅢ濃度變化趨勢(shì)均呈開(kāi)口向上拋物線狀，提示在ATⅢ實(shí)驗(yàn)組中藥物在短時(shí)間內(nèi)起到了一定的抑制抗凝血系統(tǒng)功能的作用。創(chuàng)傷用藥后1～3h 復(fù)方微粉分別通過(guò)升、降FⅦ或ATⅢ濃度，加速創(chuàng)傷止血進(jìn)程[10]；至6h時(shí)，F(xiàn)Ⅶ濃度達(dá)高峰，ATⅢ濃度至低谷，動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)FⅦ與ATⅢ濃度控制傷口的出血；至24h使得FⅦ濃度降低的同時(shí)調(diào)控ATⅢ濃度處于較高水平，從而可能促進(jìn)止血但又不使其血液處于高凝狀態(tài)，防止急性創(chuàng)傷后的血栓形成，避免彌散性血管內(nèi)凝血(DIC)的發(fā)生發(fā)展及降低微循環(huán)障礙概率，為之后加快愈合而減少瘢痕組織產(chǎn)生奠定基礎(chǔ)[11-12]。

綜上所述，復(fù)方微粉ANBP具有在創(chuàng)傷早期先增加FⅦ含量，而后增加ATⅢ含量的作用，也許可以滿(mǎn)足創(chuàng)面早期急需止血和較晚期避免造成DIC前期血液高凝狀態(tài)以及血栓等并發(fā)癥發(fā)生的良好的、目前缺少的愈合特點(diǎn)。但對(duì)于其是否能夠通過(guò)影響FⅦ及ATⅢ含量表達(dá)來(lái)對(duì)動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)C57BL/6小鼠的凝血與抗凝血功能起到主要作用仍需進(jìn)一步研究。這是由于中藥復(fù)方內(nèi)活性成分繁多，互相作用復(fù)雜以及靶點(diǎn)多方向性等特點(diǎn)和實(shí)驗(yàn)中存在的偶然誤差的影響，復(fù)方微粉ANBP促進(jìn)創(chuàng)傷愈合的具體機(jī)制還需進(jìn)行更深一步的研究和探討。