何藝琴,盧晨,徐文杰,張興,楊蕾,2,張慧麗,2,劉海峰,馬東方,2,張長青

(1.主要糧食作物產(chǎn)業(yè)化湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，長江大學(xué)農(nóng)學(xué)院,湖北 荊州 434025；2.植物病蟲害生物學(xué)國家重點實驗室，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，北京 100193)

小麥赤霉病(Fusariumhead blight，F(xiàn)HB)是全球范圍內(nèi)發(fā)生的小麥谷粒病，由鐮刀菌屬(Fusarium)和微小桿菌屬(Microdochium)復(fù)合引起[1].其中最常見且最具攻擊性的致病菌為禾谷鐮刀菌—脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)的一種高效生產(chǎn)者[2].DON是一種霉菌毒素，如果被人類和動物攝入體內(nèi)，將對人類和動物的健康產(chǎn)生極大毒害作用，引起嘔吐、腹瀉、頭暈的等癥狀,進(jìn)而導(dǎo)致巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3].華中及華南地區(qū)溫暖潮濕，多雨多風(fēng)，利于禾谷鐮刀菌的生長及傳播，故小麥赤霉病發(fā)生嚴(yán)重，探索行之有效的防治方法刻不容緩[4].

小麥赤霉病抗原少，抗病品種的研發(fā)周期長，雖然已經(jīng)有一些抗病品種如蘇麥系列、揚(yáng)麥系列、隴春等，但是仍然沒有獲得突破性進(jìn)展[5-6].防治赤霉病效果較好的化學(xué)藥劑有氰烯.己唑醇懸浮劑、多菌靈與咪鮮胺的復(fù)配劑等[7].但由于化學(xué)藥劑的長期使用，致使污染環(huán)境，危害人畜健康，且大量單一使用易導(dǎo)致抗藥性[8].微生物生防菌劑屬于環(huán)境友好型，利用微生物之間的拮抗關(guān)系及誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性等進(jìn)行防治，不存在產(chǎn)生抗藥性的問題，有些微生物還可促進(jìn)寄主植物的生長[9].從Hartely利用真菌微生物防治植物猝倒病開始，生物防治開始進(jìn)入研究者的視野[10].

生產(chǎn)上廣泛應(yīng)用的細(xì)菌、真菌、放線菌等多從土壤中分離得到用以進(jìn)行植物病害防治[11-12].土壤中也有很多小麥赤霉病的生防菌資源，目前已有很多相關(guān)報道.張雪嬌等[13]從河北省十余縣麥田土壤樣品中篩選獲得27株對小麥赤霉病菌有拮抗作用，拮抗效果好的菌株XJ-16的抑菌率達(dá)73.76%.李曉丹等[14]從石蒜根際土壤中分離得到7株小麥赤霉病的拮抗菌，并優(yōu)化了其中一個菌株HH1的培養(yǎng)條件.土壤中已經(jīng)開發(fā)出諸多植物病原拮抗菌，但直接從小麥組織中分離拮抗內(nèi)生菌的報道相對較少.本研究在小麥赤霉病災(zāi)害區(qū)采集健康小麥植株進(jìn)行內(nèi)生菌分離，并將分離得到的拮抗菌進(jìn)行培養(yǎng)條件優(yōu)化.本研究通過從小麥內(nèi)生菌中篩選得到優(yōu)良拮抗菌株，旨在為小麥赤霉病菌的生防菌增添有用的新成員.

1 材料與方法

1.1 供試植物

于小麥灌漿期湖北省荊州市發(fā)生小麥赤霉病的農(nóng)田里進(jìn)行樣品采集，采樣，具體時間為2016年5月6日，按五點取樣法采集健壯小麥數(shù)株，放入無菌袋中用于分離內(nèi)生菌.

1.2 供試植物病原菌

小麥赤霉病菌(Fusariumgraminearum)、膠孢炭疽病菌(Colletotrichumgloeosporioides)、立枯病菌(Rhizoctoniasolani)、白絹病菌(Sclerotiumrolfsii)、梨黑斑病菌(Alternariakikuchiana)均由長江大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物病原真菌與基因組學(xué)研究室提供.

1.3 內(nèi)生細(xì)菌的分離純化

將小麥的莖和葉剪成5 cm左右的小段，用流水沖洗30 min，無菌水沖洗4次后75%的乙醇浸泡5 min，無菌水沖洗2次，放入0.2%升汞中浸泡3 min，再用無菌水沖洗3次.將消毒后的植物材料放入盛有適量石英沙的無菌研缽中，加入10 mL無菌水研碎成汁液，用量程為100 μL的移液槍取100 μL的汁液涂布于PDA培養(yǎng)基和NA培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng).待長出菌落后挑取不同形態(tài)的菌落分別于PDA及NA培養(yǎng)基上培養(yǎng).

1.4 小麥赤霉病菌拮抗細(xì)菌的篩選及鑒定

采用平板對峙培養(yǎng)法[15]，在直徑90 mm的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)平板中央接種直徑5 mm的小麥赤霉病菌，立枯病菌、白絹病菌、膠孢炭疽病菌和梨黑斑病菌5種植物病原真菌菌餅，在周圍距離中心45 mm處接上分離純化后的小麥內(nèi)生細(xì)菌(圖1)，以無菌水代替拮抗菌作為空白對照，每個處理設(shè)置3個獨立的同等生物學(xué)重復(fù)，于28 ℃恒溫培養(yǎng)3～4 d，待空白對照長滿整個培養(yǎng)皿時，測量抑菌圈寬度，判斷拮抗效果.

圖1 離體拮抗試驗Figure 1 The diagram of antagonism in vitro

1.5 拮抗菌XG-7的生物學(xué)特性研究

1.5.1 拮抗菌XG-7的部分生理生化特征鑒定 采用過濾滅菌法對葡萄糖、乳糖等待測碳源及牛肉浸膏、硝酸鉀等待測氮源進(jìn)行滅菌后，以1%的量分別加入滅菌后的碳源、氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基中.移取0.1 mL菌液于各處理培養(yǎng)基內(nèi)，37 ℃、161 r/min搖培，不接菌的培養(yǎng)基作為空白對照，每處理3次獨立生物學(xué)重復(fù).5 d后觀察，培養(yǎng)液比空白對照渾濁則表明可利用該碳源或氮源.同理，對拮抗菌XG-7明膠液化、耐藥性等特征進(jìn)行檢測[16].

1.5.2 拮抗菌XG-7培養(yǎng)條件的優(yōu)化 接種1 mL的菌液到200 mL NA培養(yǎng)液中，37 ℃、161 r/min搖培，于接種后的前36 h，每隔4 h在625 nm波長下測菌液的OD值，36 h后每隔12 h測一次.以不接菌的NA培養(yǎng)液為CK，每處理3次獨立生物學(xué)重復(fù).以生長時間為橫軸，以O(shè)D值為縱軸繪制生長曲線.

接種0.1 mL的菌液于100 mL的NA培養(yǎng)液(pH7.0)中，分別在4、10、16、22、28、34、40、46和52 ℃的恒溫箱中161 r/min搖培，48 h后在625 nm波長下測其OD值.以不接菌的NA培養(yǎng)液為CK，每處理設(shè)置3次獨立生物學(xué)重復(fù).以處理溫度為橫軸，以O(shè)D值為縱軸繪制最適生長溫度曲線.

NA培養(yǎng)液滅菌后用NaOH和HCl分別把pH值調(diào)至3.0、5.0、6.0、7.0、7.4、8.0、10.0、和12.0，接種0.1 mL菌液于不同pH值的100 mL的NA培養(yǎng)液中，37 ℃、161 r/min搖培，48 h后在625 nm波長下測其OD值.以不接菌的NA培養(yǎng)液為CK，每處理設(shè)置3次獨立生物學(xué)重復(fù).以處理pH為橫軸，以O(shè)D值為縱軸繪制最適生長pH曲線.

1.5.3 拮抗菌XG-7耐藥性測定 將5種常見抗生素氯霉素(Ch1)、氨芐青霉素(Amp)、四環(huán)素(Tet)、鏈霉素(Str)、卡那霉素(Kan)分別配制成25、100、25、50、10 mg/mL的母液.分別取不同母液的抗生素0.2 mL于100 mL NA培養(yǎng)基中制成平板備用.取8 mm打孔器打菌塊接種于含不同藥的培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 d，觀察測量菌落寬度大小，采用以下標(biāo)準(zhǔn)對其耐藥性進(jìn)行評價：0～8 mm無作用，9～17 mm弱作用，≥17 mm強(qiáng)作用.

1.6 拮抗菌XG-7的鑒定

拮抗菌株XG-7的基因組DNA通過改良的CTAB法[17]提取，并以提取成功的基因組DNA為PCR擴(kuò)增模板.擴(kuò)增引物為16S rDNA通用引物(正向引物：27F；反向引物：1492R)，對PCR擴(kuò)增拮抗菌XG-7基因組DNA，PCR產(chǎn)物送華大基因公司測序.測序結(jié)果使用NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/網(wǎng)站)進(jìn)行Blast比對，確定該拮抗菌株的種類.

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗內(nèi)生細(xì)菌的篩選及拮抗譜測定

2.1.1 拮抗內(nèi)生細(xì)菌的篩選 根據(jù)菌落形態(tài)和顏色等差異性，在小麥不同組織內(nèi)共分離到60株細(xì)菌菌株.經(jīng)過平板對峙法測定，從中共篩選出了7株對小麥赤霉病菌有拮抗作用的菌株，占所分離內(nèi)生細(xì)菌總數(shù)的12%；其中，菌株的拮抗效果最好，抑菌圈的寬度達(dá)32.5 mm(表1).XG-7拮抗效果與CK形成鮮明的對比(圖2).

表1 小麥內(nèi)生拮抗菌及其來源

A．XG-7；B：對照CK.圖2 拮抗菌株XG-7對小麥赤霉病菌的拮抗效果Figure 2 Antifungal activities of XG-7 against Fusarium graminearum on PDA plate

2.1.2 XG-7拮抗譜測定 從表中所示的抑菌圈寬度判斷，XG-7菌株對4種供試病原菌的生長均有抑制效果(表2)，判斷為廣譜性拮抗菌.尤其對梨黑斑病菌的抑制效果最好.

2.2 XG-7生物學(xué)特性研究

2.2.1 XG-7拮抗菌株部分生理生化特征測定 測定結(jié)果表明，該菌株可利用碳源包括葡萄糖、甘露醇、蔗糖、乳糖；可利用氮源有牛肉膏、酵母膏、蛋白胨、硝酸銨；可水解明膠、淀粉和水解酪素(表3).

2.2.2 XG-7拮抗菌株生長曲線 由圖3可以看出，XG-7菌株在接種到NA培養(yǎng)液后的24 h內(nèi)為對數(shù)期；接種24～60 h內(nèi)為穩(wěn)定期；60 h后進(jìn)入衰退期.

圖3 拮抗菌XG-7生長曲線Figure 3 Antagonistic bacteria XG-7 growth curve

病原菌Pathogen抑菌圈寬度/mmInhibition zone width平均值A(chǔ)verage膠孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides28.229.029.028.733白絹病菌Sclerotium rolfsii30.633.434.032.667立枯病菌Rhizoctonia solani30.023.931.028.300梨黑斑病菌Alternaria kikuchiana39.029.833.434.067

表3 XG-7菌株的部分生理生化特征

“+”表示生長或反應(yīng)陽性，“-”表示不生長或反應(yīng)陰性.

“+” indicates growth or reaction positive，“-” indicates on growth or negative reaction.

2.2.3 XG-7拮抗菌株最適生長溫度和pH 由圖4以看出，10～50 ℃為可生長溫度，28 ℃為最適生長溫度；4.0～10.0為可生長pH值范圍，pH在5.0～9.0時該菌適宜生長，8為最適pH值.

圖4 拮抗菌XG-7最適溫度和pH生長曲線Figure 4 Antagonistic bacteria XG-7 optimum temperature and pH growth curve

2.3 XG-7鑒定結(jié)果

測序結(jié)果顯示，XG-7菌株的16S rDNA序列長度為1 509 bp.該序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/網(wǎng)站)BLAST進(jìn)行比對，分析發(fā)現(xiàn)與XG-7菌株的16S rDNA同源性較高的均為芽孢桿菌，選取相似度較高、同緣關(guān)系較近的相關(guān)菌株的16S rDNA序列，用MEGA6軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3).結(jié)果表明，XG-7菌株與枯草芽孢桿菌(h14，KX783533.1.)聚在同一分支上，結(jié)合其生物學(xué)特性，可將XG-7菌株初步鑒定為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis).

2.4 XG-7拮抗菌株耐藥性測定結(jié)果

測定結(jié)果顯示，XG-7拮抗菌株對于氯霉素、氨芐西林鈉2種抗生素表現(xiàn)極強(qiáng)的耐藥性(圖6、表4).

圖5 拮抗菌株XG-7的系統(tǒng)發(fā)育樹關(guān)系圖Figure 5 Phylogenetic tree of strain XG-7 based on 16S rRNA sequence

A：氯霉素；B：鏈霉素；C：四環(huán)素；D：卡那霉素；E：氨芐西林鈉；F：CK.A：Chloramphenicol；B：Streptomycin；C：Tetracycline；D：Kanamycin；E：Ampicillin Sodium；F：CK.圖6 拮抗菌XG-7在加入不同抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 d天后的效果圖Figure 6 Antagonistic bacteria XG-7 in different antibiotics added to the culture medium after two days renderings

抗生素Antibiotic用藥濃度Concentration菌落寬度Colony width耐藥性強(qiáng)弱Tolerance氯霉素 Chloramphenicol2539.1強(qiáng)鏈霉素 Streptomycin1008弱氨芐西林鈉 Ampicillin sodium1020.3強(qiáng)卡那霉素 Kanamycin508弱四環(huán)素 Tetracycline2513.1弱

3 討論

本研究從荊州小麥赤霉病重災(zāi)區(qū)采集健康小麥植株，并從中分離得到一株對小麥赤霉病菌有良好抗性的拮抗菌株XG-7，分析了16S rDNA序列、結(jié)合其生理生化特征初步鑒定為枯草芽孢桿菌，并對其生物學(xué)特性進(jìn)行研究.

植物內(nèi)生菌由De Bary提出，經(jīng)過Carrol、Petrini、Kleopper、Wilson等的完善，目前為公眾所接受的概念是生活在健康植株的各類組織并不會引起明顯病害癥狀的有益微生物[18-21].植物內(nèi)生菌可作為植物病害病原菌的生防菌，如Abdallah等從銀葉茄中分離出2株內(nèi)生細(xì)菌SV101、SV104，可防治番茄枯萎病；盧占慧等[22]從人參中分離得到97株內(nèi)生菌，并從中分離到兩株拮抗作用較強(qiáng)的生防真菌Psn87和Psn86；楊紹周等[23]從鼓槌石斛中分離得到33株內(nèi)生菌，其中GB8和GB16抑菌效果極佳且具有廣譜抑菌性.由此可見，植物內(nèi)生菌是生防菌的高效資源庫.本試驗分離所得小麥內(nèi)生菌XG-7對小麥赤霉病菌、膠孢炭疽病菌、立枯病菌、白絹病菌、梨黑斑病菌4種病原菌都有良好的拮抗性，且對于氯霉素、氨芐西林鈉兩種抗生素表現(xiàn)極強(qiáng)的耐藥性.培養(yǎng)條件優(yōu)化結(jié)果為：XG-7菌株在接種到NA培養(yǎng)液后的24 h內(nèi)為對數(shù)期；接種24～60 h內(nèi)為穩(wěn)定期；60 h后進(jìn)入衰退期.該菌株可利用多種碳源包括葡萄糖、甘露醇、蔗糖、乳糖等；可利用多種氮源包括牛肉膏、酵母膏、硝酸銨、蛋白胨；28 ℃為最適生長溫度；8為其最適生長pH.

XG-7為枯草芽孢桿菌，枯草芽孢桿菌屬于革蘭氏陽性菌，對環(huán)境、人畜均無害，被廣泛應(yīng)用于植物病蟲害防治、提高畜禽的品質(zhì)、環(huán)境治理、水體凈化及發(fā)酵堆肥等多個研究領(lǐng)域[25-26].枯草芽孢桿菌作為生物防治中的重要成員，已經(jīng)制成菌粉投入到實際應(yīng)用中.張榮斌等[27]利用枯草芽孢桿菌可濕性粉劑對棉花黃萎病進(jìn)行防治，研究發(fā)現(xiàn)防治效果十分顯著，感病植株減少，植株單產(chǎn)量提高約10.9%，可實施性強(qiáng)，防治效果明顯.

由于拮抗菌株XG-7是從小麥根中分離得到，且所有的試驗均在實驗室條件下完成，所以在實際生產(chǎn)實踐中，XG-7產(chǎn)生的拮抗物質(zhì)能否由根部傳輸?shù)剿氩窟M(jìn)行定位防治，與XG-7在自然條件下能否發(fā)揮良好的拮抗作用對拮抗效果的好壞評估直接相關(guān).以及拮抗菌株XG-7產(chǎn)生何種拮抗物質(zhì)、如何產(chǎn)生、拮抗物質(zhì)的各種理化性質(zhì)尚不明確，有待于進(jìn)一步研究.