王愛玲 葉汪陽 汪鋆植,,3 呂慧芳 張宏岐,3 李平媛 李 湜 賀海波,

(1.三峽大學(xué) 天然產(chǎn)物研究與利用湖北省重點實驗室,湖北 宜昌 443002;2.湖北省土家族藥物研究所,湖北 宜昌 443002;3.湖北省生物酵素工程技術(shù)研究中心,湖北宜昌 443002)

宮頸癌是發(fā)病率最高的女性惡性腫瘤之一,且逐漸出現(xiàn)發(fā)病年齡年輕化、發(fā)病率不斷升高的趨勢[1-2].目前臨床上治療宮頸癌的主要方法是手術(shù)、放療和化療法[3],但目前大多數(shù)臨床化療藥物毒副作用大.因此尋找有效且毒副作用小的抗宮頸癌藥物,具有重大意義.3-氫化松苓酸B是從土家族藥硫磺菌(Laetiporus sulphureus(Fr.) Murrill)中提取分離得到的一種活性物質(zhì),已發(fā)現(xiàn)其對多種腫瘤細(xì)胞增殖具有抑制作用[4].本研究評價TAB對U14細(xì)胞的抗腫瘤活性,并初步判斷其體內(nèi)毒副作用,為其用于腫瘤的臨床治療提供實驗依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實驗藥物

3-氫化松苓酸B(TAB)由本實驗室提供,純度98%,從硫磺菌中分離提取.動物實驗時,直接將TAB用0.5%羧甲基纖維素鈉溶液配成所需濃度.

1.2 實驗細(xì)胞株及動物

小鼠宮頸癌U14細(xì)胞株來自三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院腫瘤微環(huán)境與免疫治療湖北省重點實驗室;SPF級昆明小鼠60只,雌性,4～6周齡,體重18～22 g,購于三峽大學(xué)動物中心,實驗動物生產(chǎn)許可證號為SCXK(鄂)2017-0012,飼養(yǎng)于三峽大學(xué)動物中心SPF級動物實驗室,昆明小鼠適應(yīng)環(huán)境1周后即進(jìn)行成瘤實驗,實驗動物使用許可證號為SYXK(鄂)2017-0061.

1.3 試劑

DMEM培養(yǎng)基粉(1791922)購于美國Gibco公司;胎牛血清(20151209)購于杭州四季青生物材料有限公司;胰蛋白酶(9002077)、HEPES(7365459)購于美國Amresco公司;其他試劑均為市售分析純.

1.4 實驗儀器

雙人單面凈化工作臺購于蘇州凈化設(shè)備有限公司;低速離心機(jī)購于長沙平凡儀器儀表有限公司;水套式CO2培養(yǎng)箱購于上海三騰儀器有限公司;O-lympus KX41型倒置顯微鏡購于美國Thermo公司.

1.5 實驗方法

1.5.1 細(xì)胞培養(yǎng)

小鼠宮頸癌細(xì)胞株U14細(xì)胞使用含有10%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基培養(yǎng),放在37℃、5%CO2、95%飽和濕度的培養(yǎng)箱中進(jìn)行半開口的單層細(xì)胞培養(yǎng).

1.5.2 小鼠宮頸癌動物模型建立

從含U14小鼠宮頸癌細(xì)胞的小鼠腹腔內(nèi)抽取腹水,按1∶3的比例稀釋并混勻,細(xì)胞懸液后取0.2 m L接種于昆明鼠腹腔內(nèi)增殖,至第8 d抽取腹水,調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107個/m L,取0.2 m L/只接種于隨機(jī)選取的50只昆明鼠右側(cè)背部近腋窩處皮下,接種后觀察一周.待腫瘤長出后,每日測量腫瘤體積,待瘤體生長至大于100 mm3時,進(jìn)行實驗.

1.5.3 實驗分組及指標(biāo)觀察

將接種細(xì)胞懸液的昆明鼠隨機(jī)分成5組:模型組,陽性藥雷帕霉素組(1 mg/kg),3-氫化松苓酸B高劑量組(120 mg/kg)、中劑量組(80 mg/kg)、低劑量組(40 mg/kg),每組10只;空白組為余下10只沒有接種U14小鼠宮頸癌細(xì)胞的小鼠,分組后第2 d開始給藥,每組昆明小鼠灌胃給予相應(yīng)的藥物,陽性藥雷帕霉素組按照1 mg/kg的劑量腹腔注射給藥,隔天注射,空白組和模型組灌胃給予相應(yīng)的0.5%羧甲基纖維素鈉溶液,每天同一時間給藥,連續(xù)灌胃10 d.第11 d處理動物.每天測量1次昆明鼠體重,并觀察昆明小鼠的精神狀態(tài)、活動力、反應(yīng)、腫瘤生長情況、大便形態(tài)等.分組后第2 d開始測量各組移植瘤的長度(L)和寬度(W),每2 d測量1次,腫瘤體積(V)=(L×W2)/2.稱取瘤體重量,計算抑瘤率.抑瘤率=[1-(治療組瘤重/對照組瘤重)]×100%.

1.5.4 腫瘤組織及其他臟器組織形態(tài)學(xué)觀察

解剖各組小鼠,剝離各組小鼠的腫瘤組織、胸腺、心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟組織,組織用4%多聚甲醛固定,之后組織脫水,石蠟包埋、切片,HE染色后,在光學(xué)顯微鏡下觀察各組昆明鼠的腫瘤組織及其他臟器組織的形態(tài)學(xué)變化.

1.5.5 小鼠血液相關(guān)生化指標(biāo)

小鼠進(jìn)行眼球取血,室溫靜置半小時后,離心,取上清,分裝后置于-80℃保存.然后根據(jù)市面購買試劑盒說明書進(jìn)行血液相關(guān)指標(biāo)的測定.

1.5.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 藥物對U14細(xì)胞移植瘤昆明鼠一般情況的影響

用TAB治療后,各組小鼠的進(jìn)食、飲水及大小便均正常,活動正常,反應(yīng)靈敏,精神狀態(tài)良好,毛發(fā)正常,移植瘤組織沒有出現(xiàn)潰爛.

2.2 藥物對U14細(xì)胞移植瘤生長的影響

U14細(xì)胞接種3 d后,部分昆明鼠右側(cè)后腿背部出現(xiàn)肉眼可見移植瘤,接種一周后每組10只昆明小鼠全部成瘤,開始給藥.用藥前,各組間平均腫瘤體積大小無顯著性差異.見表1,模型組的移植瘤生長迅速,給予TAB藥物治療后的昆明小鼠雖然其腫瘤體積仍在增長,但其增長速度較模型組相比明顯緩慢,從第3 d開始,與模型組相比,3-氫化松苓酸B高劑量組(120 mg/kg)及中劑量(80 mg/kg)具有極顯著性差異;至第5 d,與模型組相比,雷帕霉素組和3-氫化松苓酸B各劑量組均具有極顯著性差異.且第11 d處理小鼠稱取瘤重,計算抑瘤率,計算得雷帕霉素組抑瘤率為46%,3-氫化松苓酸B高劑量組的抑瘤率為50.9%,3-氫化松苓酸B中劑量組的抑瘤率為36.8%,3-氫化松苓酸B低劑量組的抑瘤率為30%.TAB高劑量組的抑瘤率較陽性藥組略高.

表1 TAB對U14移植瘤生長的影響(±s,n=10)

表1 TAB對U14移植瘤生長的影響(±s,n=10)

與模型組比較*P＜0.05,**P＜0.01

組別 腫瘤體積/mm3第1 d 第3 d 第5 d 第7 d 第9 d 第11 d瘤重/g抑瘤率/%模型組 296.0±63.1 553.4±66.7 1368.9±118.4 2317.2±285.4 3384.1±332.1 4856.2±357.5 4.8±1.0雷帕霉素組 319.5±81.4 483.7±90.3 794.6±86.5**1211.3±159.9**1655.2±236.6**2253.1±310.3**2.6±0.7**46.0 TAB(40 mg/kg)307.6±77.0 480.4±88.7 970.4±91.5**1817.5±130.1**2482.7±244.5**3423.2±274.7**3.4±0.9**30.0 TAB(80 mg/kg)274.9±77.8 429.3±77.6**854.5±98.3**1523.9±113.7**2259.5±169.6**2905.9±200.4**3.0±1.0**36.8 TAB(120 mg/kg)293.7±48.2 413.8±70.1**779.0±98.8**1259.1±104.4**1645.0±168.0**2132.6±243.7**2.4±0.8**50.9

2.3 TAB對U14移植瘤組織形態(tài)學(xué)的影響

由圖1可見,模型組腫瘤組織細(xì)胞細(xì)胞核增大,核深染,病理性核分裂象多;用雷帕霉素及TAB治療之后,腫瘤細(xì)胞數(shù)量明顯減少,瘤細(xì)胞核分裂程度明顯降低,在一個視野下,可見的正處于分裂期的細(xì)胞個數(shù)明顯減少,并開始出現(xiàn)壞死區(qū)域,而且隨著TAB劑量的增加,壞死區(qū)域面積顯著增加.

圖1 TAB對U14細(xì)胞移植瘤昆明鼠腫瘤組織形態(tài)學(xué)的影響(×10)

2.4 藥物對U14細(xì)胞移植瘤昆明鼠一般情況的影響

用TAB治療后,各組裸鼠的進(jìn)食、飲水及大小便均正常,活動正常,反應(yīng)靈敏,精神狀態(tài)良好,毛發(fā)正常,移植瘤組織沒有出現(xiàn)潰爛.

2.5 TAB對其他生化指標(biāo)的影響

2.5.1 TAB對小鼠臟器指數(shù)的影響

由表2可知,TAB對小鼠的腎臟指數(shù)和胸腺指數(shù)沒有產(chǎn)生較大的影響,模型組與空白組相比,其脾臟指數(shù)及肝臟指數(shù)顯著性升高,TAB治療劑量組與模型組相比,能夠顯著降低小鼠的脾臟指數(shù)及肝臟指數(shù),對腫瘤移植引起的模型組的小鼠脾臟指數(shù)和肝臟指數(shù)的升高產(chǎn)生了逆轉(zhuǎn)效果.

表2 TAB對小鼠臟器指數(shù)的影響(±s,n=10)

表2 TAB對小鼠臟器指數(shù)的影響(±s,n=10)

與空白組比較#P＜0.05,##P＜0.01;與模型組比較*P＜0.05,**P＜0.01

組別 脾臟指數(shù)/% 肝臟指數(shù)/% 胸腺指數(shù)/% 腎臟指數(shù)/%空白組 0.33±0.01 6.04±0.39 0.28±0.05 1.26±0.10模型組 1.26±0.42## 8.08±1.07# 0.23±0.10 1.38±0.13雷帕霉素組 0.66±0.35** 6.19±0.97* 0.28±0.05 1.15±0.12 TAB(40 mg/kg) 0.87±0.25* 6.77±0.82* 0.23±0.08 1.11±0.14 TAB(80 mg/kg) 0.75±0.21* 6.70±0.97* 0.31±0.08 1.15±0.15 TAB(120 mg/kg) 0.79±0.37* 6.59±1.20* 0.26±0.11 1.14±0.26

2.5.2 TAB對小鼠血液生化指標(biāo)的影響

如表3所示,通過對各組小鼠血液中的肌酐(CRE)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(T-CHO)、葡萄糖(Glu)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)含量的測定.結(jié)果顯示模型組小鼠肝功能異常、血脂代謝異常,甘油三酯含量升高,陽性藥能夠調(diào)節(jié)由于腫瘤引起的一些生化指標(biāo)的改變,但是雷帕霉素能夠極顯著性的降低小鼠血清中低密度脂蛋白膽固醇的含量;TAB給藥后肝功能顯著改善,甘油三酯含量下降.但值得注意的是TAB能夠降低血液中葡萄糖,對代謝可能產(chǎn)生一定影響.TAB對腎功能沒有明顯影響.

表3 3-氫化松苓酸B對小鼠血液生化指標(biāo)的影響(±s,n=10)

表3 3-氫化松苓酸B對小鼠血液生化指標(biāo)的影響(±s,n=10)

與空白組比較#P＜0.05,##P＜0.01;與模型組比較*P＜0.05,**P＜0.01

測定指標(biāo) 空白 模型 雷帕霉素 TAB(40 mg/kg)TAB(80 mg/kg)TAB(120 mg/kg)CRE(umol/L)15.51±1.02 15.25±0.53 15.36±0.85 15.03±0.75 15.67±0.53 15.92±0.19 TG(mmol/L) 0.99±0.07 1.96±0.11## 1.92±0.24 1.82±0.05 1.80±0.11 1.60±0.05**T-CHO(mmol/L)3.26±0.01 2.63±0.09#3.48±0.24** 3.04±0.27 3.15±0.62 3.03±0.07 Glu(mmol/L) 7.27±0.48 6.07±0.27##7.14±0.29**5.08±0.02** 5.09±0.17** 4.93±0.03**HDL-C(mmol/L)4.08±0.21 3.19±0.01##1.29±0.06** 2.96±0.19 2.98±0.06 3.03±0.11 LDL-C(mmol/L)1.12±0.11 0.88±0.18 1.34±0.13** 0.99±0.13 1.02±0.10 1.05±0.18 ALT(U/L) 15.21±6.59 53.85±1.54##47.27±2.89*28.13±0.39**30.66±4.79**29.98±1.05**AST(U/L) 37.35±4.20 94.76±0.90##65.82±4.27**61.62±4.09**61.56±3.44**56.21±4.81**

2.6 TAB對昆明小鼠主要臟器的組織形態(tài)學(xué)影響

2.6.1 昆明小鼠心臟組織形態(tài)學(xué)分析

如圖2所示,在光學(xué)顯微鏡下觀察(×10),6組小鼠心肌細(xì)胞形態(tài)正常,心肌纖維排列緊密,排列有序.沒有出現(xiàn)細(xì)胞水腫,未見炎癥細(xì)胞和滲出.

圖2 TAB對心臟組織形態(tài)學(xué)影響

2.6.2 昆明小鼠肝臟組織形態(tài)學(xué)分析

如圖3所示,在光學(xué)顯微鏡下(×10),6組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整,肝細(xì)胞呈放射狀圍繞中央靜脈排列,沒有出現(xiàn)肝細(xì)胞腫脹、變性和壞死,細(xì)胞核呈圓形,大小正常,間質(zhì)未見炎癥細(xì)胞浸潤,組織結(jié)構(gòu)正常.

2.6.3 昆明小鼠脾臟組織形態(tài)學(xué)分析

如圖4所示,在光學(xué)顯微鏡下(×10),空白組小鼠脾臟白髓、紅髓分界清晰(藍(lán)紫色為白髓,紅色為紅髓),模型組白髓數(shù)量相對密集,脾小體面積增大,可能與免疫反應(yīng)增強(qiáng)有關(guān).TAB給藥組白髓區(qū)面積縮小,數(shù)量減少,而紅髓面積增大.

2.6.4 昆明小鼠肺組織形態(tài)學(xué)分析

圖3 TAB對肝臟組織形態(tài)學(xué)影響

圖4 TAB對脾臟組織形態(tài)學(xué)影響

如圖5所示,在光學(xué)顯微鏡下(×10),6組小鼠肺臟各級支氣管和肺泡結(jié)構(gòu)正常,清晰可見,上皮細(xì)胞完整,無缺失;肺泡腔內(nèi)干凈,未見出血,炎性滲出液,肺泡隔無增厚和炎性滲出.

2.6.5 昆明小鼠腎臟組織形態(tài)學(xué)分析

如圖6所示,在光學(xué)顯微鏡下(×40),6組小鼠腎臟組織形態(tài)正常,皮質(zhì)和髓質(zhì)分界清楚,腎小管上皮細(xì)胞形態(tài)正常,未見管型和紅細(xì)胞.

圖5 TAB對肺組織形態(tài)學(xué)影響

圖6 TAB對腎臟組織形態(tài)學(xué)影響

2.6.6 昆明小鼠胸腺組織形態(tài)學(xué)分析

如圖7所示,在光學(xué)顯微鏡下(×10),6組小鼠胸腺小葉清晰可見,細(xì)胞大小正常,排列有序,皮質(zhì)和髓質(zhì)界限清楚.

圖7 TAB對胸腺組織形態(tài)學(xué)影響

3 討 論

宮頸癌是臨床最常見的婦科惡性腫瘤,且是發(fā)病率最高的女性惡性腫瘤之一,在所有女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤患者中,其占比可達(dá)73%～93%.宮頸癌由于其惡性程度高,多易復(fù)發(fā),而且死亡率高,使得當(dāng)前已成為全球性的公共衛(wèi)生問題[1,5].臨床上運(yùn)用順鉑與紫杉醇、博來霉素、阿霉素、長春新堿、異環(huán)磷酰胺、氟尿嘧啶等的一種或幾種聯(lián)合用藥進(jìn)行治療.如順鉑與5-FU化療,對局部晚期宮頸癌進(jìn)行治療,但效果不明顯,甚至?xí)斐赡c胃道等不良反應(yīng)產(chǎn)生.順鉑具有抑制細(xì)胞毒性與細(xì)胞DNA復(fù)制的作用,選擇性較差,在殺滅腫瘤的同時對生長活躍的體內(nèi)正常細(xì)胞也有不同程度的毒性.因此亟待找到一種毒副作用小且療效良好的化療藥物.研究表明3-氫化松苓酸B具有有效、低毒潛質(zhì),具有開發(fā)利用前景,值得深入研究.

3-氫化松苓酸B是以土家族醫(yī)“三元論”為指導(dǎo),采用“反選法”篩選的有效的抗腫瘤藥物[6].研究發(fā)現(xiàn)土家族藥硫磺菌中含有大量3-氫化松苓酸B,而硫磺菌是一種土家族食藥兩用真菌,不僅食用味道鮮美,長期食用能夠強(qiáng)身健體,而且有多種藥用作用,如抗炎和抗腫瘤作用,已經(jīng)有報道表明,硫磺菌菌絲體的粗多糖體內(nèi)也有抑制小鼠Lewis肺癌作用[7].雖然硫磺菌的作用和安全性可能是多成分的綜合作用,但硫磺菌的藥食兩用特性,在一定成程上反映了3-氫化松苓酸B的低毒性.通過U14細(xì)胞體內(nèi)移植瘤實驗,發(fā)現(xiàn)3-氫化松苓酸B可以顯著抑制U14移植瘤在昆明小鼠體內(nèi)的生長,病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn),給藥劑量下3-氫化松苓酸B對小鼠的主要臟器形態(tài)學(xué)未產(chǎn)生影響.表明3-氫化松苓酸B抗腫瘤的有效性和低毒性.