韓曉云，劉 鵬，王 震，范學(xué)紅

（商洛職業(yè)技術(shù)學(xué)院，陜西商洛 726000）

抗生素的應(yīng)用解決了很多醫(yī)學(xué)難題，但是正是由于抗生素較好的抑菌效果，使得抗生素被廣泛濫用，從而引發(fā)了一系列問題，如耐藥菌的產(chǎn)生。耐藥菌的產(chǎn)生給人類公共衛(wèi)生及健康造成了巨大的威脅。當(dāng)前我國抗生素濫用問題尤為嚴(yán)重，每年抗生素總用量約占世界的一半，這使得我國病菌耐藥現(xiàn)象也異常廣泛。其中大腸桿菌的耐藥問題不容忽視，其耐藥率在臨床中呈上升趨勢［1］，且多重耐藥檢出率也較高，給臨床治療帶來很大困難［2］。

研究表明，核桃青皮提取物在體外具有較好的抑菌效果［3-5］，但關(guān)于其體內(nèi)抑菌效果試驗研究甚少。為減少抗生素的使用及減緩耐藥菌株的產(chǎn)生，本試驗首次研究核桃青皮乙醇提取物對致病性大腸桿菌O157∶H7腹瀉模型小鼠的體內(nèi)抑菌效果，為開發(fā)新型抗感染藥物提供依據(jù)。

1 試驗材料與方法

1.1 材料與儀器

大腸桿菌O157∶H7購自中國普通微生物菌種保藏管理中心；大腸桿菌選擇性培養(yǎng)基（麥康凱瓊脂）、乳酸菌選擇性培養(yǎng)基（MRS瓊脂）、腸桿菌選擇性培養(yǎng)基（VRBDA）及雙歧桿菌選擇性培養(yǎng)基（TPY）均購自青島海博生物技術(shù)有限公司。KM小鼠購自陜西省醫(yī)學(xué)實驗動物中心，保持飼養(yǎng)環(huán)境溫度25℃左右，標(biāo)準(zhǔn)小鼠飼料喂養(yǎng)，自由飲水。

PYX-DHS-50X65-BS隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司）；ZHCH-C1106B超凈工作臺（上海智城分析儀器制造有限公司）；YKH-I型液體快速混合器（江西醫(yī)療器械廠）；YX280型手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器（上海三申醫(yī)療器械有限公司）；JA2003電子天平（上海衡際科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 動物試驗設(shè)計 隨機(jī)選取無特定病原體（SPF級）昆明（KM）小鼠60只隨機(jī)分為3組，即Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組，每組20只。Ⅱ組、Ⅲ組連續(xù)7 d中午灌胃大腸桿菌菌液，灌胃體積為10 mL/kg（菌懸液/小鼠體質(zhì)量）［6］；空白對照組灌胃等體積生理鹽水。灌胃7 d后，第8天開始治療，Ⅲ組每天灌胃核桃青皮乙醇提取物，Ⅱ組用生理鹽水作對照，持續(xù)時間為7 d。試驗設(shè)計方案見表1。

表1 小鼠灌胃試驗設(shè)計

1.2.2 灌胃液制備

1.2.2.1 大腸桿菌灌胃液的制備 先將大腸桿菌O157∶H7標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行增菌培養(yǎng)，并繪制菌株的生長曲線圖確定其群體生長的穩(wěn)定期，取穩(wěn)定期（16 h）的大腸桿菌菌液5 000mL，在4℃條件下，離心10min后收集菌體，無菌生理鹽水清洗3次后稱質(zhì)量，向菌體中加入一定體積的無菌生理鹽水，調(diào)整菌濃度為108CFU/mL，4℃儲存待用。

1.2.2.2 核桃青皮乙醇提取物治療液的制備 手工剝下新鮮核桃青皮［7］，采用冷凍干燥法進(jìn)行處理［8］。冷凍條件：壓力為10 Pa，溫度為-45℃，含水率為3.28%。待樣品充分干燥后，進(jìn)行粉碎并過0.425 mm篩網(wǎng)。稱取冷凍干燥的樣品粉末10.00 g，加入200 mL 95%乙醇溶液，65℃下回流提取2 h，將提取物進(jìn)行過濾后再濃縮，再將濃縮液用水定容至1 000 mL，相當(dāng)于生藥含量為10 mg/mL，作為試驗?zāi)敢?。取母?0 mL，用蒸餾水稀釋至生藥含量為1 mg/mL，用于抑菌試驗。

1.2.3 灌胃后小鼠的表象觀測 在對小鼠進(jìn)行試驗過程中，每天觀察記錄3組小鼠的身體狀況（包括小鼠精神狀態(tài)、進(jìn)食狀況、外觀毛發(fā)、糞便形態(tài)），用以評價小鼠的表象特征。

1.2.4 小鼠腸道菌群的檢測

1.2.4.1 糞便采集 每天09：00用逼迫法采糞便，輕輕擠尾巴根部直腸末端，待排糞便后收集于無菌管中；糞便混懸液制備：將采集到的糞便進(jìn)行稱量，再加入相應(yīng)體積的無菌生理鹽水，在混懸儀上充分混合，制成糞便混懸液；糞便混懸液稀釋：將混懸液進(jìn)行10倍梯度稀釋，每個稀釋做3個平行。

1.2.4.2 檢測指標(biāo)及方法 大腸桿菌計數(shù)。采用涂布平板法，將10-4、10-5、10-6、10-7、10-8梯度糞便稀釋液1 mL均勻涂布于麥康凱瓊脂37℃培養(yǎng)10 h，對平板中的顯金屬光澤的紫色菌落進(jìn)行計數(shù)［9］，計算出1 g糞便中的菌含量（CFU/g），結(jié)果以活菌數(shù)常用對數(shù)值表示［10］。

腸桿菌計數(shù)。采用涂布平板法，將10-4、10-5、10-6、10-7、10-8梯度糞便稀釋液1 mL均勻涂布于營養(yǎng)瓊脂37℃培養(yǎng)10 h，對顯紅色且有膽鹽沉淀環(huán)的菌落計數(shù)，計算出1 g糞便中的菌含量（CFU/g），結(jié)果以活菌數(shù)常用對數(shù)值表示。

乳酸菌計數(shù)。采用涂布平板法，將10-6、10-7、10-8、10-9、10-10梯度糞便稀釋液1 mL均勻涂布于MRS瓊脂厭氧環(huán)境下37℃培養(yǎng)10 h，對平板菌落進(jìn)行計數(shù)，計算出1 g糞便中的菌含量（CFU/g），結(jié)果以活菌數(shù)常用對數(shù)值表示。

雙歧桿菌計數(shù)。采用涂布平板法，將10-5、10-6、10-7、10-8、10-9梯度糞便稀釋液1mL均勻涂布于TPY瓊脂厭氧環(huán)境下37℃培養(yǎng)10 h，對平板菌落進(jìn)行計數(shù)，計算出1 g糞便中的菌含量（CFU/g），結(jié)果以活菌數(shù)常用對數(shù)值表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 核桃青皮乙醇提取物對感染大腸桿菌O157∶H7小鼠表象的影響

在灌胃期間，每天觀察試驗小鼠的表象特征。試驗前3 d各組小鼠變化不大，但是在試驗第4天，Ⅱ組和Ⅲ組小鼠出現(xiàn)精神狀態(tài)不佳及少量腹瀉現(xiàn)象，且其毛發(fā)光澤度較Ⅰ組小鼠明顯暗淡，進(jìn)食量也顯著減少，此類表象說明小鼠已經(jīng)發(fā)生病變，造模成功。在試驗第8天開始，Ⅲ組小鼠在灌胃核桃青皮乙醇提取物后，病癥較Ⅱ組有所減輕，進(jìn)食量也有所增加。這說明核桃青皮乙醇提取物對治療感染大腸桿菌O157∶H7的小鼠有一定的抑菌療效。

2.2 核桃青皮乙醇提取物對感染大腸桿菌O157∶H7小鼠腸道微生物數(shù)量的影響

2.2.1 核桃青皮乙醇提取物對感染大腸桿菌O157∶H7小鼠腸道大腸桿菌數(shù)量的影響 從圖1中可以看出，Ⅰ組小鼠體內(nèi)大腸桿菌數(shù)量在試驗期間波動不大，而Ⅱ組與Ⅲ組出現(xiàn)了明顯的變化。在灌胃第3天后，Ⅱ組與Ⅲ組的小鼠腸道內(nèi)的大腸桿菌數(shù)量開始增多，并在灌胃7 d后，出現(xiàn)了升高約3個數(shù)量級的差異。這可能是由于大腸桿菌作為生物腸道內(nèi)的條件致病菌，雖在機(jī)體正常情況下，對人體無害，但是當(dāng)機(jī)體菌群失調(diào)后，它們會隨即轉(zhuǎn)為有害菌開始對機(jī)體造成威脅，使機(jī)體出現(xiàn)腸胃生理功能紊亂的癥狀。另在開始進(jìn)行核桃青皮乙醇提取物灌胃治療后，Ⅲ組小鼠腸道內(nèi)大腸桿菌數(shù)量開始減少，并在治療后第4天數(shù)量大幅下降，達(dá)到了Ⅰ組的正常水平，與Ⅱ組小鼠腸內(nèi)狀況有顯著差異（P＜0.05）。此結(jié)果說明核桃青皮乙醇提取物對腸道內(nèi)致病性大腸桿菌有一定的抑制或殺滅作用。

2.2.2 核桃青皮乙醇提取物對感染大腸桿菌O157∶H7小鼠腸桿菌數(shù)量的影響 從圖2中可以看出，Ⅰ組小鼠體內(nèi)腸桿菌數(shù)量相對較低，且在試驗期間一直維持在同一水平，而Ⅱ組與Ⅲ組均出現(xiàn)了明顯的變化。在灌胃后第2天Ⅱ組與Ⅲ組的小鼠腸道內(nèi)的腸桿菌數(shù)量開始增多，之后每天腸桿菌檢出數(shù)量都在增多，并在灌胃7 d后達(dá)到最高，升高了約4個數(shù)量級。這主要是由于腸桿菌中如變形桿菌等大多屬于條件致病菌，當(dāng)機(jī)體由于進(jìn)入大量致病菌大腸桿菌O157∶H7時，小鼠腸道內(nèi)條件致病菌由正常菌群變成致病菌，一方面通過營養(yǎng)競爭，另一方面通過釋放胺等物質(zhì)發(fā)揮生物拮抗作用，最終使得益生菌數(shù)量大大減少。在開始藥物治療后，Ⅲ組小鼠腸道內(nèi)腸桿菌數(shù)量于試驗第9天開始下降，并在藥物灌胃第15天達(dá)到Ⅰ組的正常水平，與未進(jìn)行治療的Ⅱ組小鼠腸道狀況形成了顯著差異（P＜0.05）。此結(jié)果說明核桃青皮乙醇提取物對腸道內(nèi)腸桿菌有一定的抑制或殺滅作用。

2.2.3 核桃青皮乙醇提取物對感染大腸桿菌O157∶H7小鼠腸道乳酸菌的影響 從圖3中可以看出，Ⅰ組小鼠體內(nèi)乳酸菌數(shù)量相對較高，且在試驗期間波動不大，而Ⅱ組與Ⅲ組同樣出現(xiàn)了明顯的變化。在灌胃后第2天Ⅱ組與Ⅲ組的小鼠腸道內(nèi)的乳酸菌數(shù)量開始減少，之后每天檢出數(shù)量都在減少，并在灌胃7 d后乳酸菌減少了2個數(shù)量級。這也主要是由于致病性大腸桿菌的增多導(dǎo)致了腸道內(nèi)環(huán)境的微生態(tài)平衡遭到破壞，使得乳酸菌等益生菌的生長繁殖因為營養(yǎng)競爭等關(guān)系受到抑制。圖3顯示，在進(jìn)行核桃青皮乙醇提取物進(jìn)行灌胃后Ⅱ組與Ⅲ組的小鼠腸道內(nèi)乳酸菌的數(shù)量也沒有恢復(fù)如初，與Ⅰ組的小鼠腸道乳酸菌狀況有顯著差異（P＜0.05）。這可能是由于核桃青皮乙醇提取物對腸道菌群有廣譜抑菌效果，在抑制致病菌、條件致病菌的過程中，對腸道益生菌也起了抑制作用。

2.2.4 核桃青皮乙醇提取物對感染大腸桿菌O157∶H7小鼠腸道雙歧桿菌的影響 由圖4可知，Ⅰ組小鼠腸道內(nèi)雙歧桿菌數(shù)量相對穩(wěn)定，與Ⅰ相比，Ⅱ與Ⅲ組在對小鼠進(jìn)行大腸桿菌O157∶H7灌胃期間，小鼠腸道內(nèi)雙歧桿菌數(shù)量在逐漸下降，且灌胃時間越長，數(shù)量減少得越多，這主要是由于大腸桿菌灌胃后，短時間大腸桿菌數(shù)量急劇增多，破壞了小鼠腸道內(nèi)的微環(huán)境，取代了腸道內(nèi)最初優(yōu)勢菌，成為最新優(yōu)勢菌，并通過營養(yǎng)競爭抑制了雙歧桿菌的生長繁殖。進(jìn)行核桃青皮乙醇提取物藥物治療后，雙歧桿菌數(shù)量也未能明顯增加，這可能是由于核桃青皮乙醇提取物具有廣譜抑菌作用，對雙歧桿菌的生長繁殖也發(fā)揮了抑制作用導(dǎo)致的結(jié)果。

3 結(jié)論與討論

呂海寧等研究發(fā)現(xiàn)核桃青皮對大腸桿菌和枯草芽孢桿菌具有顯著的抑菌活性［11］，張衛(wèi)星等研究表明核桃青皮提取物具有抗菌和抗氧化活性［12-13］，丁存寶等研究發(fā)現(xiàn)，核桃青皮烘干粉末95%乙醇萃取液對白色葡萄球菌、傷寒桿菌具有一定的抑菌作用［14］。唐春麗等研究發(fā)現(xiàn)核桃青皮提取物具有很強(qiáng)的抗菌和抗真菌效果［15-16］。本試驗首先對小鼠進(jìn)行大腸桿菌O157∶H7灌胃造模，在造模第4天試驗小鼠出現(xiàn)病癥，說明造模成功。隨后用核桃青皮乙醇提取物進(jìn)行灌胃治療，小鼠病癥減輕。試驗期間對小鼠腸道內(nèi)大腸桿菌、腸桿菌等條件致病菌的數(shù)量進(jìn)行計數(shù)，結(jié)果表明在進(jìn)行大腸桿菌O157∶H7灌胃期間，條件致病菌數(shù)量呈上升趨勢，且上升明顯，但在進(jìn)行核桃青皮乙醇提取液灌胃治療后，條件致病菌數(shù)量開始下降，且在灌胃7 d后回到初始水平，與Ⅰ組小鼠無差異。小鼠臨床病癥及體內(nèi)條件致病菌數(shù)量的檢測結(jié)果都說明該提取物對治療大腸桿菌O157∶H7感染引起的腹瀉有一定的療效，這與前人的體外試驗有抑菌作用的結(jié)果相一致。但是核桃青皮提取物治療腹瀉的機(jī)制是否是由單一的抑菌效果所導(dǎo)致的，又或者通過刺激腸道黏膜增強(qiáng)黏膜相關(guān)免疫的屏障作用來協(xié)同抑菌的，還須要做深入研究。

乳酸菌、雙歧桿菌等屬于生物腸道中益生菌，他們的存在可以增強(qiáng)腸道黏膜免疫屏障作用，調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，預(yù)防和治療腸道感染。須要注意的是，試驗期間對小鼠腸道內(nèi)乳酸菌、雙歧桿菌等益生菌的數(shù)量進(jìn)行計數(shù)，結(jié)果表明在進(jìn)行大腸桿菌O157∶H7灌胃期間，乳酸菌、雙歧桿菌等益生菌數(shù)量呈下升趨勢，且下降明顯，且在進(jìn)行核桃青皮乙醇提取液灌胃治療后，益生菌數(shù)量下降趨勢得到一定的改善，但在灌胃治療7 d后，益生菌數(shù)量亦沒有顯著提升，與Ⅰ組小鼠體內(nèi)益生菌熟練形成顯著差異，這說明該提取物具有廣譜抗菌作用，在抑制大腸桿菌O157∶H7生長繁殖的同時，對腸道內(nèi)益生菌也發(fā)揮了抑制作用。因此核桃青皮乙醇提取液在以后用作新興醫(yī)療抗感染藥物時要考慮聯(lián)合使用益生菌產(chǎn)品，來幫助病人的腸道微生態(tài)環(huán)境盡快恢復(fù)平衡［17］。