易秋雪，張敬法,2，柳 林

0引言

糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)是糖尿病最常見的并發(fā)癥之一，是世界范圍內(nèi)工作人群主要的致盲疾病[1]。DR被認為是視網(wǎng)膜微血管疾病，但隨著研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜內(nèi)，除微血管病變外，其他類型的細胞也發(fā)生了相應的改變，如星形膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞、Müller細胞和神經(jīng)元等也參與了DR的發(fā)生發(fā)展。因此，目前認為，DR除了微血管病變外，還包括視網(wǎng)膜神經(jīng)元病變及中低度炎癥反應。小膠質(zhì)細胞作為視網(wǎng)膜中主要的免疫細胞，監(jiān)控整個視網(wǎng)膜的微環(huán)境變化，在參與炎癥反應時產(chǎn)生大量的炎癥因子，并且有多種特異性受體可以和其他細胞相互反應。所以，基于已知的DR發(fā)病機制和小膠質(zhì)細胞的功能特性，我們認為小膠質(zhì)細胞在DR的發(fā)病過程中起到重要的作用。本文旨在綜述小膠質(zhì)細胞的特性，DR發(fā)生發(fā)展過程中小膠質(zhì)細胞如何被激活以及激活的小膠質(zhì)細胞如何參與DR發(fā)生發(fā)展過程中視網(wǎng)膜的微血管病變和神經(jīng)退行性病變。

1小膠質(zhì)細胞在視網(wǎng)膜中的作用及變化

小膠質(zhì)細胞源自造血干細胞，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的巨噬細胞；同時，小膠質(zhì)細胞還可以自我更新，壽命較長[2]。在健康的視網(wǎng)膜中，分支狀的小膠質(zhì)細胞主要分布于內(nèi)層視網(wǎng)膜，包括神經(jīng)纖維層、神經(jīng)節(jié)細胞層、內(nèi)叢狀層及外叢狀層，負責監(jiān)控整個視網(wǎng)膜內(nèi)微環(huán)境的變化[3]。在正常視網(wǎng)膜內(nèi)，分支狀的小膠質(zhì)細胞處于靜息狀態(tài)，但參與了許多生理過程以維持視網(wǎng)膜內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，如小膠質(zhì)細胞的突觸處于活動狀態(tài)，不斷地伸長縮短達到監(jiān)控整個微環(huán)境的目的[4]。通過細胞間的相互作用，分泌細胞因子和生長因子，小膠質(zhì)細胞參與正常視網(wǎng)膜生長發(fā)育、神經(jīng)發(fā)生、突觸修剪、血管形成等過程[5]。

作為神經(jīng)膠質(zhì)細胞中的一員，小膠質(zhì)細胞對正常神經(jīng)元的成熟起到了重要作用。在神經(jīng)元發(fā)育過程中，小膠質(zhì)細胞通過CX3CR1受體(又稱fractalkine受體)與神經(jīng)元的突觸不斷接觸，監(jiān)控突觸的狀態(tài)，并通過補體標記的方式對突觸進行適當修剪，保證神經(jīng)元的正常發(fā)育[6]。不僅如此，小膠質(zhì)細胞還參與了血管形成的過程。在氧誘導視網(wǎng)膜病變的大、小鼠動物模型中發(fā)現(xiàn)，在血管生成過程中小膠質(zhì)細胞與血管發(fā)生端密切接觸；利用氯膦酸鹽脂質(zhì)體清除小膠質(zhì)細胞后，視網(wǎng)膜內(nèi)血管密度和面積均有所減少。不僅如此，生理狀態(tài)下，小膠質(zhì)細胞還會分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子和抗炎因子，如胰島素樣生長因子(IGF-1)[7]。表明生理狀態(tài)下，小膠質(zhì)細胞對于神經(jīng)及血管的發(fā)育都有極其重要的作用。

病理情況下，膠質(zhì)細胞的激活主要由胞外環(huán)境改變引起，如組織間液的分子濃度改變、神經(jīng)元損傷及細胞凋亡等。小膠質(zhì)細胞有各種特異性受體，可以感知不同的病理生理變化，如糖基化終產(chǎn)物受體(RAGE受體)感知糖基化終末產(chǎn)物(AGE)，嘌呤受體P2Y家族感知胞外三磷酸腺苷(ATP)的濃度改變，清道夫受體結合各類可吞噬的蛋白，Toll樣受體(TLR)感知病原體成分并介導炎癥反應，鉀離子通道受體感知胞外鉀離子濃度的變化，血管緊張素受體1(AT1)感知腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)激活引起的血管緊張素濃度的變化等[8-12]。激活的小膠質(zhì)細胞表型和功能都發(fā)生了一系列變化，根據(jù)功能的不同可分為促炎M1型和抗炎M2型[13]。M1型小膠質(zhì)細胞多由Th1細胞因子如干擾素γ或脂多糖誘導，由小胞體、長突觸、分枝狀逐步轉(zhuǎn)變?yōu)榇蟀w、短突觸、阿米巴樣，增殖活躍，遷移性增強，可以迅速遷移至損傷部位，促炎因子(如TNF-α、IL-1β、IL-6等)表達及釋放增多，具有一定的細胞毒性。M2型小膠質(zhì)細胞多由Th2細胞因子(如IL-4、IL-10、IL-13)誘導，細胞維持長突觸形態(tài)，增殖性和遷移性不強，主要執(zhí)行吞噬功能且表達高水平IL-10。長期炎癥刺激下，M1/M2型小膠質(zhì)細胞的平衡被打破，小膠質(zhì)細胞逐漸轉(zhuǎn)化為M1型，釋放大量的炎癥因子，參與視網(wǎng)膜疾病的發(fā)生發(fā)展。

2小膠質(zhì)細胞在DR中的激活

近年來，小膠質(zhì)細胞在DR中的作用研究較多。研究表明高血糖、視網(wǎng)膜缺血缺氧、血脂異常和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激等均可激活小膠質(zhì)細胞，從而參與DR的發(fā)病過程[14]。在DR中可觀察到小膠質(zhì)細胞一系列的形態(tài)變化。鏈脲佐菌素(STZ)誘導的糖尿病大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)小膠質(zhì)細胞的形態(tài)由分支狀轉(zhuǎn)變?yōu)榘⒚装蜆?，表現(xiàn)為突觸變短、胞體變大、數(shù)量增多，并遷移到外層視網(wǎng)膜[15]。在糖尿病患者的視網(wǎng)膜中也觀察到小膠質(zhì)細胞的數(shù)量及分布發(fā)生改變，小膠質(zhì)細胞不僅數(shù)量增加，而且聚集在微血管瘤和視網(wǎng)膜出血病灶的周圍。糖尿病黃斑水腫患者的視網(wǎng)膜及視網(wǎng)膜下腔均發(fā)現(xiàn)了大量的小膠質(zhì)細胞[16]。除了形態(tài)上的改變，小膠質(zhì)細胞M1/M2型在DR中的活化呈現(xiàn)出動態(tài)變化過程，隨著疾病進程互相轉(zhuǎn)化[17]。db/db糖尿病小鼠模型中，早期DR即發(fā)現(xiàn)M2型抗炎小膠質(zhì)細胞的存在。然而，隨著糖尿病的進展，M2型小膠質(zhì)細胞數(shù)量逐漸減少，而M1型小膠質(zhì)細胞變多，且促炎因子如TNF-α、IL-1β和IL-6、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶1(caspase-1)和NLRP3炎癥小體的表達也增多。當DR進展至較晚期，M1型小膠質(zhì)細胞的數(shù)量又出現(xiàn)回落[17-18]。上述證據(jù)表明小膠質(zhì)細胞參與了DR的發(fā)生發(fā)展，此外，DR視網(wǎng)膜中長期中低度炎癥反應也促進了小膠質(zhì)細胞的轉(zhuǎn)變[19]。

2.1小膠質(zhì)細胞在DR中對神經(jīng)元變性的影響在DR中，活化的M1型小膠質(zhì)細胞分泌大量神經(jīng)毒性因子，如半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)、金屬基質(zhì)蛋白酶(MMP)、NLRP3炎癥小體和一氧化氮(NO)等[20]。在病理情況下(如DR)，分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子的小膠質(zhì)細胞數(shù)量逐漸減少，分泌神經(jīng)毒性因子的M1型小膠質(zhì)細胞逐漸增多，造成神經(jīng)營養(yǎng)因子和神經(jīng)毒性因子的失衡，從而導致神經(jīng)元損傷。特別是細胞外谷氨酸蓄積導致離子型谷氨酸受體[主要包括α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸(AMPA)和N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體]過度活化，引起神經(jīng)元細胞內(nèi)鈣超載和細胞死亡[21]。體外高糖條件培養(yǎng)小膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元，發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細胞的嘌呤能受體上調(diào)，導致鈣內(nèi)流促進相關炎癥介質(zhì)的釋放，進而引起神經(jīng)元凋亡[22]。另外，有研究報道，將損傷的神經(jīng)元培養(yǎng)物與M1和M2型小膠質(zhì)細胞分別進行共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)相比M1型小膠質(zhì)細胞，M2型小膠質(zhì)細胞能夠吞噬更多的受損神經(jīng)元[23]。因此，在DR中神經(jīng)元損傷和小膠質(zhì)細胞活化之間的關系尚需深入研究。

2.2小膠質(zhì)細胞在DR中對血-視網(wǎng)膜屏障的影響健康的視網(wǎng)膜擁有2套脈管系統(tǒng)供應，即視網(wǎng)膜中央動脈和脈絡膜動脈。視網(wǎng)膜中央動脈供應內(nèi)層視網(wǎng)膜，大血管位于內(nèi)界膜下方，深層毛細血管網(wǎng)位于外叢狀層與內(nèi)核層交界。血管內(nèi)皮細胞間形成緊密連接，內(nèi)皮細胞被周細胞覆蓋，血管外圍包饒Müller細胞和星形膠質(zhì)細胞，共同構成血-視網(wǎng)膜內(nèi)屏障[24]。外層視網(wǎng)膜本身沒有血管，光感受器對營養(yǎng)和氧氣的需求量較高，由血供豐富的脈絡膜毛細血管供應。營養(yǎng)物質(zhì)通過視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)細胞以跨膜主動轉(zhuǎn)運及胞旁途徑的方式從脈絡膜供應外層視網(wǎng)膜。同時，RPE細胞間的緊密連接構成了血-視網(wǎng)膜外屏障。RPE細胞的緊密連接復合物和細胞膜蛋白的不均勻分布，有效地阻止水和蛋白質(zhì)從脈絡膜進入視網(wǎng)膜下腔，并促使視網(wǎng)膜下腔內(nèi)的水沿滲透壓梯度排至脈絡膜。在DR中，活化的小膠質(zhì)細胞對視網(wǎng)膜內(nèi)、外屏障均有影響。

2.2.1小膠質(zhì)細胞對血-視網(wǎng)膜內(nèi)屏障的影響小膠質(zhì)細胞參與血-視網(wǎng)膜內(nèi)屏障的破壞，包括緊密連接蛋白的改變，細胞通透性的改變以及內(nèi)皮細胞和周細胞的丟失等。DR中，小膠質(zhì)細胞分泌TNF-α，通過蛋白激酶C(PKC)激活NF-κB通路降低緊密連接蛋白ZO-1和claudin-5的表達，并改變其在視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞中的分布[25]。同時，小膠質(zhì)細胞產(chǎn)生的MMP(如MMP-2、MMP-9)可以降解occludin[26]。另外，小膠質(zhì)細胞在高糖環(huán)境下產(chǎn)生IL-6誘導occludin和ZO-1下調(diào)，同時激活STAT3通路促進血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)產(chǎn)生[27]。caspase-1可以激活并調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細胞分泌IL-1β和VEGF[28]。VEGF作為DR進展的重要因子，可通過增加質(zhì)膜囊泡關聯(lián)蛋白(PLVAP)參與的跨內(nèi)皮蛋白轉(zhuǎn)運誘導細胞通透性增加[29]。VEGF的升高進一步促進了DR中視網(wǎng)膜新生血管的產(chǎn)生[30]。DR視網(wǎng)膜內(nèi)AGE持續(xù)升高，與小膠質(zhì)細胞表面的RAGE結合，不僅激活NADPH氧化酶產(chǎn)生大量活性氧產(chǎn)物(ROS)，加重了視網(wǎng)膜內(nèi)的氧化應激，而且增加了視網(wǎng)膜血管的通透性，提示AGE-RAGE通路參與了DR血-視網(wǎng)膜屏障的破壞[31]。激活的小膠質(zhì)細胞分泌TNF-α提高了caspase-3的活性，誘導血管內(nèi)皮細胞的凋亡[32]。小膠質(zhì)細胞合成的誘導型一氧化氮合酶(iNOS)可以通過鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶(CAMK Ⅱ)誘導周細胞丟失或凋亡，分泌的MMP-2使細胞外基質(zhì)降解[33]。

2.2.2小膠質(zhì)細胞對血-視網(wǎng)膜外屏障的影響RPE細胞功能受損導致血-視網(wǎng)膜外屏障的破壞在DR中已經(jīng)被證實，但小膠質(zhì)細胞和血-視網(wǎng)膜外屏障的破壞是否有明確的因果關系尚不明確。在糖尿病大鼠及小鼠模型中，RPE細胞層中發(fā)現(xiàn)有小膠質(zhì)細胞的遷移，提示激活的小膠質(zhì)細胞可能以跨色素上皮細胞的方式向視網(wǎng)膜外遷移[34]。這說明小膠質(zhì)細胞本身及其釋放的炎癥因子可能對RPE細胞的屏障功能有一定的影響。激活的小膠質(zhì)細胞產(chǎn)生氧化應激產(chǎn)物，而氧化應激產(chǎn)物可以導致局灶或彌散性RPE屏障功能障礙[35]。另外，小膠質(zhì)細胞分泌的促炎因子也參與了血-視網(wǎng)膜外屏障的破壞，如TNF-α可以通過激活p38 MAPK通路直接影響RPE細胞ZO-1的分布，IL-1β則直接或通過激活其他因子誘導下調(diào)occludin和上調(diào)claudin-1表達，MMP特別是活化的MMP-9被氧化應激產(chǎn)物激活后導致occludin的水解[34，36-37]。DR中小膠質(zhì)細胞分泌的炎癥因子可以破壞RPE細胞的屏障功能，但小膠質(zhì)細胞是否能夠通過細胞間的相互作用改變RPE細胞的功能還需要深入研究。

3 DR治療對小膠質(zhì)細胞的作用

3.1抗VEGF藥物大量證據(jù)表明，阻斷VEGF通路對新生血管的形成有強烈的抑制作用。但是，阻斷小膠質(zhì)細胞的VEGF通路對其功能的影響尚不清楚。最近的一項研究表明，阻斷血管內(nèi)皮細胞生長因子受體VEGFR1和VEGFR2可以減少激光誘導的脈絡膜新生血管(CNV)中小膠質(zhì)細胞的浸潤[38]。該研究發(fā)現(xiàn)VEGFR1在CNV早期表達，而VEGFR2在晚期表達。阻斷VEGFR1在早期和晚期都抑制了小膠質(zhì)細胞的浸潤，而阻斷VEGFR2僅在晚期抑制了小膠質(zhì)細胞的浸潤。此外，使用抗VEGF藥物后，視網(wǎng)膜內(nèi)的多種細胞因子和趨化因子表達均有所下降[39]。這些證據(jù)表明小膠質(zhì)細胞可能是抗VEGF藥物治療DR的一個靶細胞。然而，最近的一項實驗表明，對大鼠進行單次玻璃體腔注射貝伐單抗或者等量的藥物溶劑，視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細胞密度顯著增加，多次玻璃體腔注射后小膠質(zhì)細胞的密度繼續(xù)增加[40]。提示我們小膠質(zhì)細胞的激活可能不是因為特定的藥物種類，而是對玻璃體腔注射眼損傷的反應。既往也有研究發(fā)現(xiàn)，玻璃體腔注射貝伐單抗引起小膠質(zhì)細胞的激活，比其他抗VEGF抗體的免疫應答更強[41]。在DR中抗VEGF藥物對小膠質(zhì)細胞功能的影響尚無定論。

3.2糖皮質(zhì)激素糖皮質(zhì)激素具有強效抗炎的作用。眼內(nèi)常用的糖皮質(zhì)激素包括曲安奈德(TA)、緩釋型地塞米松眼內(nèi)植入物(Ozurdex)和緩釋型氟輕松眼內(nèi)植入物(Retisert)。糖皮質(zhì)激素治療DR的詳細機制還未完全闡明，但已發(fā)現(xiàn)其通過多種機制發(fā)揮作用，包括下調(diào)RPE細胞VEGF的表達和其他炎癥因子的表達[42]。在DR中糖皮質(zhì)激素如何影響小膠質(zhì)細胞尚不清楚，但在其他模型中糖皮質(zhì)激素對小膠質(zhì)細胞的作用已有大量報道。在NMDA誘導的青光眼模型中，注射TA減少了活化小膠質(zhì)細胞的數(shù)量[43]。而在部分敲除Müller細胞的視網(wǎng)膜變性模型中，注射TA可減少光感受器的變性和小膠質(zhì)細胞的活化。此外，TA抑制了TNF-α的表達和p38/應激活化蛋白激酶(p38/SAPK)通路的激活[44]。然而這些證據(jù)尚不能確定是否能夠通過TA單獨抑制小膠質(zhì)細胞引起的改變。體外實驗發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細胞有特定的糖皮質(zhì)激素受體(GR)，與糖皮質(zhì)激素結合后能抑制細胞增殖[45]。視網(wǎng)膜脫離模型中，玻璃體腔注射地塞米松顯著減少了小膠質(zhì)細胞的數(shù)量，同時光感受器細胞凋亡減少[46]。急性腦組織損傷誘導的小膠質(zhì)細胞激活能被地塞米松有效抑制，主要體現(xiàn)在小膠質(zhì)細胞增殖減少、遷移變慢以及炎癥因子表達下調(diào)[47]。在帕金森病模型中，小膠質(zhì)細胞的GR表達降低，研究人員將小膠質(zhì)細胞GR基因敲除后，發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細胞通過持續(xù)激活NF-κB通路上調(diào)鐸樣受體9(TLR9)和TNF-α的表達[48-49]。說明GR受體可以減少小膠質(zhì)細胞的反應性，GR受體的失調(diào)可能導致持續(xù)炎癥介導神經(jīng)元損傷。另外，在S334ter-4大鼠視網(wǎng)膜變性模型中，玻璃體腔注射氟輕松后活化的小膠質(zhì)細胞數(shù)量減少了4倍，iNOS、COX-2和TNF-α的含量也有所下降[50]。因此，糖皮質(zhì)激素作為抗炎藥物，抑制了小膠質(zhì)細胞的活化，減弱促炎介質(zhì)的表達，對視網(wǎng)膜整體都具有保護作用。

4結論和展望

目前，許多研究已證實小膠質(zhì)細胞在DR中發(fā)揮重要作用。在DR中，小膠質(zhì)細胞被激活，形態(tài)由分支狀轉(zhuǎn)為阿米巴樣，增殖和遷移能力增強，分泌大量促炎因子并與其他細胞發(fā)生相互作用，進而參與視網(wǎng)膜神經(jīng)元病變、血-視網(wǎng)膜屏障破壞和中低度炎癥反應。小膠質(zhì)細胞參與的慢性炎癥可導致神經(jīng)毒性因子的持續(xù)釋放和神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達下降，誘導了早期DR神經(jīng)元的凋亡，凋亡的神經(jīng)元進一步激活小膠質(zhì)細胞并被其吞噬。小膠質(zhì)細胞還通過下調(diào)多種緊密連接蛋白、誘導內(nèi)皮細胞和周細胞的凋亡，引起血-視網(wǎng)膜內(nèi)屏障功能的破壞。在小膠質(zhì)細胞分泌的眾多炎癥因子中，每種因子的作用機制都不相同，其發(fā)揮的具體作用仍需更多的實驗來證實。

既往關于小膠質(zhì)細胞與RPE細胞相互作用的研究較少，最新的一些研究成果顯示，小膠質(zhì)細胞在DR中可以遷移至RPE細胞層，導致炎癥因子的表達上調(diào)。但研究小膠質(zhì)細胞與RPE細胞相互作用的難點在于對RPE細胞層進行免疫熒光染色時，難以區(qū)別脈絡膜來源的巨噬細胞和視網(wǎng)膜來源的小膠質(zhì)細胞。巨噬細胞和小膠質(zhì)細胞的表面抗原相似，流式細胞術通過多抗原的標記才可進行區(qū)分。近來有許多研究團隊在探索如何特異性地標記小膠質(zhì)細胞，但目前還沒有很好的手段可以做到這一點。

此外，小膠質(zhì)細胞對DR治療的反應尚未得到充分研究。抗VEGF藥物雖然可以通過受體抑制小膠質(zhì)細胞的浸潤和遷移，但玻璃體腔注射也會引起小膠質(zhì)細胞的反應，多次注射引起的反應性更高，這種反應是否造成不良后果尚無相關報道。糖皮質(zhì)激素作為抗炎藥物對視網(wǎng)膜整體包括小膠質(zhì)細胞都有保護作用，不同類型的糖皮質(zhì)激素的作用不盡相同，但值得注意的是小膠質(zhì)細胞的GR在其他疾病模型中起著十分重要的作用，尤其是一些神經(jīng)變性的疾病模型。這意味著糖皮質(zhì)激素的應用除了有抗炎、減輕視網(wǎng)膜水腫的作用外，可能還具有減緩DR中神經(jīng)變性的潛能。這些假設都需要在細胞實驗和動物實驗中證實。考慮到小膠質(zhì)細胞與其他細胞相互作用，通過影響接觸細胞的功能和結構從而發(fā)揮作用，所以抑制小膠質(zhì)細胞的活化可以減輕對多種細胞或微環(huán)境的繼發(fā)損害從而改善DR。未來，探索涉及到DR多個發(fā)病機制的治療手段應當是DR治療研究的重點。