周志疆，張 楨，蔣潤(rùn)枝，惠林沖，程立寶*

（1.江蘇豐收大地種業(yè)發(fā)展有限公司，江蘇 鹽城 224000；2.揚(yáng)州大學(xué)，江蘇 揚(yáng)州 225000）

蓮藕是多年生宿根水生草本植物，因其豐富的營(yíng)養(yǎng)成分和較高的保健作用，成為深受人們喜愛(ài)的水生蔬菜之一[1]。近幾年，由于對(duì)蓮藕加工產(chǎn)品的不斷開(kāi)發(fā)利用，蓮藕已成為我國(guó)重要的出口創(chuàng)匯蔬菜之一[2]。荷花花色艷麗、香味高雅，是中國(guó)園林中重要的水景布置植物材料。蓮因其藥食兼用和觀賞價(jià)值，深受廣大人民喜愛(ài)[3]。

植物在受鹽脅迫時(shí)，通過(guò)一系列的細(xì)胞滲透壓和離子平衡途經(jīng)降低或抵消鹽分的傷害，以維持正常生長(zhǎng)發(fā)育的行為稱作植物的耐鹽性[4]。目前，有關(guān)植物耐鹽性鑒定和品種篩選的研究有很多。植物的耐鹽性是植物體內(nèi)一系列因素綜合作用的結(jié)果，鹽脅迫下，植物根系總吸收面積受到抑制，隨著鹽脅迫時(shí)間的不斷增加，根系吸收能力持續(xù)下降，導(dǎo)致光合速率下降，植物葉綠素含量不斷降低。正常生長(zhǎng)狀態(tài)下，植物活性氧的形成和消除處于動(dòng)態(tài)平衡，植物遭受鹽脅迫后，導(dǎo)致自由基積累，引起植物氧化損傷，但是超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化物酶（POD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）等作為植物體內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)的重要組成部分，能夠有效加強(qiáng)活性氧清除能力，緩解鹽對(duì)植物的傷害。根系活力、酶活性、葉綠素含量、質(zhì)膜相對(duì)透性等生理指標(biāo)均可以衡量植物受到鹽脅迫后的傷害，這些單一生理指標(biāo)存在差異性；所以，很難用單一的某個(gè)生理指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)植物的耐鹽性。

近年來(lái)，不斷惡化的土壤環(huán)境制約著農(nóng)作物的生長(zhǎng)發(fā)育，土壤鹽漬化是土壤生產(chǎn)力發(fā)生劣變的常見(jiàn)現(xiàn)象，我國(guó)土壤鹽漬化已經(jīng)嚴(yán)重制約了農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。調(diào)查表明，在鹽漬化較高的地區(qū)，通過(guò)栽培蓮藕，既能取得一定的經(jīng)濟(jì)效益，又能達(dá)到以水洗鹽、以水壓鹽的目的，同時(shí)改良土壤環(huán)境。到目前為止，國(guó)內(nèi)外關(guān)于蓮藕耐鹽性狀的研究較少，本試驗(yàn)通過(guò)綜合評(píng)價(jià)篩選蓮藕耐鹽資源，以期為設(shè)施鹽漬化土壤和沿海灘涂地區(qū)選育適合栽培的耐鹽蓮藕新品種提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

以揚(yáng)州大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院水生蔬菜實(shí)驗(yàn)室保存的E1、E2、E3、E4、H2、H5、H8蓮藕資源為試驗(yàn)材料。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)方案

2017年5月，于揚(yáng)州大學(xué)水生蔬菜試驗(yàn)基地防雨棚內(nèi)準(zhǔn)備長(zhǎng)×寬×高分別為60 cm×40 cm×30 cm且鋪2層0.08 mm厚的塑料薄膜的泡沫箱，每個(gè)泡沫箱中裝土0.048 m3，種植4株種藕后裝滿水，每個(gè)蓮藕資源種植9箱。種藕大小基本一致，且?guī)ы斞俊４徟嘿橘肭o長(zhǎng)出7、8條時(shí)，倒出泡沫箱中的水，替換成濃度為0.6%NaCl溶液（通過(guò)多年的研究發(fā)現(xiàn)，NaCl濃度過(guò)低，處理后蓮藕植株的表型變化不明顯，濃度過(guò)高，植株全部死亡，0.6%NaCl溶液恰好能夠區(qū)分蓮藕的耐鹽能力），體積為20 L，此后每天觀察記錄長(zhǎng)勢(shì)，第5天進(jìn)行鹽害指數(shù)調(diào)查，對(duì)照為等體積清水處理。為了進(jìn)一步驗(yàn)證蓮藕資源的耐鹽特性，同樣利用上述0.6%NaCl處理蓮藕資源，在第5天對(duì)每個(gè)蓮藕資源的葉和根進(jìn)行隨機(jī)取樣，測(cè)定蓮藕資源的質(zhì)膜相對(duì)透性、丙二醛、SOD和POD活性、根系活力及葉綠素含量（重復(fù)3次），通過(guò)計(jì)算隸屬函數(shù)值，區(qū)分蓮藕不同資源的耐鹽性。

1.2.2 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.2.2.1 不同蓮藕資源鹽害指數(shù)調(diào)查

利用0.6%NaCl處理蓮藕資源，之后5d內(nèi)，每天觀察并統(tǒng)計(jì)蓮藕葉片形狀、顏色和受害癥狀。按照表1進(jìn)行分級(jí)，然后根據(jù)如下公式計(jì)算鹽害指數(shù)：

1.2.2.2 生理指標(biāo)的測(cè)定

葉綠素含量的測(cè)定參照李合生等[6]的方法。稱0.2 g研磨成粉的蓮藕葉片，加入裝有25 mL 95%乙醇的50 mL試管中，混勻后將試管放置于黑暗中2 h。652 nm波長(zhǎng)下測(cè)定上清液的吸光值。試驗(yàn)均采取3次重復(fù)。公式如下：

式中V為提取液總量，W為葉片鮮質(zhì)量。

丙二醛含量的測(cè)定參照李合生等[6]的方法。稱取0.2 g在液氮狀態(tài)下研磨成粉的蓮藕葉片，加入2 mL 5%的三氯乙酸溶液后于震蕩器上充分混勻，12 000 r/min離心20 min，提取上清液。吸取1.0 mL離心的上清液，加入1.0 mL 0.6%硫代巴比妥酸（TBA）溶液，混勻于沸水浴上反應(yīng)10 min，迅速冷卻后取上清液4 000 r/min離心10 min。于450 、532、600 nm波長(zhǎng)下測(cè)定上清液吸光值。試驗(yàn)均采取3次重復(fù)。公式如下：

式中，VT為提取液體積，V1為測(cè)定用提取液體積，G為材料鮮質(zhì)量。

SOD活性的測(cè)定參照張志良等[7]的方法。稱取0.3 g在液氮狀態(tài)下研磨成粉的蓮藕葉片，加入2 mL磷酸緩沖液，緩沖液的pH值為7.8。12 000 r/min 4 ℃離心20 min，提取上清液，并于低溫保存?zhèn)溆谩Ｔ?0 mL離心管中加入2 mL磷酸緩沖液、104 mmol/L甲硫氨酸（Met）溶液0.5 mL、300 umol/L氮藍(lán)四唑（NBT）溶液 1 mL、0.8 mol/L EDTA-2Na溶液0.5 mL、320 umol/L核黃素50 uL、上清液50 uL；對(duì)照管加磷酸緩沖液。混勻后將一支對(duì)照管置暗處作空白對(duì)照，利用4 000 lx的熒光燈照射其余各管30 min，待各管溶液顏色變黑褐后，用黑紙遮光終止反應(yīng)。以不照光的對(duì)照管為空白對(duì)照，在560 nm波長(zhǎng)下比色測(cè)OD值，試驗(yàn)均采取3次重復(fù)。公式如下：

式中，ACK為光照下對(duì)照管的吸光值；AE為樣品管的吸光度；V為樣品液總體積；VT為測(cè)定時(shí)樣品用量；W為樣品鮮質(zhì)量。

POD活性的測(cè)定按表2加入各種試劑。在樣品管中加10 uL 0.04 mol/L過(guò)氧化氫溶液，立刻搖勻，在470 nm處測(cè)OD值，讀出第2分鐘、第3分鐘的OD值。公式如下：

式中，A470為反應(yīng)期間某時(shí)刻的吸光度值；△A470為反應(yīng)時(shí)間內(nèi)吸光度值的變化；W為樣品鮮質(zhì)量；t為反應(yīng)時(shí)間；VT為提取酶液總體積；Vs為酶液用量。

表1 蓮藕鹽處理后葉片受害分級(jí)

表2 各試管中需要加入試劑的量mL

根系活力測(cè)定參照張志良等[7]的方法。在稱量皿中加入0.8 g蓮藕根樣品，加入10 mL 0.4%氯代三苯基四氮唑（TTC）溶液和磷酸緩沖液的等量混合液，讓根充分浸沒(méi)在溶液內(nèi)，于37 ℃下暗保溫2 h后再加入2 mL濃度為1 mol/L的硫酸，以停止反應(yīng)。對(duì)照處理先加硫酸，后加樣品，其他操作同上。在20 mL試管中加入吸干水分的根，并加10 mL甲醇，密封放于避光處?kù)o置2 h，待根變?yōu)榘咨珪r(shí)，在波長(zhǎng)485 nm分光光度計(jì)下比色，以空白對(duì)照作參數(shù)測(cè)出吸光度，四氮唑還原量表示根系活力強(qiáng)弱，試驗(yàn)均采取3次重復(fù)。公式如下：

質(zhì)膜相對(duì)透性參照張志良等[7]的方法。用無(wú)離子水洗凈0.2 g鮮樣葉片，剪碎放入已加入20 mL無(wú)離子水的50 mL試管，振蕩30 min后于室溫下靜置30 min，用DDBJ-350型電導(dǎo)率儀測(cè)定溶液的電導(dǎo)率E1。然后將試管放置于沸水浴中10 min，冷卻后測(cè)定溶液總電導(dǎo)率E2，以無(wú)離子水電導(dǎo)率E0為參照，按以下公式計(jì)算質(zhì)膜相對(duì)透性（P），試驗(yàn)均采取3次重復(fù)。公式如下：

1.2.3 耐鹽性綜合評(píng)價(jià)

通過(guò)隸屬函數(shù)分析法，在上述0.6%NaCl處理蓮藕資源5 d內(nèi)的生理指標(biāo)（鹽害指數(shù)、葉綠素含量、丙二醛含量、SOD活性、POD活性、根系活力及質(zhì)膜相對(duì)透性）測(cè)定的基礎(chǔ)上，全面評(píng)價(jià)了7種蓮藕資源的耐鹽特性。公式如下：

式中，X(μ1)和X（μ2）分別為正負(fù)相關(guān)指標(biāo)的隸屬函數(shù)值；X為上述指標(biāo)測(cè)定值，Xmin為測(cè)定指標(biāo)的最小值，Xmax為測(cè)定指標(biāo)的最大值。

通過(guò)加權(quán)葉綠素含量、丙二醛含量、SOD活性、POD活性、根系活力及質(zhì)膜相對(duì)透性指標(biāo)的隸屬函數(shù)值，最后計(jì)算出平均值，具體詳見(jiàn)彭振等[8]方法。鹽害指數(shù)隸屬函數(shù)值為X（μ11），質(zhì)膜相對(duì)透性隸屬函數(shù)值為X（μ12），葉綠素含量隸屬函數(shù)值為X（μ13），根系活力隸屬函數(shù)值為X（μ14），過(guò)氧化物酶隸屬函數(shù)為X（μ15），超氧化物歧化酶隸屬函數(shù)為X（μ16），丙二醛隸屬函數(shù)值為X（μ21）。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS 16.0軟件中One-Way ANOVA分析Duncan法（P＜0.05）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同蓮藕資源在NaCl處理下形態(tài)和生理指標(biāo)的變化

2.1.1 不同蓮藕資源在NaCl處理下的鹽害指數(shù)

據(jù)觀察，0.6%NaCl溶液處理2 d內(nèi)，蓮藕材料外觀形態(tài)上沒(méi)有發(fā)生明顯鹽害現(xiàn)象。由圖1可知，處理5 d后，植株葉片開(kāi)始萎蔫，表現(xiàn)出不同程度的鹽害，其中H5、H8長(zhǎng)勢(shì)較好，受到鹽害影響較輕，新葉能夠正常展開(kāi)；H2和E3受傷害程度最大，大部分葉片失水干枯、皺縮卷曲，新葉不能正常開(kāi)展，畸形扭曲，葉片發(fā)黃，并生有黑斑。由圖2可知，蓮藕材料在0.6%NaCl溶液處理第5天，H2受到鹽害影響程度最大，與其他蓮藕材料的鹽害指數(shù)有顯著差異；E1、E2、E3、E4受到鹽害影響程度處于中間值，而H5和H8受鹽害影響程度比較低，其中H5蓮藕材料鹽害指數(shù)最低，說(shuō)明鹽脅迫下，H5耐鹽能力最強(qiáng)，而H2耐鹽能力最差。

2.1.2 不同蓮藕資源在NaCl處理下的葉綠素含量

圖3表明，各種蓮藕材料在0.6%NaCl溶液處理后葉綠素含量存在差異，其中，E1含量最低，與其他材料葉綠素含量差異顯著，表明耐鹽性最低。H2和E3葉綠素含量相同，均為0.16%，差異不顯著，且H2、E3和E1葉綠素含量均較低，表明H2、E3和E1受鹽脅迫后導(dǎo)致光合作用下降，葉綠素含量減少嚴(yán)重。E2、E4、H5和H8葉綠素含量較高，表明耐鹽性相對(duì)較強(qiáng)。

2.1.3 不同蓮藕資源在NaCl處理下的質(zhì)膜相對(duì)透性

由圖4可知，0.6%NaCl溶液處理后H2質(zhì)膜相對(duì)透性最高，高達(dá)45.01%，但與質(zhì)膜相對(duì)透性為40.89%的E3差異不顯著，顯著高于其他蓮藕資源，說(shuō)明鹽脅迫對(duì)H2和E3葉片傷害程度較大，H2和E3耐鹽性較差；H8質(zhì)膜相對(duì)透性最低，且與E1、H5差異不顯著，說(shuō)明這3種蓮藕受到鹽脅迫傷害相對(duì)較小，耐鹽能力較高。

2.1.4 不同蓮藕資源在NaCl處理下的根系活力

根系活力作為衡量根系抵御逆境能力的重要生理指標(biāo)，能夠反映出植株耐鹽能力。由圖5可知，蓮藕材料受0.6%NaCl處理后H5的根系活力最高，為128.80 mg/（g·h），且與其他材料根系活力之間差異顯著；E3根系活力最低，為34.76 mg/（g·h），但與蓮藕材料E1、E2、E4、H2之間差異不顯著；H8根系活力僅次于H5，但與H2之間差異不顯著。

圖1 NaCl處理對(duì)蓮藕生長(zhǎng)的影響

圖2 不同蓮藕資源在NaCl處理下的鹽害指數(shù)

圖3 不同蓮藕資源在NaCl處理下的葉綠素含量

圖4 不同蓮藕資源在NaCl處理下的質(zhì)膜相對(duì)透性

2.1.5 不同蓮藕資源在NaCl處理下的丙二醛含量

丙二醛（MDA）是膜脂過(guò)氧化最重要的產(chǎn)物之一，它的產(chǎn)生還能加劇膜的損傷；因此，在植物衰老生理和抗性生理研究中MDA含量是一個(gè)常用指標(biāo)，可通過(guò)MDA了解膜脂過(guò)氧化的程度，以間接測(cè)定膜系統(tǒng)受損程度以及植物的抗逆性。圖6表明，蓮藕資源受鹽脅迫后，E4的MDA含量最高，并且顯著高于其他蓮藕資源，說(shuō)明E4受到的損傷最高，耐鹽性最差；H5的MDA含量最低，但與其他蓮藕材料MDA含量之間差異不顯著。

2.1.6 不同蓮藕資源在NaCl處理下的POD和SOD含量

圖5 不同蓮藕資源在NaCl處理下的根系活力

圖6 不同蓮藕資源在NaCl處理下的丙二醛含量

SOD、POD是重要的保護(hù)酶，可以有效地清除膜脂過(guò)氧化物對(duì)細(xì)胞造成的傷害。由圖7可知，0.6%NaCl處理5 d后，E1、E3的POD活性較低，僅為60.93 、29.39 U/（g·min），二者之間差異不顯著；H5的POD活性最高，為1 151.62 U/（g·min），但與POD活性為795.70 U/（g·min）的H8之間差異不顯著。H5和H8與其他蓮藕資源POD活性存在顯著差異。由圖8可知，E1的SOD活性最高，E1、H5、E2和H2的SOD活性差異不顯著，但高于其他蓮藕材料；蓮藕材料E4的SOD活性最低。

2.2 蓮藕資源耐鹽性綜合評(píng)價(jià)

采用隸屬函數(shù)法對(duì)蓮藕資源耐鹽性進(jìn)行分析，得到的單一指標(biāo)的隸屬函數(shù)值與最終的平均隸屬函數(shù)值排序并不完全一致，說(shuō)明單一指標(biāo)不能準(zhǔn)確反映出蓮藕耐鹽能力（表3）。7份蓮藕資源耐鹽能力差異明顯，順序依次是：H5＞H8＞E2＞E4（E1）＞E3＞H2。H5、H8品種耐鹽能力相對(duì)較強(qiáng)，E1、E2、E4品種耐鹽性相對(duì)中等，E3和H2品種耐鹽性相對(duì)較弱。

3 結(jié)論與討論

植物耐鹽資源一般通過(guò)種子萌發(fā)期、苗期表現(xiàn)及產(chǎn)量進(jìn)行篩選，需要綜合評(píng)價(jià)植物全生育期生理數(shù)據(jù)和終產(chǎn)量才更可靠[9]。由于蓮藕繁殖多為無(wú)性繁殖，且蓮藕種子多為雜合，所以利用種子萌發(fā)期和最終產(chǎn)量評(píng)價(jià)試驗(yàn)蓮藕資源難以實(shí)施，因此本試驗(yàn)在蓮藕苗期進(jìn)行了資源篩選。

圖7 不同蓮藕資源在NaCl處理下的POD活性

圖8 不同蓮藕資源在NaCl處理下的SOD活性

表3 蓮藕資源耐鹽性隸屬函數(shù)與綜合評(píng)判結(jié)果

熊雪等[10-11]研究不同紫花苜蓿品種在鹽脅迫下的耐鹽性，以電導(dǎo)率、丙二醛、葉綠素、脯氨酸含量、根系活力等作為耐鹽性鑒定指標(biāo)，再通過(guò)隸屬函數(shù)法對(duì)6個(gè)紫花苜蓿品種在不同濃度鹽脅迫下的耐鹽性進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。本試驗(yàn)對(duì)蓮藕材料的鹽害指數(shù)、丙二醛、根系活力、葉綠素、細(xì)胞質(zhì)膜相對(duì)透性和抗氧化酶等指標(biāo)綜合分析后，發(fā)現(xiàn)鹽害指數(shù)大小與耐鹽性綜合評(píng)價(jià)基本一致，該指標(biāo)可以作為蓮藕耐鹽性分析的重要單項(xiàng)指標(biāo)之一。茄子在不同濃度鹽脅迫下，隨著脅迫濃度的增加，光合速率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，葉綠體結(jié)構(gòu)損傷引起非氣孔限制[12]。用5種不同濃度NaCl處理辣椒發(fā)現(xiàn)與對(duì)照相比，隨著NaCl濃度的增加，辣椒質(zhì)膜系統(tǒng)受損，細(xì)胞質(zhì)膜透性不斷增加，電解質(zhì)外滲，電導(dǎo)率升高[13]。本試驗(yàn)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，蓮藕材料受到鹽脅迫后，H2和E1葉綠素含量最低，葉片受到的鹽害最嚴(yán)重，生長(zhǎng)發(fā)育受到抑制，這與前人研究結(jié)果基本一致；因此葉綠素和質(zhì)膜相對(duì)透性可以作為鑒定植物耐鹽性的指標(biāo)。MDA是膜脂過(guò)氧化最重要的產(chǎn)物之一，是評(píng)價(jià)生物膜受損程度的一個(gè)重要指標(biāo)。壇紫菜葉狀體受不同濃度鹽脅迫后，低濃度鹽脅迫下壇紫菜葉狀體的氧化損傷要顯著高于高濃度鹽脅迫，說(shuō)明其含量與植物耐鹽性呈負(fù)相關(guān)[14]。本試驗(yàn)中，蓮藕受鹽脅迫后，E4中MDA含量最高，與其他6個(gè)蓮藕材料的MDA含量差異顯著，而其他6個(gè)蓮藕材料MDA含量差異不顯著。邢建宏等[15]利用低中高3種不同的鹽濃度處理秋茄根系，分析其根系活力，發(fā)現(xiàn)隨著鹽濃度的增加，秋茄根系活力呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，對(duì)秋茄的生長(zhǎng)發(fā)育起到抑制作用。蓮藕材料中H5根系活力最高，與其他根系活力有顯著性差異，說(shuō)明根系活力強(qiáng)弱可以體現(xiàn)植物的耐鹽性強(qiáng)弱。

植物的生理生化和形態(tài)指標(biāo)在受到鹽脅迫后會(huì)發(fā)生一系列變化，通常單一指標(biāo)難以準(zhǔn)確反映植物耐鹽性，但利用隸屬函數(shù)法可以準(zhǔn)確評(píng)價(jià)菊芋[16]、甜高粱[17]、茄子[18]和水稻[19]等植物的耐鹽性。利用0.6%NaCl溶液處理后，蓮藕資源的鹽害指數(shù)、葉綠素、丙二醛、抗氧化酶活性及根系活力指標(biāo)差異較大，其中E1葉綠素含量最低，說(shuō)明E1受到的鹽害最大，耐鹽性最差；E4的MDA含量最高，并且顯著高于其他蓮藕資源，說(shuō)明E4受到的損傷最高，耐鹽性最差；E2受到鹽脅迫后葉綠素含量最高，但MDA含量不是最高，表明單一指標(biāo)難以準(zhǔn)確評(píng)價(jià)蓮藕材料的耐鹽性。