陳勇忠 衛(wèi)秀洋 翁少煌 劉永平

[摘要] 目的 了解載結(jié)核藥鏈霉素的硫酸鈣緩釋顆粒在體外的藥物緩釋性能。 方法 實驗組，將鏈霉素與醫(yī)用硫酸鈣混合制備成載藥顆粒，將其置于模擬體液中，取1 d、2 d、3 d、1周、2周、4周、6周、8周、10周時緩沖液為樣本，高效液相色譜法（HPLC）檢測其中鏈霉素藥物的濃度，繪制藥物緩釋曲線?？瞻捉M，醫(yī)用硫酸鈣制備成未載藥顆粒。 結(jié)果 醫(yī)用硫酸鈣5 cc與鏈霉素1 g為最佳配比。載鏈霉素硫酸鈣顆粒在模擬體液中浸泡，緩釋顆粒3 d時累計釋放量15.33%。在8周前的樣本液中，藥物濃度均較高;至8周時鏈霉素的釋出濃度、仍達到的最小抑菌濃度，之后逐漸降低。未載鏈霉素的硫酸鈣顆粒在有效檢測時間內(nèi)藥物出峰時間處未見波峰出現(xiàn)。 結(jié)論 硫酸鈣鏈霉素顆粒具有效緩釋性能。8周內(nèi)模擬體液中釋出藥物的濃度均可達到抑制結(jié)核分枝桿菌的濃度。

[關(guān)鍵詞] 硫酸鈣;鏈霉素;緩釋;體外實驗

[中圖分類號] R969? ? ? ? ? [文獻標識碼] B? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2019）01-0040-04

Study on the sustained release properties of calcium sulfate streptomycin particles in vitro

CHEN Yongzhong1? ?WEI Xiuyang1? ?WENG Shaohuang2? ?LIU Yongping1

1.Department of Orthopaedics，476 Hospital of Fuzhou General Hospital，F(xiàn)uzhou? ?350002，China;2.College of Pharmacy，F(xiàn)ujian Medical University，F(xiàn)uzhou? ?350002，China

[Abstract] Objective To understand the drug release properties of calcium sulfate sustained-release granules carrying the tuberculosis drug streptomycin in vitro. Methods In the experimental group， streptomycin was mixed with medical calcium sulfate to prepare drug-loaded granules， which were placed in simulated body fluids. The buffer at 1 day， 2 days， 3 days， 1 week， 2， 4 ， 6， 8 and 10 weeks was used as a sample. The concentration of streptomycin was detected by high performance liquid chromatography（HPLC）， and the drug sustained-release curve was drawn. In the blank group， medical calcium sulfate was prepared as unloaded particles. Results The medical calcium sulfate 5 cc and streptomycin 1g were the best ratio. The streptomycin calcium sulfate particles were soaked in the simulated body fluid， and the cumulative release of the sustained-release particles was 15.33%. In the sample solution before 8 weeks， the drug concentration was higher. Release concentration of streptomycin and still reached minimum inhibitory concentration at 8 weeks， and then gradually decreased. Calcium sulfate particles without streptomycin showed no peaks at the peak time of the drug during the effective detection time. Conclusion Calcium sulfate streptomycin granules have a slow release property. The concentration of the drug released in the simulated body fluid can reach the concentration of inhibiting tuberculosis within 8 weeks.

[Key words] Calcium sulfate; Streptomycin; Sustained release; In vitro experiments

脊柱是骨結(jié)核的好發(fā)部位之一，如果診治不及時或不規(guī)范，極易造成椎體破壞、甚至累及椎管，壓迫脊髓神經(jīng)，造成癱瘓[1-2]。椎體的上下終板主要由軟骨細胞、致密膠原及糖蛋白基質(zhì)共同構(gòu)成，自身修復(fù)困難。同時病灶周圍壞死硬化的骨具有屏障作用，導(dǎo)致局部藥物濃度過低或者不能達到病灶[3-4]。因此在治療脊柱結(jié)核的時候，不僅要規(guī)范的抗結(jié)核，維持局部有效血藥濃度，還要解決病灶填充、修復(fù)、成骨的問題。醫(yī)用硫酸鈣具有較好的抗壓縮強度、組織相容性、緩釋性能、成骨特性等優(yōu)點，已成為近年研究的熱點[5-9]。同時我院已將硫酸鈣鏈霉素的顆粒已在臨床應(yīng)用，取得滿意效果[10-11]。但是硫酸鈣鏈霉素的顆粒緩釋性能如何尚未見文獻報道。本研究將載鏈霉素的硫酸鈣顆粒浸泡在緩沖液中，在不同時間點取出緩沖液樣本中，采用高效液相色譜法（high perfromance liquid chromatography，HPLC）測定藥物濃度，評價其在體外的緩釋性能。

1 材料與方法

1.1 主要儀器、材料與試劑

注射用硫酸鏈霉素（山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司，規(guī)格1 g/瓶，國藥準字H37020187）;醫(yī)用硫酸鈣（英國百賽公司，5 cc思迪骨粉，CS）;島津LC-15C型高效液相色譜儀（日本島津公司）;智能溶出實驗儀（天大天發(fā)）。

1.2 不同規(guī)格的鏈霉素硫酸鈣緩釋系統(tǒng)的制作

不同規(guī)格的鏈霉素硫酸鈣，如下方法制作成顆粒。用萬能壓力測試機測試各個比例材料顆粒的抗壓強度和最大壓縮力，并測得最佳混合配比（1 g鏈霉素注射粉劑：5 cc醫(yī)用硫酸鈣粉劑）。

以1 g 鏈霉素注射粉劑與5 cc醫(yī)用硫酸鈣粉劑，后加入2 mL配套的混合液（滅菌注射用水），攪拌至糊狀，充填到模具中，10～15 min干硬后倒出便制成直徑3 mm、厚3 mm的含鏈霉素的硫酸鈣緩釋顆粒，進行實驗組實驗。用同樣方法制備不混合任何藥硫酸鈣固化顆粒，進行空白組實驗。

1.3 緩釋液的采集

取16塊含鏈霉素的硫酸鈣緩釋顆粒，每塊材料分別置入40 mL經(jīng) 0.22 μm 濾器處理過的磷酸緩沖液（PBS，pH值7.3 5～7.40）模擬體液中，用生物半透膜包裹，避光放入37°C恒溫振蕩器中，轉(zhuǎn)速設(shè)定為100 r/min 持續(xù)震蕩于整個實驗周期。每日取緩沖液5 mL，并回補PBS模擬體液5 mL。留取1 d、2 d、3 d、1周、2周、4周、6周、8周、10周各時間點緩沖液作為測定樣本，用0.22 μm濾器過濾后加入l mL的進樣瓶中避光保存，備高效液相色譜儀檢測用。

1.4 緩釋液藥物濃度檢測

采用高效液相色譜儀對不同時間點緩沖液樣本中鏈霉素的藥物濃度進行檢測，計算單位時間段內(nèi)藥物的釋放度。色譜條件：CN（5 μm）、250 mm ×4.6 mm色譜柱;流動相采用0.01 mol/L 庚烷磺酸鈉（pH值3.0）：乙腈=50：50;流速1.0 mL/min;檢測波長203 nm;柱溫30℃;進樣體積10 μL。

利用HPLC 在上述色譜條件下檢測已知濃度的鏈霉素溶液，進樣本檢測，通過測試設(shè)備軟件分析進行數(shù)據(jù)處理，得出鏈霉素藥物濃度的標準曲線方程。利用HPLC 在待檢測樣本，也在上述色譜條件下檢測，不同時間點樣本中鏈霉素對應(yīng)的曲線峰面積，再通過標準曲線方程，換算得到各時間點緩沖液中藥物的濃度。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料以均數(shù)±標準差表示，用獨立樣本t檢驗進行兩組間的比較，計數(shù)資料采用頻數(shù)和百分比表示。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 硫酸鈣鏈霉素顆粒的制備及體外內(nèi)環(huán)境系統(tǒng)模型

硫酸鈣鏈霉素顆粒的制備過程及顆粒的配比是在預(yù)實驗下多次制作，重復(fù)性、穩(wěn)定性良好。鏈霉素-硫酸鈣顆粒電子顯微鏡下顯示：結(jié)構(gòu)其中以棒狀結(jié)構(gòu)為主，硫酸鈣寬度為7.5 μm～10.0 μm，長40.0 μm～50.0 μm，鏈霉素為顆粒形狀為主 5 μm×5 μm×5 μm。見圖1a～c。

2.2 硫酸鈣與鏈霉素顆粒的最佳混合比例

在緩釋顆粒中，當鏈霉素與硫酸鈣在比例在小于5 cc：1 g時緩釋顆粒的抗壓強度及最大壓縮力，與單純硫酸鈣顆粒物無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。當鏈霉素與硫酸鈣在比例在大于5 cc：1 g抗壓強度及最大壓縮力開始下降。因此本研究認為緩釋顆粒鏈霉素與硫酸鈣在比例在大于5 cc：1g時為最佳配比。見表1。

2.2 硫酸鈣鏈霉素顆粒與非載藥硫酸鈣HPLC 色譜圖

硫酸鈣鏈霉素顆粒緩沖液的色譜圖顯示，7.36 min為鏈霉素的藥物峰。說明硫酸鈣鏈霉素顆粒能夠釋藥且能用HPLC法檢測到藥物濃度。未載藥硫酸鈣浸提液的色譜圖顯示，在7 min左右色譜圖的未出現(xiàn)明顯波峰，說明無藥物峰，未檢測到鏈霉素。見圖1e～g。

2.3 載藥人工材料體外緩釋藥物濃度

不同時間點浸提液中藥物濃度。在前8周各個時間點的浸提液中藥物濃度均較高至8周時鏈霉素的釋出濃度均高于其10倍的最小抑菌濃度（MIC），之后逐漸降低。見表2。

2.4 載藥人工材料體外緩釋藥物釋放度

載鏈霉素硫酸鈣顆粒在模擬體液中浸泡，緩釋顆粒3 d時累計釋放量15.33%。1周、2周時釋放度分別為21.85%、62.31%?？梢娫?～2周時鏈霉素釋放較快，存在一定的“突釋”現(xiàn)象。之后逐漸平穩(wěn)釋放。在8周前的樣本液中，藥物濃度均較高;至8周時鏈霉素的釋出濃度、仍達到的最小抑菌濃度，之后逐漸降低。見表2。

3 討論

脊柱結(jié)核的治療主要在于解決抗結(jié)核化療、修復(fù)、脊柱穩(wěn)定性的問題。通過手術(shù)固定可以獲得脊柱穩(wěn)定問題。手術(shù)后如何抗結(jié)核與骨修復(fù)成為治療的熱點?？菇Y(jié)核藥物之一鏈霉素，臨床常常采用肌肉注射。連續(xù)肌肉注射長達3個月，患者難以堅持。若在清除結(jié)核病灶后直接在創(chuàng)面撒上鏈霉素粉劑，有效藥物濃度維持時間不夠長;如果病灶內(nèi)一次給予過量的藥物，但其不良反應(yīng)的發(fā)生率高。設(shè)計在病灶局部搭載含鏈霉素緩釋藥物人工骨支架植入是一種解決方案。本研究制備載了硫酸鈣鏈霉素緩釋顆粒，目的在于獲得一種新型材料植人病灶清除之后的缺損部位，兼具抗結(jié)核和修復(fù)骨缺損的雙重作用。硫酸鈣是一種理想的骨替代材料，植骨效果與自體骨相當。廣泛應(yīng)用于口腔科和矯形外科[12-13]。選用其作為載體，可以修復(fù)病灶清除后的骨缺損。

實驗設(shè)計原理是利用智能溶出實驗儀，體外模擬體內(nèi)環(huán)境，造出一個動態(tài)的內(nèi)環(huán)境。將硫酸鈣鏈霉素緩釋顆粒在緩沖液內(nèi)，每日提取部分緩沖液體，作為測量樣本。同時補充緩沖液，模擬體內(nèi)的液體交換。通過高效液相色譜法（HPLC）測定緩沖液，在不同時間點測定緩沖液體的藥物濃度，評價酸鈣鏈霉素顆粒在體外的緩釋性能。

設(shè)計模型基本可以模擬體內(nèi)環(huán)境。但是也存在局限性。體內(nèi)環(huán)境較復(fù)雜，顆粒鏈霉素在體內(nèi)不僅是代謝，吸收，還有傷口出血、滲出、引流丟失等。我們將每日提取緩沖液視為藥物在體內(nèi)的自然代謝。每次取樣后在補充回緩沖液，以求保持體液的平衡。

在緩釋顆粒中，硫酸鈣作為載體，主要提供緩釋效應(yīng)，同時硫酸鈣的量決定顆粒的硬度。顆粒的硬度又與顆粒的崩解時間正呈相關(guān)性。硫酸鈣份量越大，顆粒硬度越硬，崩解時間相對持久。鏈霉素提供抗結(jié)核藥物，鏈霉素總量決定局部藥物濃度。鏈霉素的份量又與局部濃度呈正相關(guān)。鏈霉素份量越大，局部藥物濃度相對較高。從顆粒力學(xué)性能結(jié)果顯示，當鏈霉素與硫酸鈣在比例在小于1 g：5 cc時緩釋顆粒的抗壓強度及最大壓縮力，與單純硫酸鈣顆粒物無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。當鏈霉素與硫酸鈣在比例在大于1 g：5 cc抗壓強度及最大壓縮力開始下降。要做到緩釋顆粒的持久緩釋性能，既要保證顆粒的硬度，又要兼顧顆粒載藥總量。因此我們認為緩釋顆粒鏈霉素與硫酸鈣在比例在大于1 g：5 cc時為最佳配比。

從藥物緩釋曲線顯示，測定7周、8周時檢測液中，鏈霉素的濃度9.01 μg/mL，0.07 μg/mL。鏈霉素的MIC為0.05 μg/mL。文獻報道抗結(jié)核藥物一般最低殺菌濃度MBC為最低抑菌濃度MIC的10倍[14]。所以在將近2個月內(nèi)均能在最低殺菌濃度范圍內(nèi)?？梢娏蛩徕}鏈霉素緩釋顆粒這種緩釋作用在抗結(jié)核療程中具有重要臨床意義的。

從繪制的藥物釋放度曲線顯示，3 d、1周、2周時釋放度分別15.33%、21.85%、62.31%?？梢娫?～2周時鏈霉素釋放較快，存在一定的“突釋”現(xiàn)象。之后藥物釋放度曲線逐漸平穩(wěn)釋放。藥物的突釋也是藥物工作者共同存在的問題。突釋效應(yīng)一般出現(xiàn)在藥物釋放的最初階段，在短時間內(nèi)釋放出大量的藥物，產(chǎn)生全身不良反應(yīng)。對于靶向緩釋載體而言，這將導(dǎo)致靶部位有效藥物質(zhì)量的減少，最終削弱緩釋載體的靶向作用。資料顯示[15-16]，藥物突釋的定義3 d內(nèi)釋放量比例不超過總量的40%。本緩釋顆粒3 d時累計釋放量15.33%，在藥物突釋的范圍內(nèi)。從實驗觀察結(jié)果顯示，顆粒在緩沖液體內(nèi)浸泡，在1～2周時出現(xiàn)崩解，顆粒碎裂，崩解后出現(xiàn)大量的小顆粒，小顆粒表面的鏈霉素大量釋放，存在突釋。之后曲線相對平穩(wěn)，是由于顆粒在制作的過程中，通過加壓，干燥過程，硫酸鈣的棒狀結(jié)構(gòu)和鏈霉素分子之間產(chǎn)生螯合作用，相互結(jié)合。雖然大顆粒遇水出現(xiàn)崩解，但是硫酸鈣和鏈霉素小分子之間的螯合作用，硫酸鈣分子逐漸釋放出鏈霉素。同時顆粒在電鏡下結(jié)構(gòu)也顯示，鏈霉素與硫酸鈣棒狀的分子結(jié)構(gòu)，分子間相互交錯成形，能夠起到的緩慢釋放作用的基礎(chǔ)。

2005版《中國藥典》規(guī)定體外藥物釋放開始0.5 h內(nèi)的釋放量應(yīng)小于40%，對于安全性差的藥物更應(yīng)進行嚴格控制，相關(guān)文獻也有諸多報到[17]。出于臨床用藥對人體絕對安全性的考慮，該鈣鏈霉素緩釋顆?？偹幜啃∮诿咳张R床口服與靜脈滴注的用藥量，且藥物是在長時間內(nèi)以相對穩(wěn)定的速率釋放的，保證單位時間內(nèi)藥物釋放量處于安全范圍內(nèi)。

研究表明硫酸鈣鏈霉素顆粒具有效緩釋性能，模擬體液中釋出藥物的濃度可長期達到殺死結(jié)核分枝桿菌的濃度。課題也存在局限性，該顆粒的釋放制作過程進一步優(yōu)化，顆粒的配比需進一步細化，體外模擬裝備不能完全等同體內(nèi)實驗。同時進行體內(nèi)實驗將后續(xù)報道。

[參考文獻]

[1] Eva N，Paul N，F(xiàn)RC，et al. MDR tuberculosis critical steps for prevention and control[J]. N Eng J Med，2010， 363：1050-1058.

[2] 李大偉，馬遠征.骨關(guān)節(jié)結(jié)核局部藥物緩釋材料研究進展[J].中國防癆雜志，2013，35：（5）：376-378.

[3] Diacon AH，Donald PR.The early bactericidal activity of antituberculosis drugs[J].Expert Rev Anti Infect Ther，2014，12（2）：223-237.

[4] 王騫，耿廣起，叢曉明，等. 載三聯(lián)抗癆藥硫酸鈣/聚氨基酸緩釋材料在兔脊柱結(jié)核模型體內(nèi)的緩釋性能[J].中國組織工程研究，2017，21（10）：1520-1526.

[5] Mistry S，Roy S，Maitra NJ，et al. A novel， multi-barrier，drug eluting calcium sulfate/biphasic calcium phosphate biodegradable composite bone cement for treatment of experimental MRSA osteomyelitis in rabbit model[J].J Control Release，2016，239：169-181.

[6] Liu P，Jiang H，Li S，et al.Determination of anti-tuberculosis drug concentration and distribution from sustained release microspheres in the vertebrae of a spinal tuberculosis rabbit model[J].J Orthop Res，2017，35（1）：200-208.

[7] 德向研，施建黨，王自立，等. 載三聯(lián)抗結(jié)核藥硫酸鈣/氨基酸聚合物人工骨體內(nèi)緩釋實驗研究[J]. 中國脊柱脊髓雜志，2013，23（6）：531-536.

[8] Wang P，Liu P，Peng H，et al.Biocompatibility evaluation of dicalcium phosphate/calcium sulfate/poly（amino acid）composite for orthopedic tissue engineering in vitro and in vivo[J].J Biomater Sci Polym Ed，2016，27（11）：1170-1186.

[9] Wu CC，Hsu LH，Tsai YF，et al.Enhancement of biodegradation and osseointegration of poly（ε-caprolactone）/calcium phosphate ceramic composite screws for osteofixation using calcium sulfate[J].Biomed Mater，2016，11（2）：125-132.

[10] 陳勇忠，王劍火，張朋，等.含鏈霉素醫(yī)用硫酸鈣人工骨修復(fù)胸腰椎結(jié)核骨缺損[J].中國組織工程研究，2014， 18（5）：802-805.

[11] 陳勇忠，王劍火，張朋，等.一期后路病灶清除混合植骨內(nèi)固定術(shù)治療胸腰椎結(jié)核[J]. 臨床骨科雜志，2014，17（6）：626-632.

[12] 普有登，湯遜。硫酸鈣骨移植替代材料的研究及應(yīng)用進展[J].中國矯形外科雜志，2011，19（11）：931-933.

[13] Yashavantha Kumar C，Nalini KB，Menon J，et al. Calcium sulfate as bone graft substitute in the treatment of osseous bone defects，a prospective study[J]. Journal of Clinical & Diagnostic Research Jcdr，2013，7（12）： 2926-2928.

[14] 張俊山，王自力，施建黨，等.復(fù)合三聯(lián)抗抗結(jié)核藥人工緩釋材料體外抗結(jié)核性能[J].脊柱外科雜志，2014，12（6）：380-384.

[15] 龍娜，呂竹芬.微球緩釋系統(tǒng)的突釋現(xiàn)象及其影響因素[J].中國藥師，2010，13（3）：421-423.

[16] 周林.抗結(jié)核藥物研究進展[J].中國臨床醫(yī)生，2013，41（3）：14-17.

[17] 劉海濤，施建黨，王騫，等. 載三聯(lián)抗癆藥硫酸鈣/聚氨基酸緩釋人工材料體外緩釋性能的觀察[J].中國脊柱脊髓雜志，2015，25（3）：239-244.