原振英 管翠強(qiáng) 南欣榮,

1.山西醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院·口腔醫(yī)院 太原 030001；

2.山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院口腔科 太原 030001

環(huán)境因素和遺傳多態(tài)性導(dǎo)致甲基化異常，異常的DNA甲基化水平與常見(jiàn)的口腔疾病相關(guān)，成為研究口腔疾病機(jī)制的熱點(diǎn)。

1 DNA甲基化與表觀遺傳學(xué)

表觀遺傳學(xué)是研究在基因的核苷酸序列不發(fā)生改變的情況下，基因表達(dá)的可遺傳性變化的遺傳學(xué)分支學(xué)科。表觀遺傳的現(xiàn)象很多，包括DNA甲基化（DNA methylation）、組蛋白修飾和非編碼RNA調(diào)節(jié)等[1]。表觀遺傳學(xué)調(diào)控機(jī)制對(duì)細(xì)胞分化至關(guān)重要，這一過(guò)程在每個(gè)特定生物體的細(xì)胞水平是高度保守的[2]。當(dāng)這種高度保守的過(guò)程直接或間接地受到外部環(huán)境影響時(shí)，就會(huì)導(dǎo)致基因表達(dá)的改變，從而導(dǎo)致功能的改變[3]。例如，人類(lèi)CD4+T細(xì)胞的分化受局部炎性物質(zhì)的影響，這些炎癥物質(zhì)或白細(xì)胞介素（interleukin，IL）進(jìn)一步激活轉(zhuǎn)錄因子，這些轉(zhuǎn)錄因子與特定基因的啟動(dòng)子區(qū)域中特定的甲基化或去甲基化位點(diǎn)結(jié)合，形成T細(xì)胞DNA，并決定T細(xì)胞發(fā)展譜系的命運(yùn)。在特定基因啟動(dòng)子區(qū)域附近DNA甲基化的增加導(dǎo)致T細(xì)胞表達(dá)減少，反之亦然[4]。同樣，在牙周炎等病理情況下，局部免疫反應(yīng)由這些局部作用的轉(zhuǎn)錄因子和特定基因的甲基化或去甲基化決定[5]。

2 DNA甲基化與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)

DNA甲基化是一種DNA復(fù)制后的酶促反應(yīng)過(guò)程[6]，是指生物體在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferase）的催化下，將S-腺苷甲硫氨酸分子上的甲基轉(zhuǎn)移到DNA分子中胞嘧啶的第5位碳原子上，形成5-甲基胞嘧啶。隨著DNA分子引入甲基，DNA分子的構(gòu)象改變，影響了DNA與蛋白質(zhì)因子（如拓?fù)洚悩?gòu)酶、RNA聚合酶、阻抑蛋白等）的結(jié)合[7]。哺乳動(dòng)物基因組中5-甲基胞嘧啶的含量占總胞嘧啶的2%～7%，并集中在二核苷酸胞嘧啶（CpG）結(jié)構(gòu)中[8]。

CpG位點(diǎn)以2種形式存在，一種是CpG結(jié)構(gòu)在DNA中散在分布，每50～100 bp DNA中出現(xiàn)1個(gè)CpG，其中約70%的CpG位點(diǎn)中的胞嘧啶是甲基化的；另一種是CpG結(jié)構(gòu)高度聚集在一起，即CpG島，僅占總DNA的1%～2%，長(zhǎng)度為0.2～2 kb，位于基因的5’端啟動(dòng)子區(qū)或延伸至第一外顯子區(qū)[9]。除X染色體基因、印跡基因之外，通常情況下CpG島不發(fā)生甲基化修飾。

CpG島甲基化與基因的表達(dá)密切相關(guān)[10]，可以抑制基因的表達(dá)，如在腫瘤發(fā)生機(jī)制中抑癌基因呈甲基化狀態(tài)[11]，導(dǎo)致抑癌基因失活。CpG島甲基化抑制基因表達(dá)的機(jī)制包括：1）CpG島甲基化改變了DNA分子構(gòu)象，導(dǎo)致某些重要基團(tuán)的隱蔽，直接干擾轉(zhuǎn)錄因子與調(diào)控區(qū)DNA結(jié)合。2）甲基化CpG與甲基化CpG結(jié)合區(qū)蛋白結(jié)合形成復(fù)合物，后者再募集組蛋白去乙酰酶形成復(fù)合物，結(jié)果使核心組蛋白尾區(qū)去乙?；?，形成更緊密的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，限制了轉(zhuǎn)錄因子到達(dá)其結(jié)合部位的通道，從而抑制基因轉(zhuǎn)錄[9]。在高等真核生物中，DNA甲基化可能參與基因的表達(dá)調(diào)控、發(fā)育調(diào)節(jié)、基因組印記和X染色體失活[12]。

3 DNA甲基化與口腔疾病

多種細(xì)菌和病毒可能導(dǎo)致口腔組織的DNA高度甲基化[13]。在口腔炎性疾病組織中，可以觀察到異常的DNA高度甲基化[14]。

3.1 DNA甲基化與慢性牙周炎

牙周病是一種由多種微生物感染引起的炎癥性疾病，其特點(diǎn)是牙周病原體與宿主免疫反應(yīng)的相互作用。慢性牙周炎是最常見(jiàn)的一類(lèi)牙周病[15]。

有研究[16]表明，表觀遺傳修飾在調(diào)節(jié)宿主免疫反應(yīng)方面起著至關(guān)重要的作用，可能通過(guò)影響參與免疫反應(yīng)的基因表達(dá)來(lái)促進(jìn)疾病的發(fā)生和發(fā)展。由于局部免疫反應(yīng)受到炎癥位點(diǎn)的表觀遺傳調(diào)控，所以在同一個(gè)體中炎癥位點(diǎn)與非炎癥位點(diǎn)的表觀基因組存在差異。與健康人的DNA甲基化特征相比，慢性牙周炎患者的DNA甲基化特征可能存在差異[13]。

表觀遺傳修飾不是永久性的，可以通過(guò)改變環(huán)境來(lái)逆轉(zhuǎn)[17]，因此通過(guò)牙周基礎(chǔ)治療（如刮治術(shù)）清除病原細(xì)菌可能會(huì)改變炎性區(qū)域的表觀基因組。Viana等[18]采用甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）和DNA測(cè)序分析，分別對(duì)無(wú)牙周炎和慢性牙周炎患者的干擾素（interferon，IFN）-γ和IL-10的基因的DNA甲基化狀態(tài)進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果表明牙周組織編碼IFN-γ和IL-10的基因中存在甲基化。在類(lèi)似的研究中，Stefani等[16]發(fā)現(xiàn)IL-6在慢性牙周炎患者牙齦組織中有較高表達(dá)水平，同時(shí)發(fā)現(xiàn)IL-6基因啟動(dòng)子區(qū)域存在部分甲基化。Zhang等[19]也發(fā)現(xiàn)牙周炎患者牙周組織中IFN-γ基因啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)的低甲基化與IFN-γ基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的增加有關(guān)，并認(rèn)為慢性牙周炎是一種不可逆轉(zhuǎn)的牙周病，DNA甲基化可能是控制腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α表達(dá)的重要調(diào)控機(jī)制。DNA甲基化調(diào)控在慢性牙周炎發(fā)病中的作用及其機(jī)制尚不明確，需要進(jìn)一步研究來(lái)證實(shí)。

3.2 DNA甲基化與口腔癌

大部分口腔癌屬于發(fā)生于口腔黏膜的鱗狀細(xì)胞癌。在口腔癌的的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中，口腔黏膜經(jīng)歷了異常增生、原位癌、浸潤(rùn)癌的不同病理階段[20]?？谇话└咚劳雎屎艽蟪潭壬蠚w因于后期診斷。對(duì)疾病尤其是惡性疾病早期發(fā)現(xiàn)，預(yù)后較好[21]。

早期研究[22]表明，口腔癌癌變?cè)缙诩巴砥诰嬖诋惓＜谆?。在基因組的重復(fù)序列中，低度甲基化很常見(jiàn)，而高度甲基化則被認(rèn)為是導(dǎo)致口腔癌發(fā)展的主要因素[23]。在致癌物中，煙草及其代謝產(chǎn)物在口腔癌的發(fā)展中存在80%以上的風(fēng)險(xiǎn)，并通過(guò)改變DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)來(lái)促進(jìn)基因的甲基化[24]。在癌變的早期階段，微小RNA（microRNA，miRNA）表達(dá)改變?cè)诩?xì)胞轉(zhuǎn)化過(guò)程中起關(guān)鍵作用[25]。

P16蛋白是抑制細(xì)胞周期G1期進(jìn)展的調(diào)控因子，Cao等[26]通過(guò)甲基化特異性PCR技術(shù)檢測(cè)出，在93例入組患者中，32例（41.0%）在口腔上皮異常增生病變中存在p16甲基化；在隨訪的78例患者中，22例（28.2%）口腔上皮異常增生病變中存在癌變組織。使用p16甲基化預(yù)測(cè)口腔上皮異常增生惡變的敏感性和特異性分別為63.6%和67.9%。Liu等[27]發(fā)現(xiàn)以p16甲基化陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)作為早期預(yù)測(cè)癌癥發(fā)展的生物標(biāo)志物時(shí)，靈敏度和特異性分別為62%和76%，進(jìn)一步說(shuō)明p16甲基化與口腔上皮異常增生的惡性轉(zhuǎn)化相關(guān)，是預(yù)測(cè)輕度或中度口腔上皮異常增生的潛在生物標(biāo)志物。由于樣本含量以及研究設(shè)計(jì)的限制，仍需對(duì)口腔癌前期的表觀基因組甲基化研究進(jìn)行大量的縱向追蹤。

近年來(lái)，對(duì)口腔鱗狀細(xì)胞癌的全基因組甲基化的研究集中在識(shí)別異常的DNA甲基化，這些研究表明甲基化可能是參與口腔鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展的重要機(jī)制，因此可以作為癌癥醫(yī)學(xué)診斷和預(yù)后的一個(gè)生物學(xué)標(biāo)記物。然而，這些研究都是在特定地理位置的不同種族人群進(jìn)行的，這些群體之間的表觀遺傳特征可能存在差異。因此，需要進(jìn)行表觀遺傳學(xué)研究，以找出對(duì)口腔鱗狀細(xì)胞癌有意義的、獨(dú)特的DNA甲基化模式[22]。

3.3 DNA甲基化與口腔扁平苔蘚

口腔扁平苔蘚是一種常見(jiàn)的口腔黏膜慢性炎性疾病，病因和發(fā)病機(jī)制目前尚不明確[28]。

DNA甲基轉(zhuǎn)移酶包括3種類(lèi)型：DNMT1、DNMT3a和DNMT3b。DNMT3a與DNMT3b的功能是從頭合成甲基化，在控制基因活性、胚胎發(fā)育和基因組印記方面起著重要作用；DNMT1是一種維持性酶，主要是維持甲基化，確保每個(gè)細(xì)胞的DNA甲基化模式正常復(fù)制，因此DNA甲基轉(zhuǎn)移酶建立了一種新的甲基化模式[14]。

研究[29]表明，在口腔扁平苔蘚中觀察到DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（包括DNMT3b和DNMT1）的表達(dá)增加，DNMT3b的表達(dá)增加是由于DNA多態(tài)性?？谇槐馄教μ\與正常黏膜相比，miR-137啟動(dòng)子區(qū)域呈現(xiàn)高度甲基化特征[25]。Cruz等[30]采用橫斷面研究方法分析了口腔扁平苔蘚非糜爛病變組、糜爛病變組以及正?？谇火つぃ▽?duì)照組）不同類(lèi)型的DNA甲基化模式，結(jié)果發(fā)現(xiàn)僅在對(duì)照組（59.0%）中觀察到STAT5A（信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子）基因的高度甲基化，與正?？谇火つは啾?，免疫應(yīng)答相關(guān)基因的甲基化情況有所不同，需要進(jìn)一步使用基因表達(dá)分析的研究來(lái)驗(yàn)證這些發(fā)現(xiàn)。

4 DNA甲基化與復(fù)發(fā)性阿弗他潰瘍研究展望

復(fù)發(fā)性阿弗他潰瘍是最常見(jiàn)的口腔黏膜潰瘍類(lèi)疾病，調(diào)查發(fā)現(xiàn)至少10%～25%的人群患有這種疾病[31]。這種疾病具有周期性、復(fù)發(fā)性、自限性特征；潰瘍灼痛明顯；好發(fā)于唇、頰、舌、軟腭等無(wú)角化或角化較差的黏膜；根據(jù)臨床表現(xiàn)可將其分為輕型、皰疹型（滿天星樣）、重型（彈坑樣）；典型病灶具有“黃、紅、凹、痛”的特征表象，即潰瘍表面覆蓋黃色假膜，周?chē)屑t暈帶，中央凹陷，疼痛明顯。輕者數(shù)月發(fā)作1次，重者慢性遷延，反復(fù)發(fā)作，妨礙飲食或說(shuō)話，患者十分痛苦[32]。

復(fù)發(fā)性阿弗他潰瘍的病因復(fù)雜，發(fā)病因素甚多，且尚未統(tǒng)一。但已有研究[33-34]證實(shí)，復(fù)發(fā)性阿弗他潰瘍的發(fā)生與細(xì)胞免疫功能下降及T淋巴細(xì)胞亞群失調(diào)有關(guān)，其中輔助性T（T helper，Th）細(xì)胞起著重要的作用。Th1細(xì)胞主要產(chǎn)生IL-2和IFN-γ，參與調(diào)控細(xì)胞免疫；Th2細(xì)胞分泌IL-4、IL-5、IL-10等，具有體液免疫的輔助功能[35]。Lewkowicz等[36]發(fā)現(xiàn)，在復(fù)發(fā)性阿弗他潰瘍患者的細(xì)胞中存在一種典型的Th1型基因，Th1相關(guān)基因出現(xiàn)高水平表達(dá)；發(fā)現(xiàn)Th2細(xì)胞出現(xiàn)趨化因子C-C基序受體3的高水平表達(dá)。這些發(fā)現(xiàn)表明復(fù)發(fā)性阿弗他潰瘍形成主要依賴(lài)于Th1型免疫反應(yīng)的激活，患者Th1/Th2免疫失衡。

Bird等[37]的研究證實(shí)，在細(xì)胞因子以及轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控Th1及Th2細(xì)胞分化的同時(shí)，伴隨著DNA甲基化表觀遺傳的修飾，協(xié)同調(diào)控Th1及Th2細(xì)胞分化。有學(xué)者[38]指出，分化后的Th2細(xì)胞分泌的IL-4伴隨著IL-4基因CpG島的去甲基化；同時(shí)Th1細(xì)胞TNFG表達(dá)的增加伴隨著IFN-γ基因的低度甲基化狀態(tài)。

研究[13]已經(jīng)證實(shí)，表觀遺傳調(diào)控與多基因復(fù)雜性狀疾病的發(fā)病密切相關(guān)。復(fù)發(fā)性阿弗他潰瘍的發(fā)生較為常見(jiàn)，是多基因綜合作用的結(jié)果，且病情嚴(yán)重程度存在明顯的個(gè)體差異。前面提到的炎癥介質(zhì)重要基因包括IL-4、TNFG等，其序列的變異可能會(huì)改變機(jī)體Th1/Th2細(xì)胞平衡以及炎癥介質(zhì)的調(diào)控，從而對(duì)復(fù)發(fā)性阿弗他潰瘍的易感癥和嚴(yán)重程度產(chǎn)生影響。因此，在DNA甲基化水平研究復(fù)發(fā)性阿弗他潰瘍的發(fā)病機(jī)制，進(jìn)一步用于疾病的預(yù)防及治療具有非常重要的意義。

5 結(jié)語(yǔ)

綜上，個(gè)體基因序列的差異可以影響個(gè)體對(duì)炎癥的反應(yīng)，而DNA甲基化的改變可以調(diào)控這種基因的表達(dá)，從而動(dòng)態(tài)地調(diào)節(jié)個(gè)體對(duì)炎癥的反應(yīng)。在口腔疾病中，表觀遺傳修飾作用的證據(jù)正在增加。許多環(huán)境因素影響口腔組織的變化，但就其對(duì)退行性和炎癥性疾病的影響方面的研究知之甚少。表觀遺傳修飾是可逆的，因此它可以作為治療靶點(diǎn)。表觀遺傳治療可應(yīng)用于復(fù)雜性口腔炎癥類(lèi)疾?。ㄈ鐝?fù)發(fā)性口腔潰瘍和口腔扁平苔蘚），但在對(duì)口腔疾病的表觀遺傳治療領(lǐng)域取得進(jìn)展之前，還需要進(jìn)一步的研究。