李秀鋒， 范蓓媛， 劉力行， 王軍波， 陳德勇， 陳 健

(1.中國(guó)科學(xué)院電子學(xué)研究所 傳感技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100190；2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100039)

0 引 言

細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)是否表達(dá)及表達(dá)量的差異，由基因和外界環(huán)境共同調(diào)控，影響著疾病的發(fā)生、機(jī)體的衰老、神經(jīng)的傳導(dǎo)等，是生命活動(dòng)變化的關(guān)鍵指標(biāo)[1]。因此，蛋白質(zhì)的定量檢測(cè)技術(shù)，對(duì)細(xì)胞生物學(xué)分子機(jī)制研究、疾病臨床診治和藥物開(kāi)發(fā)等至關(guān)重要[2,3]。

傳統(tǒng)的細(xì)胞蛋白質(zhì)定量檢測(cè)方法如凝膠電泳、免疫分析、質(zhì)譜等技術(shù)，大多是針對(duì)群體細(xì)胞采集數(shù)據(jù)，檢測(cè)結(jié)果反映了蛋白平均表達(dá)水平。然而，生命體內(nèi)甚至遺傳物質(zhì)相同的細(xì)胞之間都存在差異(即異質(zhì)性)[4,5]，在細(xì)胞群體水平上的研究結(jié)果可能會(huì)忽略這種差異，致使某些重要的分子機(jī)制被隱藏起來(lái)[6]。這意味著在單細(xì)胞水平測(cè)得的數(shù)據(jù)更能夠精確地反映生命事件的真實(shí)情況，單細(xì)胞蛋白定量檢測(cè)技術(shù)對(duì)于深入理解生命活動(dòng)過(guò)程具有重要意義[7]。

除此之外，單細(xì)胞蛋白定量檢測(cè)技術(shù)對(duì)于珍貴樣本、稀有細(xì)胞的分析也具有重要意義。例如，對(duì)循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating cumor cell,CTC)的蛋白定量檢測(cè)能夠直接得到腫瘤細(xì)胞的表型信息，有助于病情判斷和藥物研發(fā)[8]，然而每7.5 mL血液中僅有1～500個(gè)CTC，數(shù)量極其有限，傳統(tǒng)的針對(duì)宏觀大量細(xì)胞分析的技術(shù)存在處理?yè)p失等問(wèn)題，不能充分有效地利用這些珍稀樣本，只有單細(xì)胞蛋白定量檢測(cè)技術(shù)才能更高效地對(duì)稀有細(xì)胞進(jìn)行多種蛋白的同步多重測(cè)定[9]。

近年來(lái)各種不同的單細(xì)胞蛋白定量檢測(cè)方法不斷涌現(xiàn)，既有基于傳統(tǒng)技術(shù)不斷加以改進(jìn)的方法，也有基于微流控芯片的新技術(shù)。本文將就不同方法的原理、主要特點(diǎn)和優(yōu)缺點(diǎn)分別闡述。

1 傳統(tǒng)的單細(xì)胞蛋白定量檢測(cè)方法

1.1 熒光流式細(xì)胞術(shù)

熒光流式細(xì)胞術(shù)(florescence flow cytometry，F(xiàn)FC)是目前最主要的單細(xì)胞蛋白檢測(cè)方法。在對(duì)細(xì)胞蛋白分析時(shí)，首先將分散的單細(xì)胞用帶熒光的特異性抗體標(biāo)記后在流體聚焦作用一次通過(guò)檢測(cè)區(qū)域，含有熒光標(biāo)記的細(xì)胞被激發(fā)出熒光，可通過(guò)平均熒光強(qiáng)度來(lái)反映蛋白的相對(duì)含量[10,11]。FFC的一個(gè)重要優(yōu)勢(shì)是保持了細(xì)胞完整性，從而使細(xì)胞內(nèi)絕對(duì)含量極少的蛋白質(zhì)保持較高的濃度，提高靈敏度。此外，它具有高通量檢測(cè)能力，每秒能夠測(cè)定1×103～5×104個(gè)細(xì)胞。目前流式細(xì)胞術(shù)在結(jié)合了單克隆抗體技術(shù)、新的熒光探針(量子點(diǎn)等)和多通道檢測(cè)技術(shù)后分析參數(shù)多達(dá)10～17種[12,13]，從而允許在單個(gè)細(xì)胞中分析整個(gè)信號(hào)通路，已成為單細(xì)胞蛋白檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)[18]，應(yīng)用于細(xì)胞膜和細(xì)胞內(nèi)蛋白的檢測(cè)，比如通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞膜表面的CD系列分化抗原判斷相應(yīng)免疫細(xì)胞的比例對(duì)白血病分型，已經(jīng)是國(guó)際公認(rèn)方法[14,15]。

熒光流式細(xì)胞術(shù)對(duì)單細(xì)胞內(nèi)部蛋白檢測(cè)時(shí)，在亮度標(biāo)定時(shí)也必須使用可以等效的內(nèi)部修飾有熒光分子的標(biāo)準(zhǔn)微球與之比較熒光亮度，但是這種定量修飾技術(shù)目前并不成熟，因此流式細(xì)胞術(shù)無(wú)法用于單細(xì)胞內(nèi)蛋白的絕對(duì)定量檢測(cè)；同時(shí)由于樣品前處理需要大量單細(xì)胞，因此不適用于樣本量缺乏情況下的蛋白檢測(cè)[16]。

1.2 質(zhì)譜流式細(xì)胞術(shù)

質(zhì)譜流式細(xì)胞術(shù)(mass cytometry)，是流式細(xì)胞技術(shù)與質(zhì)譜技術(shù)的結(jié)合。首先采用重金屬元素標(biāo)記細(xì)胞中特定蛋白，然后形成單細(xì)胞液流，經(jīng)霧化后在氬等離子體中單細(xì)胞形成離子云團(tuán)，在去除基體離子的干擾后利用飛行時(shí)間質(zhì)譜儀檢測(cè)標(biāo)記元素的質(zhì)量譜，最后將原子質(zhì)量譜的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為單個(gè)細(xì)胞待測(cè)蛋白相對(duì)含量[17]。

質(zhì)譜流式細(xì)胞術(shù)最重要的特點(diǎn)是由于使用了稀土元素標(biāo)記，避免了熒光流式細(xì)胞術(shù)中的通道間串?dāng)_，并降低了背景，因而能夠同時(shí)獲取多達(dá)40個(gè)單細(xì)胞參數(shù)[12]。但是由于細(xì)胞的電離及后續(xù)的質(zhì)譜檢測(cè)過(guò)程需要一定時(shí)間，質(zhì)譜流式細(xì)胞術(shù)的檢測(cè)速度低于普通熒光流式細(xì)胞術(shù)，一般在500個(gè)細(xì)胞/s左右，并且細(xì)胞在電離分析后無(wú)法再次利用。

在質(zhì)譜流式細(xì)胞術(shù)中，將組織分散成單細(xì)胞后再進(jìn)樣，需要復(fù)雜、長(zhǎng)時(shí)間的樣品處理時(shí)間，因而檢測(cè)結(jié)果可能產(chǎn)生偏移。一種改進(jìn)方法是成像質(zhì)譜術(shù)(imaging mass cytometry，IMC)[18]。在IMC中，將固定在載玻片上的組織切片或細(xì)胞標(biāo)記上金屬同位素后，直接用高功率激光局部照射并掃描，被照射處樣品蒸發(fā)進(jìn)入質(zhì)譜儀中，這樣可快速獲得樣品的二維質(zhì)譜圖像，經(jīng)處理后反映出樣品的蛋白含量分布情況。

1.3 酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)檢測(cè)

酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)檢測(cè)(ELISpot)是一種檢測(cè)單細(xì)胞外分泌蛋白的技術(shù)。它利用底面修飾有特異性抗體的微孔板培養(yǎng)細(xì)胞并施加特定刺激，細(xì)胞的外分泌蛋白被抗體捕獲，再經(jīng)過(guò)顯色反應(yīng)，即可在細(xì)胞位置處呈現(xiàn)出斑點(diǎn)，斑點(diǎn)的數(shù)目反映了分泌該蛋白的細(xì)胞數(shù)目，由此可對(duì)相應(yīng)的單細(xì)胞比例進(jìn)行評(píng)估[19,20]。

酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法靈敏度極高，106個(gè)細(xì)胞里只要有55個(gè)細(xì)胞分泌特定蛋白即可判定結(jié)果為陽(yáng)性[21]。該方法被廣泛地應(yīng)用于免疫反應(yīng)的研究中，比如DiPiazza等人[22]用ELISpot技術(shù)表征雪貂在感染流感病毒后關(guān)鍵淋巴組織內(nèi)的白細(xì)胞組成和抗原特異性T細(xì)胞響應(yīng)情況，發(fā)現(xiàn)CD4和CD8 T細(xì)胞對(duì)多個(gè)病毒變種都有較強(qiáng)的免疫特性。該方法不能對(duì)單個(gè)細(xì)胞中的蛋白分泌量進(jìn)一步分析，因此是一種準(zhǔn)單細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)[3]。

1.4 毛細(xì)管電泳

毛細(xì)管電泳(capillary electrophoresis)是利用高壓直流電場(chǎng)(0～30 kV)對(duì)毛細(xì)管(直徑小于100 μm)內(nèi)樣品分離并檢測(cè)的技術(shù)[23,24]。首先利用電遷移、壓力等技術(shù)將單細(xì)胞移入毛細(xì)管，在樣品區(qū)采用化學(xué)、激光、電脈沖等方法裂解，在高壓電場(chǎng)作用下不同分子所帶電荷和體積大小的差異導(dǎo)致遷移速率的不同，因而到達(dá)檢測(cè)區(qū)域的時(shí)間也不同，檢測(cè)時(shí)與電化學(xué)、激光誘導(dǎo)熒光(laser-induced fluorescence,LIF)、質(zhì)譜等技術(shù)聯(lián)用，探測(cè)器輸出待測(cè)分子數(shù)按到達(dá)時(shí)間分布的電泳譜圖，利用峰的高度或面積可進(jìn)行絕對(duì)定量或半定量分析。

毛細(xì)管電泳利用毛細(xì)管和電泳技術(shù)具備了單細(xì)胞操縱和蛋白分離能力，具有高靈敏度、超低進(jìn)樣量、多組分分析的特點(diǎn)。但是受限于進(jìn)樣方式，毛細(xì)管電泳很難實(shí)現(xiàn)對(duì)大量單細(xì)胞的快速檢測(cè)[25]。

2 基于微流控技術(shù)的單細(xì)胞蛋白定量檢測(cè)方法

微流控技術(shù)由于特征尺寸與細(xì)胞大小相匹配，在單細(xì)胞的操縱與特性檢測(cè)方面具有明顯優(yōu)勢(shì)。因此將單細(xì)胞蛋白檢測(cè)與微流控技術(shù)結(jié)合，利用芯片上的微通道使細(xì)胞懸浮液在流體驅(qū)動(dòng)下分散成單細(xì)胞，再綜合片上培養(yǎng)、裂解、電泳、免疫反應(yīng)等技術(shù)實(shí)現(xiàn)待測(cè)蛋白的提取與純化，最后基于免疫熒光、原子力顯微鏡、質(zhì)譜等技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)單細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)量的分析[26,27]。

微流控芯片結(jié)構(gòu)的不同使得可檢測(cè)蛋白種類(lèi)、檢測(cè)通量、靈敏度也有所差異，下面分類(lèi)闡述基于微流控技術(shù)的單細(xì)胞蛋白分析方法。

2.1 片上流式法

片上流式法是利用微流控技術(shù)在芯片上實(shí)現(xiàn)傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀而對(duì)單細(xì)胞蛋白分析的一種方法。與傳統(tǒng)的流式細(xì)胞術(shù)相比，片上流式法的優(yōu)勢(shì)在于對(duì)少量樣品(數(shù)百至數(shù)千個(gè))比如稀有細(xì)胞的檢測(cè)，對(duì)細(xì)胞個(gè)數(shù)需求從104減少到102個(gè)。但是與常規(guī)流式細(xì)胞術(shù)問(wèn)題相似，微型流式細(xì)胞術(shù)同樣因標(biāo)定方法限制而無(wú)法絕對(duì)定量檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)蛋白[28]。

2.2 微孔陣列法

微孔陣列法是一種利用片上微孔被動(dòng)捕獲單細(xì)胞后培養(yǎng)并檢測(cè)的技術(shù)[41]。其原理是利用微加工技術(shù)制作出比單細(xì)胞尺寸略大的微孔陣列，然后滴上低濃度的單細(xì)胞懸浮液，微孔中將以一定概率落入單細(xì)胞，再覆蓋上表面修飾有特異性抗體的玻璃板并培養(yǎng)，細(xì)胞的特定分泌蛋白被抗體捕獲，從而實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞蛋白檢測(cè)[29]。Love J C等人[30]在聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane,PDMS)表面利用軟光刻法加工出20～50 μm的微孔，利用上述方法檢測(cè)到微孔中低至0.1 mol/L的免疫球蛋白。該方法能夠一次檢測(cè)多種蛋白，并可對(duì)細(xì)胞再回收。但它只能檢測(cè)分泌蛋白，同時(shí)受限于芯片尺寸和單細(xì)胞形成率，一次實(shí)驗(yàn)只能獲得低于3 000～10 000個(gè)細(xì)胞的數(shù)據(jù)，因此檢測(cè)通量較低。

2.3 微溝道陣列法

微溝道陣列法，也稱(chēng)為單細(xì)胞條碼芯片。芯片上的微通道底部按空間位置不同修飾有相應(yīng)捕獲抗體，形成一個(gè)個(gè)“編碼”條帶，細(xì)胞懸浮液從芯片一端注入檢測(cè)通道后，通過(guò)片上集成微閥將細(xì)胞分隔到數(shù)千個(gè)腔室中形成單細(xì)胞，該方法不僅可以檢測(cè)細(xì)胞外分泌蛋白，還可以從其他通道注入裂解液，裂解細(xì)胞，提取單細(xì)胞內(nèi)目標(biāo)蛋白，進(jìn)行定量分析[31]。Ma C等人[32]利用該方法實(shí)現(xiàn)了同時(shí)定量測(cè)定多達(dá)20種蛋白，靈敏度為100～1 000個(gè)蛋白分子，并應(yīng)用于血液檢測(cè)中。該方法可以絕對(duì)定量檢測(cè)單細(xì)胞特定蛋白，但是由于芯片上集成了多種結(jié)構(gòu)，操作復(fù)雜，也限制了檢測(cè)通量。

2.4 單細(xì)胞蛋白印跡法

單細(xì)胞蛋白印跡法擴(kuò)展了傳統(tǒng)的Western Blot方法的應(yīng)用范圍。首先利用軟光刻法在光敏膠(polyacrylamide gel)上加工微孔，利用稀溶液得到單細(xì)胞后，在孔內(nèi)原位裂解，再直接進(jìn)行片上凝膠電泳，將不同分子量的蛋白分離，可對(duì)12種蛋白同時(shí)分析[33]。Sinkala E等人[9]利用該方法實(shí)現(xiàn)了乳腺癌CTC的篩查并對(duì)CTC之間蛋白標(biāo)志物的差異進(jìn)行了分析。目前利用該技術(shù)已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了一種商業(yè)化的單細(xì)胞分析儀器MiloTM，一次能對(duì)1 000～2 000個(gè)單細(xì)胞的4種蛋白檢測(cè)。但是這種方法通過(guò)比較顏色深淺來(lái)判斷待測(cè)蛋白的相對(duì)含量，無(wú)法獲得蛋白的絕對(duì)定量結(jié)果。

3 結(jié) 論

單細(xì)胞水平的蛋白質(zhì)定量檢測(cè)結(jié)果能夠揭示出細(xì)胞之間的差異，更精細(xì)地反映生命事件的發(fā)生過(guò)程，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞群體中的單個(gè)或稀有細(xì)胞蛋白質(zhì)數(shù)量差異的快速鑒別和發(fā)現(xiàn)，從而對(duì)生命現(xiàn)象本質(zhì)的解釋、人類(lèi)的健康起到促進(jìn)作用。面向單細(xì)胞的蛋白定量檢測(cè)需求越來(lái)越多，但是也充滿(mǎn)著挑戰(zhàn)。原因一方面在于細(xì)胞尺寸小(一般哺乳動(dòng)物的體細(xì)胞直徑約為10～20 μm)，給大量單細(xì)胞的獲取和處理帶來(lái)了極大的困難；另一方面在于細(xì)胞組分復(fù)雜，單個(gè)細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)含量極低，檢測(cè)時(shí)基質(zhì)干擾較大[33]。因此,理想的單細(xì)胞蛋白檢測(cè)方法應(yīng)具備高靈敏度、高選擇性、高通量、能絕對(duì)定量特點(diǎn)。

目前，單細(xì)胞蛋白定量檢測(cè)技術(shù)仍然處于探索、發(fā)展階段，雖然已經(jīng)初步實(shí)現(xiàn)了單細(xì)胞蛋白定量檢測(cè)，但在檢測(cè)范圍、檢測(cè)實(shí)時(shí)性、絕對(duì)定量等方面仍有很大的提升空間，將來(lái)必定向著多參數(shù)、高特異性、高準(zhǔn)確度、可實(shí)時(shí)性的方向發(fā)展，并最終應(yīng)用于臨床，造福人類(lèi)。