吳侃 王秋菊

常染色體顯性遺傳性耳聾(autosomal dominant sensorineural hearing loss，ADNSHL)是一種遺傳異質(zhì)性明顯的疾病，目前已發(fā)現(xiàn)38個基因與之相關(guān)(http://hereditaryhearingloss.org)。1992年Leon等[1]在一個哥斯達黎加耳聾家系，利用限制性片段長度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphisms, RFLP)標記的方法定位了第一個常染色體顯性遺傳性耳聾基因座位，即DFNA1。1997年Lynch等[2]確定DFNA1型耳聾致病基因為DIAPH1。20年來，已有數(shù)個DIAPH1基因突變引起的遺傳性耳聾家系被報道，大多數(shù)患者表現(xiàn)為遲發(fā)性聽力損失伴或不伴血液學異常。此外，還發(fā)現(xiàn)DIAPH1基因突變與常染色體隱性遺傳小頭綜合征相關(guān)。遺傳性耳聾具有明顯的表型多樣性和遺傳異質(zhì)性。以往由于上一代測序技術(shù)的局限，耳聾基因及突變的發(fā)現(xiàn)無異于大海撈針。近些年來，二代測序技術(shù)的發(fā)展使基因突變的發(fā)現(xiàn)速度大大加快，因此，有必要對一些常見或具有特征性的基因及突變進行梳理和總結(jié)。DIAPH1被認為是少數(shù)幾種與低頻聽力損失相關(guān)的耳聾基因之一[2～5]。本文將從基因的結(jié)構(gòu)、功能及相關(guān)臨床表型對DIAPH1基因研究進行梳理，以加深對DIAPH1基因型-表型的關(guān)聯(lián)性認識和臨床遺傳咨詢指導(dǎo)。

1 DIAPH1基因的結(jié)構(gòu)

DIAPH1基因(OMIM:* 602121)全稱diaphanous related formin 1，其他名稱有：DIA1、DRF1、DFNA1、LFHL1、SCBMS、hDIA1。定位于5q31.3，基因組位置chr5:141,515,021-141,619,055，全長104 035 bp，cDNA含28個外顯子。由于剪接位點的不同，人類DIAPH1基因有3種不同的轉(zhuǎn)錄變異體(transcript variants)(表1)，包括isoform 1、isoform 2、isoform 3。其中，isoform 1編碼的蛋白質(zhì)最長，常作為DIAPH1基因編碼DNA的標準序列，其mRNA全長5 804 bp，蛋白質(zhì)編碼區(qū)域在mRNA的142 bp～3 960 bp區(qū)域，編碼含有1 272個氨基酸的蛋白質(zhì)。

表1 DIAPH1基因的不同轉(zhuǎn)錄本檢索號及長度和其編碼的蛋白質(zhì)及氨基酸*

注：*來源于https://www.ncbi.nlm.nih.gov/

DIAPH1基因編碼的蛋白質(zhì)diaphanous homolog 1屬于diaphanous相關(guān)成蛋白家族(diaphanous-related formins)，目前已發(fā)現(xiàn)了該家族的3個亞型(DIAPH1、DIAPH2、DIAPH3)，其中DIAPH2與X-連鎖的卵巢功能早衰相關(guān)[6]，DIAPH3與聽神經(jīng)病相關(guān)[7]，也有文獻[8～10]報道其通過重構(gòu)細胞骨架來調(diào)節(jié)細胞的運動，從而與腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)。而DIAPH1是一種多結(jié)構(gòu)域蛋白(圖1)，包含GBD結(jié)構(gòu)域(diaphanous GTPase-binding domain)，長度184個氨基酸殘基(84～268)；FH3/DID結(jié)構(gòu)域(diaphanous FH3 domain/ diaphanous inhibitory domain)，長度為192個氨基酸殘基(274～466)；FH1結(jié)構(gòu)域(formin homology region 1)，長度為148個氨基酸殘基(616～764)；FH2結(jié)構(gòu)域(formin homology 2 domain)，長度為437個氨基酸殘基(770～1 207)；DAD結(jié)構(gòu)域(diaphanous auto-regulatory domain)，長度為28個氨基酸殘基(1 194～1 222)。目前認為CC(coiled-coil)結(jié)構(gòu)域(470～550)參與了FH2二聚體的形成[11]；FH3是否作為一個獨立的有作用的結(jié)構(gòu)域仍然有待研究[12]；DID結(jié)構(gòu)域(129～369)是FH3結(jié)構(gòu)域上一段靠近N-末端的氨基酸肽鏈，不容易被蛋白酶所降解[13]，DAD結(jié)構(gòu)域(1 194～1 222)并不是嚴格意義上的結(jié)構(gòu)域，而是一段FH2結(jié)構(gòu)域C末端側(cè)的20～30個氨基酸序列[14]。

2 DIAPH1基因的功能研究

DIAPH1基因在肌動蛋白微絲和微管細胞骨架組裝過程中起到重要的調(diào)節(jié)作用，其蛋白是Rho小GTP結(jié)合蛋白的效應(yīng)蛋白[12～14]。靜止狀態(tài)下C-末端的DAD結(jié)構(gòu)域與N末端的FH3/DID結(jié)構(gòu)域相互作用，DIAPH1蛋白處于自抑制狀態(tài)。而Rho小GTP結(jié)合蛋白通過占據(jù)DIAPH1蛋白N末端的GBD結(jié)構(gòu)域的結(jié)合部位[13～15]，在某些共同作用因子(co-facters)的協(xié)助下分兩步解除了自抑制作用[16, 17]。FH1結(jié)構(gòu)域以多聚脯氨酸序列為特征，是profilin(肌動蛋白單體結(jié)合蛋白)的結(jié)合位[18～21]。解除自抑制作用后的FH2結(jié)構(gòu)域在結(jié)合了profilin蛋白的FH1結(jié)構(gòu)域幫助下，將肌動蛋白的單體連接到肌動蛋白微絲barbed末端[22]，促進了聚集成核、延伸、加帽及微絲延長等過程，最終對細胞的粘附、遷移，對損傷和感染做出應(yīng)答的過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[23～25]。

3 DIAPH1基因突變及其相關(guān)表型

1997年以來，共有來自哥斯達黎加、韓國、德國、英國、法國、日本等6個國家的學者報道了該基因的6個雜合突變與常染色體顯性遺傳性遲發(fā)性聾相關(guān)。本文根據(jù)王秋菊等[26]翻譯整理的2015年ACMG指南和遺傳變異致病性評價的相關(guān)文獻[27]對這些變異致病性進行重新評價(表2)，并總結(jié)DIAPH1蛋白結(jié)構(gòu)上的突變定位(圖1)，對臨床表型進行總結(jié)梳理(表3、4)。

圖1 DIAPH1蛋白質(zhì)(NP_005210.3)結(jié)構(gòu)域及已知致病突變定位 ?原文使用isoform 2作為轉(zhuǎn)錄本;??表型為常染色體顯性遺傳性聽力損失伴或不伴血液學異常;???表型為常染色體隱性遺傳性小頭綜合征

表2 已報道的常染色體顯性遺傳DIAPH1突變特征及ACMG指南致病性分析

注：*原文中DIAPH1突變致病性證據(jù)按ACMG指南的標準并不充分，劃為可能致?。?*原文轉(zhuǎn)錄本為isoform 2(NM_001079812.2)，余文獻轉(zhuǎn)錄本為isoform 1(NM_005219.4)；***在ACMG指南中，共分離證據(jù)的強度是PP到PS逐漸增加的，但并沒有給予相應(yīng)的編號，故此處以PS表示強的共分離證據(jù)。

表3 已報道的常染色體顯性遺傳DIAPH1突變的氨基酸改變及其表型特征

注：*MTP(macrothrombocytopenia，巨血小板減少癥)；**NA文中未提及

表4 已報道的常染色體隱性遺傳DIAPH1突變及其表型特征

注：*MTP(macrothrombocytopenia，巨血小板減少癥)；**NA文中未提及

3.1常染色體顯性遺傳非綜合征型耳聾 1997年Lynch等[2]報道了1個8代相傳常染色體顯性遺傳性耳聾的哥斯達黎加大家系(M家系)，利用家系連鎖分析、Sanger測序和定位克隆技術(shù)，將DFNA1型耳聾基因定位于5q31.3的DIAPH1基因；其發(fā)現(xiàn)該家系中耳聾患者DIAPH1基因倒數(shù)第2個外顯子存在一個G到T的替換，使剪切位點后移，并插入4 bp(TTAA)的堿基，造成下游序列框移突變和翻譯提前終止；突變基因翻譯出的蛋白質(zhì)含有21個異常氨基酸，尾部缺失32個氨基酸；家系中的患者多為10歲左右發(fā)病，起病時為低頻聽力損失，逐漸發(fā)展，至30歲左右發(fā)展為雙側(cè)全頻極重度聽力損失。隨后Lalwani等[28]對該家系患者表型進行了進一步的描述，并推測內(nèi)淋巴積水有可能是該家系患者出現(xiàn)低頻聽力損失的機制之一。受制于測序方法的局限性，隨后15年并沒有再發(fā)現(xiàn)DIAPH1相關(guān)性DFNA1型耳聾，直到2012年Baek等[29]利用新一代測序技術(shù)，在韓國8個小家系中發(fā)現(xiàn)了5種已知耳聾基因的罕見突變位點，其中之一為DIAPH1基因的錯義突變c.2032 C>T(p.Pro678Ser)；該突變位于16號外顯子，造成位于FH1結(jié)構(gòu)域的多聚-L-脯氨酸延伸結(jié)構(gòu)上的疏水的脯氨酸變?yōu)橛H水的絲氨酸，作者猜測其可能對肌動蛋白聚合產(chǎn)生影響，最終擾亂耳蝸毛細胞的極性；家系中患者表型符合DIAPH1相關(guān)性耳聾低頻聽力損失的特點，多數(shù)5～10歲發(fā)病，無其他伴隨癥狀。但參照ACMG遺傳變異分類標準與指南[26]，該家系中兩代4名成員共分離，計算得知N=1/2×1/2=1/4，BF=3.99～1/N，達不到有效的共分離證據(jù)的標準[27]，因此，在文中只能找到1個PM2、1個PP3、1個PP4的證據(jù)，該突變只能被列為可能致病突變。同樣是錯義突變，2017年Kang等[30]報道的DIAPH1新突變c.1589T > G(p.Ile530Ser)，因家系較大，可得出強的共分離證據(jù)PS(強的共分離證據(jù)在ACMG指南中沒有相對應(yīng)的PS編號)，文中共找到1個PS、1個PM2、1個PP3和1個PP4的證據(jù)，也僅能得出可能致病突變的結(jié)論。該錯義突變位于15號外顯子，推測非極性的異亮氨酸被極性的絲氨酸所替代，氨基酸極性的變化使CC(coiled-coil)結(jié)構(gòu)域螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性降低，是DIAPH1突變致病的新假說，但仍需要進一步的功能研究提供更強烈的致病性證據(jù)。

3.2常染色體顯性遺傳性耳聾伴血液學異常 2016年Stritt等[31]首次發(fā)現(xiàn)DIAPH1致病突變c.3637C>T(p.Arg1213Ter)不僅引起感音神經(jīng)性聽力損失，還與巨血小板減少癥(macrothrombocytopenia，MTP)相關(guān);MTP表現(xiàn)為血小板體積增大和數(shù)目減少，作者將這種綜合征樣表型命名為DIAPH1-RD(DIAPH1相關(guān)性疾病)；在電鏡下觀察可見患者血小板形態(tài)出現(xiàn)異常：細長而含顆粒少，球形而顆粒多，細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)空泡和膜復(fù)合物；部分患者可伴有中性粒細胞減少癥(neutropenia)和出血傾向(abnormal bleeding symptom)；作者推測該突變導(dǎo)致1 213位精氨酸被終止密碼子替代，造成翻譯提前終止，截短的DIAPH1變異蛋白缺少DAD base RRKR模體(1 213～1 216)，導(dǎo)致DAD-DID蛋白復(fù)合體無法形成，使DIAPH1喪失自我抑制調(diào)節(jié)能力；而前血小板的形成過程與上述DIAPH1對肌動蛋白和微管細胞骨架的動力學負調(diào)節(jié)作用相關(guān)[32]；但文中并沒有詳細描述患者聽力損失的表型特征。Neuhaus等[33]研究發(fā)現(xiàn)位于DIAPH1基因27號外顯子的框移突變 p.Ala1210SerfsTer31(c.3624_3625delAG)和無義突變c.3637C>T (p.Arg1213Ter)同樣引起了類似的DIAPH1-RD，并且詳細分析了患者的聽力損失特征，發(fā)現(xiàn)與以往DIAPH1突變引起低頻聽力損失不同，該突變患者表現(xiàn)為先天性中高頻聽力損失并且快速進展，部分患者伴中性粒細胞減少癥和出血傾向。有研究[33]使用免疫熒光技術(shù)研究了DIAPH1在小鼠耳蝸細胞及神經(jīng)結(jié)構(gòu)的分布，發(fā)現(xiàn)在耳蝸中的內(nèi)柱細胞(IPC)、外毛細胞(OHC)基底部(可能為Deiter細胞)、螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元、蝸神經(jīng)中心區(qū)域以及雪旺細胞和少突膠質(zhì)細胞之間的交界區(qū)域都有DIAPH1的分布；推測上述突變可能影響肌動蛋白和微管的重構(gòu)，導(dǎo)致內(nèi)耳細胞和巨核細胞中細胞骨架和剛性結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，是耳聾伴隨巨核細胞血小板減少癥的機制之一，因此，建議將血常規(guī)檢查作為常染色體顯性遺傳性耳聾患者的的常規(guī)檢查項目，以幫助鎖定具有綜合征樣表型特征的DIAPH1基因突變。同樣的無義突變和類似綜合征樣表型也見于Ganaha等[34]的報道，該研究提出位于DAD結(jié)構(gòu)域的突變位點c.3637C>T(p.Arg1213Ter)是該基因的熱點突變位點；不同的是該文中家系患者的血小板數(shù)量比Strilt等[31]的報道更少，且隨著年齡增長而減少，因此推測血小板減少也是漸進性的；文中指出MYH9相關(guān)性綜合征如：May-Hegglin anomaly(OMIM 155100)、Fechtner syndrome(OMIM 153640)、Epstain syndrome(OMIM 153650)、Sebastian syndrome(OMIM 606249)也表現(xiàn)為聽力損失及MTP，因此，建議有DIAPH1-RD的患者需要同時檢測DIAPH1和MYH9基因。但常染色體顯性遺傳性耳聾伴血小板減少癥分子機制目前尚未明確。

另外，Ueyama等[35]使用不同的轉(zhuǎn)錄本isoform 2(NM_001079812.2)在2個日本家系中檢出DIAPH1基因c.3610C>T突變(p.Arg1204 Ter)，在蛋白質(zhì)水平突變同樣位于DAD結(jié)構(gòu)域，患者表現(xiàn)為兒童期發(fā)病，聽力損傷為輕中度，以高頻為主，迅速發(fā)展為雙側(cè)全頻重度感音性聾；該研究利用DIA1(R1204 Ter)-TG mice(轉(zhuǎn)基因小鼠)構(gòu)建的動物模型對該突變造成的臨床表型、耳蝸細胞形態(tài)學改變做了較深入的研究，印證了該無義突變引起翻譯過程提前終止，DADbase RRKR(1204-1207)模體的缺失是該突變的作用機制；但該研究并沒有做血液學的相關(guān)檢測。

3.3常染色體隱性遺傳性小頭綜合征 除了常染色體顯性遺傳導(dǎo)致感音神經(jīng)性聽力損失伴或不伴血液學異常，曾有中東地區(qū)的學者[36, 37]報道過3個近親結(jié)婚的家庭成員出現(xiàn)DIAPH1純合突變相關(guān)的小頭綜合征，可出現(xiàn)小頭畸形、智力障礙、癲癇、身材矮小、皮質(zhì)盲、呼吸道疾病等綜合征樣表型，但患者及其雜合突變攜帶者的父母均未出現(xiàn)聽力損失。突變造成了DIAPHI蛋白FH2、DAD等重要結(jié)構(gòu)域的缺失，DIAPH1的表達與紡錘體中心體有關(guān)，從而影響了神經(jīng)元細胞的有絲分裂和遷移，最終限制了大腦的發(fā)育[36]。Ercan-Sencicek等[36]專門研究了DIAPH1在內(nèi)耳和神經(jīng)系統(tǒng)的分布，發(fā)現(xiàn)外周神經(jīng)和聽覺中樞、聽神經(jīng)的髓鞘組成部分雪旺細胞和少突膠質(zhì)細胞中存在大量的DIAPH1分布，推測神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘的缺陷可能是DIAPH1純合突變引起常染色體隱性遺傳性小頭綜合征的機制之一。至于DIAPH1純合突變的患者不出現(xiàn)聽力損失而存在小頭綜合征的機制仍然有待研究(突變位點定位見圖1，臨床表現(xiàn)見表4)。

4 總結(jié)和展望

綜上所述，DIAPH1基因突變可引起常染色體顯性遺傳的遲發(fā)性感音神經(jīng)性耳聾伴或不伴血液學異常及常染色體隱性遺傳性小頭綜合征。作為DFNA1型耳聾的致病基因，以往認為DIAPH1基因突變主要與低頻遺傳性耳聾相關(guān)，兒童期發(fā)病，30歲左右發(fā)展至重度到極重度全頻聽力損失；近年來一些文獻報道該突變也可引起中高頻聽力損失，體現(xiàn)了常染色體顯性遺傳性耳聾的表型多樣性。但多數(shù)文獻中家系患者例數(shù)較少，受環(huán)境等因素影響較大，無法確定聽力損失特征的可靠性。既往報道伴血液學異常的DIAPH1相關(guān)性耳聾患者多數(shù)沒有出血等臨床癥狀，血小板數(shù)目及大小與DIAPH1基因突變是否有關(guān)尚需進一步研究，且MYH9基因相關(guān)性綜合征型耳聾也可有類似的血液學異常，因此，檢測血液指標對于DIAPH1相關(guān)性耳聾的診斷及治療尚沒有明確的臨床意義。

迄今為止已發(fā)現(xiàn)的該基因突變除了2種錯義突變位于16號外顯子，其余突變均位于第27號外顯子，造成框移突變或無義突變，相應(yīng)突變導(dǎo)致DIAPH1蛋白自抑制相關(guān)的DAD結(jié)構(gòu)域(1 194～1 222)重要部分，如：DAD base RRKR motif (1 213～1 216)缺失或使剪切位點后移，造成翻譯提前終止和異常蛋白質(zhì)生成。特別是無義突變c.3637C>T(p.Arg1213Ter)在多個家系中被發(fā)現(xiàn)，可能是DFNA1型耳聾的熱點突變。根據(jù)ACMG指南，c.1589T>G(p.Ile530Ser)和c.2032 C>T(p.Pro678Ser)兩種錯義突變的致病性尚需進一步功能研究來明確。

近年來，遺傳學、分子生物學、細胞生物學、二代測序技術(shù)、生物信息學的發(fā)展極大地推動了遺傳性耳聾致病突變的發(fā)現(xiàn)和功能研究。目前只發(fā)現(xiàn)一個DIAPH1突變大家系的表型呈現(xiàn)為特征性的低頻聽力損失，該基因與特征性表型的相關(guān)性尚待大家系的發(fā)現(xiàn)和深入的基因型-表型分析。該基因與血液學異常和小頭綜合征的關(guān)系仍缺乏深入的基礎(chǔ)研究。圍繞DIAPH1基因與相關(guān)突變的深入研究將幫助人類加深對遺傳性耳聾的認識，有利于揭示相關(guān)疾病的發(fā)病機理、臨床表型、發(fā)展及預(yù)后，為遺傳性耳聾的臨床診斷，特別是低頻聽力損失為主的常染色體顯性遺傳性耳聾的診斷提供參考，為遺傳咨詢工作和耳聾基因的診斷提供理論依據(jù)。