寸靜宇，劉秋月，王翔宇，狄 冉，胡文萍，張效生，張金龍，趙永聚，儲(chǔ)明星*

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)部動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；2.西南大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，重慶 400715；3.天津市畜牧獸醫(yī)研究所，天津 300381）

哺乳動(dòng)物的季節(jié)性繁殖受下丘腦-垂體-性腺軸（HPGA）的反饋調(diào)節(jié)，促甲狀腺激素（TSH）和促甲狀腺激素受體（TSHR）作為HPGA軸上的激素，在其逆向通路中發(fā)揮著重要作用[1]。TSH是一類糖蛋白激素，主要由垂體前葉分泌，其分泌受光照影響，從而表現(xiàn)出明顯的晝夜節(jié)律變化[2]。TSH通過(guò)與TSHR特異性結(jié)合后行使生物學(xué)功能，功能之一就是調(diào)控哺乳動(dòng)物的季節(jié)性繁殖過(guò)程[3]。TSH、TSHR通過(guò)誘導(dǎo)下丘腦2型脫碘酶基因（TypeⅡIodothyronine Deiodinase Gene，DIO2）和3型脫碘酶基因（Type Ⅲ Iodothyronine Deiodinase Gene，DIO3）的表達(dá)來(lái)調(diào)控甲狀腺激素（T2、T3、T4、rT3等）的動(dòng)態(tài)平衡，進(jìn)而調(diào)控GnRH（Gonadotropin Releasing Hormone）基因表達(dá)，最終影響綿羊的產(chǎn)羔能力[4]。因此，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)TSHR基因與哺乳動(dòng)物季節(jié)性繁殖的關(guān)系進(jìn)行了大量研究。全基因組重測(cè)序是目前功能基因挖掘最主要的方式之一[5-8]。國(guó)外研究者使用該方法在雞[4,9]和綿羊[10-11]中檢測(cè)到TSHR基因與季節(jié)性繁殖調(diào)控有重要關(guān)系。

另外，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)TSHR基因的多態(tài)性分析主要集中于與動(dòng)物季節(jié)性繁殖性狀關(guān)聯(lián)[12-15]，尚未出現(xiàn)關(guān)于TSHR基因多態(tài)性與羊產(chǎn)羔性狀相關(guān)聯(lián)的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)室猜測(cè)，TSHR基因除了調(diào)控季節(jié)性繁殖，還可以調(diào)控綿羊的產(chǎn)羔性狀。鑒于此，本實(shí)驗(yàn)室前期通過(guò)對(duì)10個(gè)綿羊品種99個(gè)綿羊個(gè)體進(jìn)行全基因組重測(cè)序[7]，篩選出與小尾寒羊產(chǎn)羔數(shù)相關(guān)的候選基因TSHR3個(gè)多態(tài)位點(diǎn)g.89430525G＞A、g.89363881T＞C和g.89431097C＞G，并使用Sequenom MassARRAY?SNP分型技術(shù)對(duì)這3個(gè)SNPs進(jìn)行檢測(cè)，以探討TSHR基因多態(tài)性與綿羊季節(jié)性繁殖的相關(guān)性，同時(shí)找到其與綿羊產(chǎn)羔之間的關(guān)系，為綿羊多羔性狀的機(jī)理研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)樣品 共采集760只羊的血液，其中有產(chǎn)羔數(shù)記錄的小尾寒羊380只，沒有產(chǎn)羔數(shù)記錄的380只。無(wú)產(chǎn)羔記錄的包括多羔且常年發(fā)情的小尾寒羊（27只）、策勒黑羊（48只）、湖羊（101只），單羔且季節(jié)性發(fā)情的灘羊（22只）、蘇尼特羊（21只）和草原型藏羊（161只）。

1.2 血液DNA的提取 實(shí)驗(yàn)綿羊血液樣本DNA提取使用血液DNA試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司）進(jìn)行，采用Nano Drop2000檢測(cè)DNA樣本濃度，應(yīng)用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量。

1.3 基因分型 采用 Sequenom MassARRAY?SNP 分型技術(shù)對(duì)TSHR基因 g.89430525G＞A、g.89363881T＞C和g.89431097C＞G位點(diǎn)進(jìn)行分型檢測(cè)，分型樣品為DNA，每個(gè)樣品需要量為20 μL，DNA濃度為40～80 ng/μL。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 應(yīng)用Microsoft Excel 2016軟件統(tǒng)計(jì)綿羊TSHR基因g.89430525G＞A、g.89363881T＞C和g.894 31097C＞G位點(diǎn)的基因型頻率、等位基因頻率、多態(tài)信息含量（PIC）、雜合度（He）和有效等位基因數(shù)（Ne），并進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)。使用最小二乘方差分析模型：

其中，yijkl為產(chǎn)羔數(shù)的記錄值，μ為群體平均值，LSi為第i個(gè)產(chǎn)羔季節(jié)的固定效應(yīng)，Pj為第j個(gè)胎次的固定效應(yīng)，Gk為TSHR基因第k種基因型的固定效應(yīng)，eijkl為隨機(jī)殘差效應(yīng)。用SPSS 19.0軟件程序中一般線性模型完成小尾寒羊基因型與產(chǎn)羔表型數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)分析，所有數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1TSHR基因多態(tài)性分析 分型發(fā)現(xiàn)TSHR基因g.89430525G＞A位點(diǎn)在小尾寒羊中有AA、AG和GG 3種基因型；g.89363881T＞C位點(diǎn)有TT、CT和CC 3種基因型； g.89431097C＞G位點(diǎn)有CC、CG和GG 3種基因型。

從表1可知，TSHR基因g.89430525G＞A、g.8936 3881T＞C和g.89431097C＞G位點(diǎn)基因型頻率和等位基因頻率在常年發(fā)情、季節(jié)性發(fā)情品種間差異極顯著（P＜0.01）。就g.89430525G＞A位點(diǎn)而言，AA基因型為常年發(fā)情品種中的優(yōu)勢(shì)基因型，A為優(yōu)勢(shì)等位基因；就g.89363881T＞C位點(diǎn)而言，常年發(fā)情品種中TT為優(yōu)勢(shì)基因型，T為優(yōu)勢(shì)等位基因；就g.89431097C＞G位點(diǎn)而言，常年發(fā)情品種中GG為優(yōu)勢(shì)基因型。

從表2可知，TSHR基因g.89430525G＞A和g.893 63881T＞C位點(diǎn)在策勒黑羊、g.89430525G＞A位點(diǎn)在小尾寒羊、g.89363881T＞C位點(diǎn)在灘羊、g.89431097C＞G位點(diǎn)在小尾寒羊和策勒黑羊中表現(xiàn)為低度多態(tài)，這3個(gè)位點(diǎn)在其他品種中均表現(xiàn)為中度多態(tài)。卡方適合性檢驗(yàn)結(jié)果表明，除了小尾寒羊在g.89430525G＞A、g.89363881T＞C和g.89431097C＞G位點(diǎn)中處于哈代溫伯格不平衡狀態(tài)外（P＜0.05），這3個(gè)位點(diǎn)在其余品種中均處于哈代溫伯格平衡狀態(tài)（P＞0.05）。

2.2TSHR基因多態(tài)與綿羊產(chǎn)羔性狀的關(guān)聯(lián)分析 由表3可知，TSHR基因g.89431097C＞G的多態(tài)性與小尾寒羊第1～3胎的產(chǎn)羔數(shù)顯著相關(guān)（P＜0.05），其中CC型母羊的產(chǎn)羔數(shù)顯著低于CG和GG型母羊（P＜0.05）。而g.89363881T＞C和g.89430525G＞A的多態(tài)性與小尾寒羊各胎產(chǎn)羔數(shù)均無(wú)顯著相關(guān)（P＞0.05）。

表1 TSHR基因不同SNP位點(diǎn)在常年發(fā)情、季節(jié)性發(fā)情綿羊品種中的基因型頻率和等位基因頻率

3 討 論

3.1TSHR基因與畜禽季節(jié)性繁殖之間的關(guān)系 本實(shí)驗(yàn)室前期通過(guò)全基因組重測(cè)序[6]，篩選出與綿羊季節(jié)性繁殖性狀密切相關(guān)的TSHR基因g.89430525G＞A、g.89363881T＞C 和 g.89431097C＞G 3個(gè) 位 點(diǎn)， 對(duì) 這3個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)性進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，TSHR基因g.894 30525G＞A、g.89363881T＞C和g.89431097C＞G位點(diǎn)在絕大多數(shù)的綿羊品種中有較強(qiáng)的選擇潛力，而在策勒黑羊中選擇潛力較低，說(shuō)明這些位點(diǎn)在小尾寒羊、湖羊、策勒黑羊、蘇尼特羊、灘羊和草原型藏羊6個(gè)綿羊群體中的變異程度存在一定差異，可能是由于策勒黑羊品種遺傳多樣性相對(duì)貧乏，也可能與所選擇的策勒黑羊樣本量不同有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中，TSHR基因g.89430525G＞A、g.89363881T＞C和g.89431097C＞G位點(diǎn)基因型頻率和等位基因頻率在常年發(fā)情（小尾寒羊、湖羊和策勒黑羊）與季節(jié)性發(fā)情（蘇尼特羊、灘羊和草原型藏羊）綿羊品種間差異極顯著，說(shuō)明這3個(gè)位點(diǎn)與綿羊季節(jié)性繁殖性狀有較強(qiáng)的關(guān)聯(lián)。通過(guò)全基因組重測(cè)序發(fā)現(xiàn)，TSHR作為雞和綿羊季節(jié)性繁殖性狀候選基因受到強(qiáng)烈的選擇[4,9-11]，說(shuō)明深入研究TSHR基因的功能有重要意義，與本研究的結(jié)果趨勢(shì)一致。這3個(gè)位點(diǎn)都在草原型藏羊和蘇尼特羊中遺傳變異較大，說(shuō)明在這2個(gè)季節(jié)性繁殖品種中選育有望獲得較大的進(jìn)展。另外，除了小尾寒羊在g.89430525G＞A、g.89363881T＞C和g.89431097C＞G位點(diǎn)中處于哈代溫伯格不平衡狀態(tài)外，這3個(gè)位點(diǎn)在其余品種中均處于哈代溫伯格平衡狀態(tài)，表明經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的選擇和進(jìn)化，這3個(gè)位點(diǎn)在適應(yīng)性方面具有一定的遺傳優(yōu)勢(shì)。以上結(jié)果說(shuō)明，TSHR基因的這3個(gè)SNP位點(diǎn)可能與常年發(fā)情、季節(jié)性繁殖性狀密切相關(guān)。不同的常年發(fā)情綿羊品種和季節(jié)性繁殖綿羊品種在這些位點(diǎn)的基因型頻率和等位基因頻率基本趨于一致，提示TSHR基因可能在綿羊季節(jié)性繁殖性狀的調(diào)控中起到至關(guān)重要的作用。

表2 TSHR基因不同SNP位點(diǎn)在不同綿羊品種中的群體遺傳學(xué)分析

表3 TSHR基因不同位點(diǎn)各基因型小尾寒羊產(chǎn)羔數(shù)最小二乘均值及標(biāo)準(zhǔn)誤

3.2TSHR基因與綿羊產(chǎn)羔數(shù)之間的關(guān)系 本研究發(fā)現(xiàn)，TSHR基因g.89431097C＞G的多態(tài)性與小尾寒羊第1～3胎的產(chǎn)羔數(shù)呈顯著相關(guān)，而g.89363881T＞C和g.89430525G＞A的多態(tài)性與小尾寒羊各胎產(chǎn)羔數(shù)均無(wú)顯著相關(guān)。目前尚沒有關(guān)于綿羊TSHR基因多態(tài)與其產(chǎn)羔性狀相關(guān)聯(lián)的研究報(bào)道，今后將圍繞該基因開展進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究，為驗(yàn)證這一假說(shuō)和揭示綿羊產(chǎn)羔性狀機(jī)理提供更多的直接證據(jù)。

4 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)，TSHR基因g.89430525G＞A、g.89363 881T＞C和g.89431097C＞G位點(diǎn)與綿羊季節(jié)性繁殖性狀具有較強(qiáng)的相關(guān)性，且TSHR基因g.89431097C＞G突變中CC型小尾寒羊母羊的產(chǎn)羔數(shù)顯著低于CG和GG型母羊。因此，TSHR基因可能是影響小尾寒羊產(chǎn)羔數(shù)的一個(gè)重要候選基因，對(duì)綿羊繁殖性狀選育具有一定的指導(dǎo)意義。