郭項(xiàng)雨，呂悅廣,2，陳 萌,3，王 春,4，孟憲雙，白 樺，馬 強(qiáng)

（1． 中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，北京 100176；2． 中國(guó)科學(xué)院大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院，北京 101407；3． 北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京 100029；4． 南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 210095）

近年來，隨著生活節(jié)奏的加快和社會(huì)壓力的增加，人們的睡眠質(zhì)量普遍下降[1]，進(jìn)而導(dǎo)致在日常生活及工作中精神不夠飽滿，具有清爽、醒膚功能的化妝品越來越受到消費(fèi)者的關(guān)注及青睞。3-乙基-3-甲基戊二酰亞胺（CAS 64-65-3）又稱貝美格，英文名bemegride，貝美格及其鹽作為一種中樞興奮劑，具有增強(qiáng)呼吸及興奮作用[2]，在醫(yī)學(xué)上具有廣泛的研究及應(yīng)用[3-5]，但貝美格及其鹽具有遲發(fā)毒性，會(huì)引起情緒不安，精神錯(cuò)亂、幻覺幻視等癥狀，添加在化妝品中會(huì)對(duì)人體健康造成潛在危害，我國(guó)《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》（2015版）中明確規(guī)定化妝品中不得添加貝美格及其鹽[6]。

目前針對(duì)化妝品中禁用成分的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法（HPLC）[7-9]、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（HPLCMS）[10-13]、氣相色譜法（GC）[14,15]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS）[16,17]、 超臨界流體色譜法（SFC）[18]及一些新型的快檢方法，如離子遷移譜法（IMS）[19.20]、原位電離質(zhì)譜法（AIMS）[21]等。上述化妝品檢測(cè)方法涉及《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》（2015版）中的禁用防腐劑、塑化劑、防曬劑、芳香劑及糖皮質(zhì)激素等物質(zhì)的測(cè)定，但尚未見化妝品中貝美格及其鹽類的測(cè)定方法報(bào)道。本研究開發(fā)建立了化妝品中貝美格及其鹽類的測(cè)定方法，對(duì)于確?；瘖y品質(zhì)量安全和消費(fèi)者健康安全具有積極意義。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1200型高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司）；ACQUITY超高效液相色譜儀、Xevo TQ MS三重四極桿質(zhì)譜儀、MassLynx數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（美國(guó)Waters公司）；Milli-Q超純水器（美國(guó)Millipore公司）；KQ-600B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；CR 21G型高速冷凍離心機(jī)（日本Hitachi公司）。

貝美格（CAS 64-65-3，純度≥98%），德國(guó)Dr.Ehrenstorfe公司；甲醇和乙腈，色譜純，美國(guó)Fisher公司；其他試劑均為分析純。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取貝美格標(biāo)準(zhǔn)品100 mg，置于100 mL容量瓶中，甲醇溶解并稀釋至刻度，配制成1 000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。根據(jù)需要用甲醇稀釋成適用濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取1 g樣品（水劑類和洗面奶類直接稱取，乳液類樣品需加入2 g氯化鈉）于10 mL具塞離心管中，加入甲醇至刻度，超聲輔助提取20 min，以8 000 r/min離心15 min，上清液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾后供高效液相色譜測(cè)定。

1.4 高效液相色譜條件

色譜柱：Symmetry C18（4.6 mm × 250 mm, 5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-水（50∶50, V∶V），等度洗脫；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm。貝美格及其鹽類標(biāo)準(zhǔn)溶液的高效液相色譜圖見圖1。

圖1 貝美格及其鹽類標(biāo)準(zhǔn)溶液的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of bemegride and its salts

1.5 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜確證條件

色譜條件：XBridge C18（2.1 mm × 150 mm, 3.5 μm）色譜柱；流動(dòng)相：乙腈（A）和0.3%氨水溶液（B），等度洗脫（20∶80, V∶V）；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣量：5 μL；柱溫：30 ℃。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源；負(fù)離子模式；毛細(xì)管電壓：2.5 kV；萃取錐孔電壓：3.0 V；離子源溫度：150 ℃，脫溶劑氣溫度：500 ℃；脫溶劑氣流量：1 000 L/h，錐孔氣流量：50 L/h；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）。質(zhì)譜分析參數(shù)見表1。

表1 貝美格及其鹽類的質(zhì)譜分析參數(shù)Tab.1 Op timized MS/MS parameters for the analysis of bemegride and its salts

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

測(cè)定貝美格及其鹽類的最大紫外吸收波長(zhǎng)，設(shè)定掃描范圍為200 ～ 400 nm。經(jīng)測(cè)定，貝美格在210 nm處有最大吸收，因此設(shè)定它們的最大吸收波長(zhǎng)為210 nm，貝美格標(biāo)準(zhǔn)溶液紫外吸收光譜圖見圖2。

圖2 貝美格標(biāo)準(zhǔn)溶液紫外吸收光譜圖Fig.2 Ultraviolet absorption spectra of bemegride

2.2 色譜柱的優(yōu)化

分 別考察了不同品牌、不同鍵合相的色譜柱對(duì)貝美格及其鹽類保留行為，如Eclipse XDB C18（4.6 mm × 250 mm, 5 μm）、XTerra MS C18（4.6 mm × 250 mm, 5 μm）、Promosil C18（4.6 mm × 250 mm, 5 μm）、Symmetry C18（4.6 mm × 250 mm, 5 μm）和Kromasil C18（4.6 mm × 250 mm, 5 μm）。結(jié)果表明，選擇不同C18色譜柱對(duì)貝美格及其鹽類的色譜行為無(wú)明顯差異，因此選擇通用型C18（4.6 mm ×250 mm，5 μm）高效液相色譜柱均可，本方法選擇Symmetry C18（4.6 mm × 250 mm, 5 μm）進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

2.3 流動(dòng)相的優(yōu)化

分別選擇甲醇-水、乙腈-水作為流動(dòng)相，比較不同流動(dòng)相對(duì)貝美格及其鹽類色譜行為的影響。結(jié)果表明，采用甲醇-水作為流動(dòng)相，貝美格的色譜峰峰型較好。在此基礎(chǔ)上，考察甲醇與水體積比為40∶60、45∶55、50∶50、55∶45、60∶40時(shí)對(duì)貝美格及其鹽類的色譜保留時(shí)間的影響。結(jié)果表明，當(dāng)甲醇比例大于50%時(shí)，貝美格及其鹽類保留時(shí)間較弱，導(dǎo)致在實(shí)際檢測(cè)中發(fā)生嚴(yán)重的基質(zhì)干擾現(xiàn)象。因此流動(dòng)相最終優(yōu)化結(jié)果為V（甲醇）∶V（水）=50∶50。

2.4 柱溫的優(yōu)化

分別選擇柱溫為25 ，30 ，35 ℃，考察色譜柱溫度對(duì)貝美格及其鹽類的影響。結(jié)果表明，在各溫度下貝美格的色譜行為無(wú)明顯差異。根據(jù)不同地區(qū)氣候差異及各實(shí)驗(yàn)室條件的不同，柱溫設(shè)定為30 ℃。

2.5 提取溶劑的選擇

比較甲醇和乙腈對(duì)貝美格及其鹽類提取效果的影響。篩選經(jīng)測(cè)定不含貝美格及其鹽類的水劑類、洗面奶類和乳液類樣品作為空白樣品，向其中加入一定量貝美格標(biāo)準(zhǔn)溶液，充分混勻后進(jìn)行提取。結(jié)果表明，用甲醇或乙腈進(jìn)行提取，平行6次實(shí)驗(yàn)，兩者提取率均可達(dá)到95%，提取效果無(wú)明顯差異?？紤]到乙腈毒性較大，成本較高，選擇甲醇為提取溶劑。

2.6 質(zhì)譜確證

由于化妝品配方中成分較多，基質(zhì)復(fù)雜，而液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法具有更好的特異性和抗干擾能力，因此進(jìn)一步開發(fā)了貝美格及其鹽類的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜確證方法。樣品經(jīng)高效液相色譜法分析后，若疑似陽(yáng)性樣品，采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法加以確證。在1.5確證條件下，經(jīng)提取離子后，若出現(xiàn)154.2＞112.1和154.2＞138.1兩對(duì)離子對(duì)，并且離子對(duì)間相對(duì)豐度允許偏差在20%內(nèi)，可確證樣品中含有貝美格。貝美格及其鹽類的質(zhì)譜圖見圖3。

圖3 貝美格及其鹽類標(biāo)準(zhǔn)溶液的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)質(zhì)譜圖Fig.3 MRM chromatogram of bemegride and its salts

2.7 方法的線性范圍、檢出限和定量限

在本方法實(shí)驗(yàn)條件下，貝美格及其鹽類的測(cè)定結(jié)果均以貝美格測(cè)定值計(jì)算。配制1 000 mg/L 的貝美格標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，甲醇將其稀釋至0.2、0.5、1、2、5、10、20、50 mg/L不同濃度標(biāo)準(zhǔn)工作液；以峰面積為縱坐標(biāo)，相應(yīng)貝美格濃度為橫坐標(biāo)作圖，在以上濃度范圍內(nèi)，貝美格及其鹽類線性方程為y=41.52x + 2.387，相關(guān)系數(shù)r2=0.999，呈良好的線性關(guān)系。以信噪比為3估算方法的檢出限（LOD），以信噪比為10估算方法的定量限（LOQ），貝美格的檢出限為0.2 mg/kg，定量限為0.5 mg/kg。

2.8 方法的回收率與精密度

分別稱取經(jīng)測(cè)定不含貝美格及其鹽類的化妝品作為空白樣品，設(shè)定了0.5 mg/kg、5 mg/kg、50 mg/kg 3個(gè)添加濃度。待測(cè)樣液中貝美格及其鹽類含量應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)曲線之內(nèi)，超出線性范圍則應(yīng)稀釋后再進(jìn)行分析。按本檢驗(yàn)方法所確定的實(shí)驗(yàn)條件，對(duì)每個(gè)添加濃度對(duì)水劑類、膏霜類和乳液類樣品進(jìn)行了6次實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表2。由表2可知，回收率為 85.1% ～107.4%，精密度實(shí)驗(yàn)測(cè)得相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.7% ～ 9.3%?？瞻讟悠诽砑迂惷栏駱?biāo)準(zhǔn)溶液高效液相色譜圖見圖4。由圖4可知，所選空白樣品中的雜質(zhì)不會(huì)對(duì)貝美格分離分析造成干擾。

表2 貝美格及其鹽的平均回收率及精密度結(jié)果（n=6）Tab.2 Results of recovery and precision for bemegride and its salts (n=6)

圖4 空白樣品添加貝美格標(biāo)準(zhǔn)溶液的高效液相色譜圖Fig.4 HPLC chromatogram of blank sample spiked with bemegride

2.9 實(shí)際樣品的測(cè)定

按照本研究建立的方法對(duì)市售、網(wǎng)購(gòu)等多種途徑獲取的26件化妝品樣品進(jìn)行了測(cè)定，其中水劑類樣品8件，洗面奶類樣品10件，乳液類樣品8件。結(jié)果表明，所測(cè)化妝品樣品中均未檢出貝美格及其鹽類。

3 結(jié)論

本研究建立了測(cè)定化妝品中貝美格及其鹽類的高效液相色譜檢測(cè)方法及高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜確證方法。該方法準(zhǔn)確、快速、靈敏度高，適用于化妝品中貝美格及其鹽類的測(cè)定。