於孝牛 高燕

摘要：微生物礦化是基于微生物誘導(dǎo)礦化形成無(wú)機(jī)礦物。微生物礦化形成碳酸鈣可以作為一類新型膠凝材料，并且可以固結(jié)松散的砂土顆粒，在地基加固、揚(yáng)塵治理等領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用前景。本文主要概述了研究生物礦化方法和微生物碳酸水泥潛在應(yīng)用砂土加固、水泥基材料裂縫自修復(fù)等，詳細(xì)討論分析了Bacillus pasteurii中脲酶水解尿素機(jī)理，并指出脲酶水解尿素存在水解和消除競(jìng)爭(zhēng)。當(dāng)今研究微生物水泥也存在各個(gè)步驟的反應(yīng)機(jī)理、產(chǎn)物晶型的影響機(jī)制、復(fù)合微生物對(duì)礦化晶形如何影響等問(wèn)題，通過(guò)研討展望指出進(jìn)一步研究微生物水泥方案。

關(guān)鍵詞：微生物礦化；膠凝材料；砂土顆粒；研討；脲酶水解尿素機(jī)理

中圖分類號(hào)：G642.0 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1674-9324（2019）09-0173-05

一、背景

生物礦化研究最早始于20世紀(jì)二三十年代的歐洲，此后歐美等國(guó)家不斷發(fā)展新的微觀檢測(cè)技術(shù)，為系統(tǒng)深入研究生物礦化提供了可靠的技術(shù)手段。直到20世紀(jì)80年代我國(guó)著名化學(xué)家王夔院士和材料學(xué)家李恒德院士將生物礦化的概念介紹到國(guó)內(nèi)，此后中國(guó)的生物礦化研究開(kāi)始逐漸形成規(guī)模[1-3]。其中很重要的一個(gè)方面就是在學(xué)習(xí)礦化材料合成方法的基礎(chǔ)上，研究并實(shí)施新的材料制備策略，而深入進(jìn)行這些工作的一個(gè)重要前提就是表征天然生物礦物的分級(jí)結(jié)構(gòu)及探索生物礦化的基本機(jī)理[3，4]。

生物界中有各種各樣的生物礦化材料，這些材料由生命系統(tǒng)參與合成的天然的生物無(wú)機(jī)材料和生物高分子復(fù)合材料組成，例如珍珠、貝殼、骨骼和牙齒

等[3]。這些復(fù)合材料相比于普通化學(xué)方法合成的復(fù)合材料有著優(yōu)異的機(jī)械性能。例如鮑魚(yú)殼，它摻有一定比例的有機(jī)成分的碳酸鈣晶體復(fù)合材料，其殼珍珠層的斷裂功高達(dá)1200J/m2，高于普通文石2—3個(gè)數(shù)量

級(jí)[5]，如圖1所示。這種不同尋常的性能來(lái)源于在特定生物條件下，材料的巧妙組裝過(guò)程及其所具有的精細(xì)微觀結(jié)構(gòu)，這便是生物礦化的魅力所在。

生物可以隨心所欲地制造各種微觀和宏觀結(jié)構(gòu)的礦物材料，并且是在完全環(huán)保的條件下（可以稱其為綠色制造），若能完全破譯這種制造方法的原理，人類就可以通過(guò)模仿來(lái)制造所需要的材料，其意義是巨大的。

二、微生物礦化材料的研究現(xiàn)狀

近些年來(lái)，國(guó)內(nèi)外在礦化材料方面的研究如火如荼，尤其是東南大學(xué)的錢春香教授利用微生物礦化在石英砂膠結(jié)、混凝土裂縫自修復(fù)和修復(fù)土壤重金屬方面做了大量研究，而清華大學(xué)的馮慶玲教授等對(duì)仿生物礦化的方面也做了較為深入的研究，此外還有崔福齋、歐陽(yáng)健明、?？?、張?zhí)焖{(lán)和王愛(ài)華等對(duì)仿生物礦化也做了較為深入的研究，他們共同帶動(dòng)了國(guó)內(nèi)對(duì)生物礦化研究的熱潮。

錢春香等[6]研究微生物礦化沉積碳酸鈣的產(chǎn)率，研究結(jié)果表明：底物濃度對(duì)碳酸鈣沉積量和單位體積產(chǎn)率的影響最大，如表1所示。該作者進(jìn)一步研究了自修復(fù)混凝土中微生物礦化方解石的形成機(jī)理，主要從四個(gè)方面（礦化產(chǎn)物、pH值、O2、底物）研究用于混凝土裂縫自修復(fù)的微生物礦化形成方解石機(jī)理[7]。研究結(jié)果顯示，細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中創(chuàng)造堿性環(huán)境，產(chǎn)生CO2，細(xì)菌細(xì)胞表面帶負(fù)電荷，能夠吸附Ca2+并作為成核位點(diǎn)，在堿性環(huán)境下CO2與Ca2+反應(yīng)形成CaCO3晶體。

劉旭杰等[8]研究不同化學(xué)官能團(tuán)具有代表性的化學(xué)官能團(tuán)（羥基、氨基、羧基和甲基等）對(duì)無(wú)機(jī)相碳酸鈣晶體的調(diào)控，模擬碳酸鈣體外礦化實(shí)驗(yàn)，根據(jù)拉曼光譜（Raman）確定了碳酸鈣的晶型，結(jié)果表明，羥基和甲基對(duì)碳酸鈣的晶型選擇無(wú)明顯影響，氨基和羧基能通過(guò)對(duì)碳酸根離子或鈣離子的吸附而誘導(dǎo)球文石結(jié)晶。

成亮等[9]研究碳酸鹽礦化菌修復(fù)土壤重金屬鎘，結(jié)果表明能夠有效修復(fù)土壤重金屬Cd2+的污染，并且礦化形成穩(wěn)定的碳酸鎘化合物，同時(shí)也研究了體系、細(xì)菌體體系、細(xì)菌分泌物液體系對(duì)碳酸鈣結(jié)晶動(dòng)力學(xué)，晶體形貌影響和碳酸鹽礦化菌液中的不同成分對(duì)碳酸鈣晶體形成機(jī)理進(jìn)行了研究，研究發(fā)現(xiàn)生物有機(jī)質(zhì)分子鏈的極性基團(tuán)（COOH等）與Ca2+產(chǎn)生靜電、配位等一系列作用，調(diào)控晶體的生長(zhǎng)[10，11]。

竹文坤等[12]研究利用巴斯德芽孢桿菌繁殖過(guò)程產(chǎn)生的酶化作用，適時(shí)引入Ba2+，形成碳酸鋇沉淀并對(duì)樣品形貌、結(jié)構(gòu)、熱性質(zhì)等進(jìn)行表征。結(jié)果表明，巴斯德芽孢桿菌誘導(dǎo)沉淀的碳酸鋇與純水中的不同，含有少量有機(jī)物質(zhì)，晶形轉(zhuǎn)變溫度降低，主要為花簇狀和放射狀，屬于正交晶系。菌體和代謝物在碳酸鋇晶體成核、生長(zhǎng)及堆積過(guò)程中扮演重要的角色。

Li M等[13]從土壤中分離產(chǎn)脲酶菌株能夠水解尿素，由于此反應(yīng)的發(fā)生導(dǎo)致土壤pH升高和碳酸根生成，這會(huì)導(dǎo)致在可溶性鎳、銅、鉛、鈷、鋅和鎘等重金屬離子溶解在含水土壤中礦化，并且它們最終轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的碳酸鹽。培養(yǎng)48小時(shí)后，選擇菌株表現(xiàn)出較高的重金屬去除率，范圍在88%—99%之間。掃描電子顯微鏡和X-射線衍射分析表明，pH等于8—9時(shí)，生物積累的重金屬離子沉積包裹在細(xì)胞周圍，碳酸鹽礦物為菱形、球形、針狀晶體。通過(guò)這個(gè)研究可以看出，土著微生物能夠生存在有毒的土壤和廢水中，并且封存可溶性重金屬生成生物礦物，在重金屬修復(fù)方面起著重要作用。

在國(guó)外，許多研究者主要研究微生物礦化在混凝土裂縫自修復(fù)、膠結(jié)石英砂子和重金屬處理方面的應(yīng)用，例如Wiktor V等[14]關(guān)于研究關(guān)鍵是裂紋形成后的雙組分組成的細(xì)菌孢子和乳酸鈣的生物化學(xué)劑從顆粒釋放由裂紋進(jìn)入水中。隨后的微生物誘導(dǎo)形成的碳酸鈣將裂縫完全填充，如圖2所示。Wang N J Y等[15]利用硅藻土作為微生物保護(hù)媒介研究混凝土自愈合，研究的主要目標(biāo)是應(yīng)用微生物沉淀CaCO3愈合混凝土中的裂縫，因?yàn)槲⑸锾妓徕}與水泥基材有更好的兼容性和相對(duì)于通常使用聚合物材料更好的環(huán)境。荷蘭代爾伏特理工大學(xué)的Whiffin V S等利用微生物礦化產(chǎn)生碳酸鈣（方解石）膠結(jié)砂柱[16]。Sarda D等[17]利用營(yíng)養(yǎng)肉湯和腦心浸液作媒介研究微生物礦化產(chǎn)生碳酸鈣改善磚塊的吸水性能，由于水的存在，大部分磚結(jié)構(gòu)發(fā)生了嚴(yán)重變化，沉積方解石覆蓋在磚塊表面空隙并大幅降低磚塊的吸水率。通過(guò)減少水的吸收可提高磚塊的耐久性。Stocks-Fischer S等[18]在不同條件下研究微生物誘導(dǎo)碳酸鈣并討論沉淀的因素。

三、脲酶水解尿素的機(jī)理研討

微生物引起礦物沉積是因?yàn)槌睗癍h(huán)境里的新陳代謝生成脲酶（Urease），尿素酶水解尿素生成氨氣和二氧化碳，然后二氧化碳溶于微生物溶液形成碳酸根，再與周圍溶液中的鈣離子反應(yīng)生成具有膠凝性質(zhì)的碳酸鈣沉淀。微生物的作用不僅僅是生成脲酶，而且為碳酸鈣的沉積提供了成核地點(diǎn)。微生物引起了礦物沉積過(guò)程中所發(fā)生的復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)。在此方面Benini S和Ciurli S等[19-22]研究了抑制劑阻止Bacillus pasteurii中脲酶水解尿素，由圖3可知尿素的自然分解大約為3.6年，而在尿素催化下水解大約為1微秒，約是自然分解速率的1014倍[23]。作者通過(guò)分辨率為2.0埃的低溫同步輻射X射線晶體衍射得到了原始脲酶和抑制劑配位的脲酶結(jié)構(gòu)。通過(guò)Bacillus pasteurii脲酶抑制劑的設(shè)計(jì)，需要從分子水平上知道脲酶分解尿素機(jī)理，作者提出了可能發(fā)生的脲酶水解尿素生成氨氣和二氧化碳的機(jī)理，如圖4所示。

Barrios A M等[24]研究通過(guò)溶劑揮發(fā)法和蒸汽擴(kuò)散法模擬合成[Ni2（μ-OH）（μ-H2O）（bdptz）（urea）2]（ClO4）3，[Ni2（μ-OH）（μ-urea）（bdptz）（urea）（CH3CN）]（ClO4）3，[Ni2（μ-OH）（μ-H2O）（bdptz）（μ-OCN）]2（OTs）4）三種不同配位形式的類脲酶催化水解尿素。[Ni2（μ-OH）（μ-H2O）（bdptz）（urea）2]（ClO4）3在兩步反應(yīng)中，加熱影響尿素的水解。在第一步中，消除一分子氨并伴隨產(chǎn)生氰酸，在這一階段乙腈中速率常數(shù)是（7.7±0.5）×10-4h-1，在同樣的條件下，這個(gè)反應(yīng)比自發(fā)分解尿素至少快500倍。當(dāng)含氰酸酯的產(chǎn)物在水中進(jìn)一步加熱，氰酸水解的二階速率速率常數(shù)是（9.5±1）×10-4h-1。[Ni2（μ-OH）（μ-H2O）（bdptz）（urea）2]（ClO4）3在50%乙腈水溶液中反應(yīng)得到氨伴隨著沒(méi)有明顯含氰酸酯產(chǎn)物的積累。一種可能類似含氰酸酯的產(chǎn)物[Ni2（μ-OH）（μ-H2O）（bdptz）（μ-OCN）]2（OTs）4。這些結(jié)果確立優(yōu)先通過(guò)一種氰酸酯中間體水解尿素，作為一種替代脲酶催化水解尿素機(jī)理。

Suárez D等[25]通過(guò)量子化學(xué)計(jì)算研究雙鎳配合物關(guān)于脲酶催化水解尿素的機(jī)理。作者通過(guò)B3LYP密度泛函來(lái)表征平衡幾何、電子、磁性質(zhì)和一系列能量特征，實(shí)現(xiàn)脲酶活性部位的配合物建模，為理論分析結(jié)果提供了新的洞察結(jié)構(gòu)——底物結(jié)合和催化機(jī)理。在水橋聯(lián)兩個(gè)鎳離子之間觀察到在脲酶晶體結(jié)構(gòu)中被分配到羥基橋聯(lián)在與所觀察到的小反鐵磁耦合。在表征單齒和雙齒結(jié)合尿素配合物中，這里的尿素有很好的催化方向。最后，作者開(kāi)始調(diào)查研究單齒和雙齒結(jié)合尿素配合物的各自反應(yīng)機(jī)理。在這兩個(gè)機(jī)理當(dāng)中，橋聯(lián)Ni1—Ni2的羥基和Ni2配位的水分子起著至關(guān)重要的作用，如圖5所示。

Estiu G等[26]進(jìn)一步研究顯示，在脲酶催化尿素分解中可能存在消除和水解途徑競(jìng)爭(zhēng)。他們采用計(jì)算的方法分析了一系列的中間結(jié)構(gòu)和過(guò)渡態(tài)的平衡幾何、電子特性和能量。他們從比較不同的可能反應(yīng)機(jī)理中預(yù)測(cè)到一分子水參與反應(yīng)，先是尿素酰胺氮質(zhì)子化，隨后釋放一分子NH3。這個(gè)水分子類似于一個(gè)在脲酶活性位點(diǎn)上的重要?dú)埩粑铮ɡ鏗is320），并且與尿素氮酰胺形成氫鍵作用。在脲酶和酞嗪體系分子內(nèi)與分子間氫鍵鍵合強(qiáng)度增強(qiáng)，通過(guò)增加酰胺氫原子的酸度，觸發(fā)尿素和帶正電荷的Ni離子配位。尿素配位模式，實(shí)驗(yàn)觀察酞嗪配合物和理論再現(xiàn)顯示氫鍵鏈接酰胺氮和橋聯(lián)OH。分子動(dòng)力學(xué)模擬脲酶—尿素體系和定義第一步催化消除機(jī)理，氰酸水解后產(chǎn)生氨基甲酸，這個(gè)在第一階段形成。根據(jù)分子動(dòng)力學(xué)初步模擬結(jié)果，這兩步機(jī)理可能發(fā)生在酞嗪模型體系中和在脲酶活化位點(diǎn)上。

四、研討微生物礦化存在的問(wèn)題

通過(guò)對(duì)國(guó)內(nèi)外微生物礦化形成碳酸鹽礦物的研究現(xiàn)狀分析，可以看出微生物礦化材料與其他傳統(tǒng)材料相比有著明顯的優(yōu)勢(shì)，如對(duì)環(huán)境污染小、修復(fù)混凝土裂縫和膠結(jié)砂土等前后透水性能變化較大、材料性能得到提高、經(jīng)濟(jì)性強(qiáng)等，但仍存在以下幾方面的問(wèn)題：（1）至今各國(guó)科學(xué)家沒(méi)有完全掌握微生物礦化碳酸鹽礦物各個(gè)步驟的反應(yīng)機(jī)理，尤其是對(duì)Bacillus pasteurii水解尿素機(jī)理方面的研究，由于脲酶催化分解尿素的分解速率是自然分解速率的1014倍且在1μs完成反應(yīng)，現(xiàn)在檢測(cè)技術(shù)很難達(dá)到能夠檢測(cè)任何步驟的反應(yīng)物，所以無(wú)法準(zhǔn)確掌握各步驟的反應(yīng)產(chǎn)物，如反應(yīng)中間體的準(zhǔn)確測(cè)定和表征。（2）微生物分泌物對(duì)礦化產(chǎn)物晶型的影響機(jī)制，與仿生礦化的晶型對(duì)比。什么物質(zhì)主要控制什么樣的晶型。（3）微生物礦化產(chǎn)物的性能與化學(xué)方法或仿生礦化對(duì)比，例如熱穩(wěn)定性和粒徑分布等。（4）微生物礦化材料晶型（方解石和文石等）通常是用XRD和ESEM確定晶型，是否可以用其他表征方法確定，如拉曼方法等。（5）通常研究單一微生物對(duì)礦化晶形和該微生物分泌液和菌體對(duì)晶形的影響，復(fù)合微生物對(duì)礦化晶形如何影響，其他微生物分泌液和菌體對(duì)晶形如何影響，復(fù)合微生物分泌液和菌體對(duì)晶形如何影響，等等。

五、研討展望

1.脲酶催化分解尿素研討展望。研究微生物脲酶催化分解尿素機(jī)理，通過(guò)氧標(biāo)同位素標(biāo)記溶劑來(lái)判斷反應(yīng)中18O在形成碳酸根中脲酶中是否有交換來(lái)大致推導(dǎo)反應(yīng)機(jī)理，對(duì)同位素標(biāo)記化合物需要測(cè)定反應(yīng)前后的豐度比，測(cè)定脲酶反應(yīng)前后的豐度比和尿素、碳酸鋇中16O/18O的豐度比，再通過(guò)脲酶和抑制劑硫脲生長(zhǎng)晶體來(lái)進(jìn)一步推導(dǎo)脲酶催化分解尿素機(jī)理。

2.展望系統(tǒng)研究微生物礦化與在不同條件下礦化形貌和性能對(duì)比。通過(guò)本階段可以進(jìn)一步了解微生物礦化產(chǎn)生不同晶形的原理，在不同礦化環(huán)境下對(duì)晶形的影響可能各不相同。通過(guò)改變碳酸鹽礦物晶體生長(zhǎng)的周邊環(huán)境，即復(fù)合菌體與分泌物和非碳酸鹽礦化菌及其菌體與分泌物在碳酸鹽礦物晶體生長(zhǎng)過(guò)程中不同的作用情況，結(jié)合動(dòng)力學(xué)參數(shù)的改變，通過(guò)熱穩(wěn)定性、納米壓痕技術(shù)研究礦化產(chǎn)物微觀力學(xué)性能、粒徑分布、XRD等測(cè)試手段，觀察結(jié)晶過(guò)程中，晶體與外界環(huán)境的作用情況以及對(duì)最終形態(tài)的影響。以結(jié)晶結(jié)構(gòu)學(xué)為理論基礎(chǔ)，通過(guò)對(duì)晶體晶面生長(zhǎng)的研究，推論出菌體及分泌物對(duì)晶面的作用情況，從而解釋最終形貌的形成原因。

3.展望菌體與分泌物對(duì)碳酸鹽礦化產(chǎn)物晶體生長(zhǎng)的動(dòng)力學(xué)影響。通過(guò)溶液電導(dǎo)率等測(cè)試手段研究碳酸鹽礦化產(chǎn)物的晶體在不同體系環(huán)境中結(jié)晶動(dòng)力學(xué)的過(guò)程，并以此來(lái)研究各體系在碳酸鈣結(jié)晶過(guò)程中所產(chǎn)生的影響。

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