李 強，熊 前，楊前勇，王春亮，余 盼，吳 衍

(公安部南昌警犬基地 江西省警犬良種繁育與行為科學重點實驗室，江西 南昌 330100)

熱應激主要是指動物機體為應對在高溫環(huán)境下熱平衡被破壞，導致散熱受阻所引起的非特異性應答反應[1]，會嚴重影響新陳代謝，持續(xù)的熱應激會對機體造產(chǎn)生嚴重損傷甚至死亡。犬全身幾乎無汗腺，不能通過汗液散熱，在我國南方夏季高溫高濕的環(huán)境極易產(chǎn)生熱應激，從而對生理機能產(chǎn)生非常不利的影響，同時也極大制約了犬在夏季高溫高濕環(huán)境下的使用。為緩解高溫環(huán)境下犬產(chǎn)生的熱應激，常采用通風、補水等物理方法降溫或者服用緩解中暑藥物等[2]。然而，機體體溫調(diào)節(jié)以及維持生理代謝正常都是一個復雜的連續(xù)過程，因此有必要在分子水平來分析高溫環(huán)境對犬機體的作用機制和影響，為進一步應對高溫環(huán)境對犬的影響提供依據(jù)。

1 熱應激對機體的影響

犬在溫度超過25℃的環(huán)境中就會出現(xiàn)熱應激反應，在溫度超過30℃以上的環(huán)境則會產(chǎn)生嚴重的熱應激綜合癥[3]，所以在南方夏季高溫高濕環(huán)境中熱應激是最容易發(fā)生的應激反應。犬發(fā)生熱應激反應后，在熱休克因子(Heat shock factors，HSFs)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控下會合成或增加1類保護機體抵抗熱應激損傷的蛋白——熱應激蛋白(Heat stress proteins，HSPs)。HSPs存在于大部分生物中，在進化上具有高度保守性，并且是一個蛋白質(zhì)家族，根據(jù)分子量大小和功能的不同，可分為許多種蛋白，如 HSP100、HSP90、HSP70、HSP60以及小分子HSP[4]。HSPs具有多種生物學特性和功能，在機體眾多生理反應和信號通路中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，應激狀態(tài)下機體內(nèi)的HSPs則會超表達，有助于機體抵抗熱應激損傷，增強機體對高溫的耐受性并盡快從熱應激損傷中恢復[5]。

1.1 熱應激與活性氧活性氧(Reactive oxygen species，ROS)伴隨著機體的新陳代謝而產(chǎn)生，是機體代謝的產(chǎn)物，ROS包括氧自由基和過氧化氫等，線粒體由于是生化反應發(fā)生的主要場所而成為ROS的主要來源[6]。低劑量的ROS對機體是有益的，參與了細胞增殖分裂、細胞信號傳導、蛋白激酶活化和免疫自噬等眾多生理過程[7]。在機體處于熱應激時則會導致活性氧代謝平衡被打破，機體累積大量活性氧，而高劑量的ROS會引起機體氧化應激，氧化損傷核酸，造成蛋白質(zhì)變性失活以及肽鏈斷裂，干擾氨基酸代謝，毒害細胞；ROS與細胞膜上的成分發(fā)生反應導致細胞膜結構被損傷，通透性增加，細胞內(nèi)的酶大量進入血液中，發(fā)生間質(zhì)水腫，繼而加重氧化損傷，引起細胞受損傷亡，造成器官正常功能損傷甚至衰竭[8]。在熱應激反應發(fā)生后，機體同時迅速合成HSPs互相發(fā)揮協(xié)同作用，HSPs能夠通過調(diào)控氧自由基的代謝來降低機體氧自由基的濃度，幫助機體恢復活性氧的代謝平衡，也可以使得因熱應激而失活的DNA聚合酶β恢復活力，堿基切除修復系統(tǒng)得以正常運轉(zhuǎn)來修復DNA損傷；同時HSPs能抑制凋亡蛋白酶(Caspases)的活性，也可以通過干擾細胞凋亡的信號傳導來保證細胞的存活，使得機體的生命活動得以正常運轉(zhuǎn)[9]。相關研究顯示，HSP27和HSP20在心肌細胞內(nèi)高表達后能夠抑制在影響細胞存活中發(fā)揮重要作用的半胱天冬蛋白酶活性，此外HSP27能夠參與調(diào)節(jié)細胞骨架的穩(wěn)定，從而維持細胞基本形態(tài)，減少細胞的凋亡[10，11]。

1.2 熱應激與mTOR和JNK相關報道顯示，熱應激有可能影響生物機體雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)代謝通路，從而抑制蛋白質(zhì)的折疊修飾以及細胞的生長增殖。mTOR作為雷帕霉素靶分子，對營養(yǎng)分子信號敏感性高，參與調(diào)節(jié)mRNA的翻譯及蛋白質(zhì)的合成代謝，調(diào)控細胞生長增殖[9]。高溫環(huán)境下動物食欲降低，采食量減少，導致機體能量供應不足，激活了腺苷酸活化蛋白激酶(5-AMP activated protein kinase，AMPK)代謝通路，引起mTOR代謝通路發(fā)生一系列變化，進而影響蛋白質(zhì)合成代謝和細胞生長增殖。此外，在機體能量不足時，HSPs能促使ATP分解為機體提供能量，AMPK也會抑制蛋白質(zhì)合成代謝、細胞生長增殖等消耗大量能量的生理代謝[12]。Gaballah M等[13]研究顯示，c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal Kinase，JNK)是一種容易被熱應激激活的應激蛋白激酶，能夠影響多種轉(zhuǎn)錄因子表達，參與調(diào)節(jié)細胞凋亡信號通路，對細胞生命活動具有重大意義。有相關研究表明，熱應激蛋白HSP72作為JNK的抑制劑，可以抑制JNK的磷酸化激活，調(diào)控參與JNK促凋亡的多種蛋白的表達，減少JNK誘導的細胞凋亡[14]。研究發(fā)現(xiàn)，溫和熱處理機體后，機體在短時間內(nèi)會超表達HSP72，HSP72通過作用JNK信號通路來增強細胞對熱應激的耐受性，緩解高溫環(huán)境下產(chǎn)生的熱應激對機體造成的損害[15]。此外，據(jù)相關分子試驗顯示，HSP72在作用細胞凋亡的初期即可抑制JNK的激活[13]。

1.3 熱應激與機體免疫HSPs具有大分子抗原性，可參與機體的免疫反應，同時HSPs也能夠作為抗原分子載體，參與加工、遞呈抗原給細胞，促進免疫因子表達，活化樹突狀細胞，從而引起機體非特異性免疫[16]。相關研究表明，HSP70在外周血中可能參與了機體的免疫活動，抑制TLR-4受體表達，誘導腫瘤壞死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α)濃度上升[17]。朱騫等[18]分析處于中度熱應激狀態(tài)下犬的HSP70在外周單個核細胞(PBMC)和血液中的表達情況，發(fā)現(xiàn)HSP70的表達趨勢為先升高后逐漸降低，說明HSP70在熱應激初期上調(diào)表達有助于組織細胞發(fā)揮功能。此外，HSP70在人類白血病細胞中出現(xiàn)表達異常的情況，并且可能與白血病出現(xiàn)耐藥性有關，推測的原因可能是HSP70影響線粒體代謝調(diào)控細胞凋亡[19]。高表達的HSP70能夠作用在線粒體參與的凋亡途徑中對凋亡體發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的凋亡酶激活因子(Apoptotic protease activating factor-1，Apaf-1)，通過與 Apaf-1結合，阻止 Apaf-1參與凋亡小體的形成，從而促進細胞存活[20]。細胞是機體新陳代謝發(fā)生的主要場所，處于一個不斷生長增殖和更新?lián)Q代的過程中，所處不同的細胞周期階段對熱應激的敏感性也不同。相關研究顯示，細胞在S期或者有絲分裂期時對熱應激敏感性高，而在G1或者G2期時對熱應激敏感性則相對低一些[21]。細胞在熱應激初期時會超表達相關熱應激蛋白來保護自身應對熱應激帶來的損傷，以維持自身正常的新陳代謝，但如果傷害性刺激無法解決，熱應激持續(xù)存在，就會引起蛋白質(zhì)變性降解，導致細胞骨架蛋白被破壞，細胞膜通透性增加，誘導免疫細胞分泌炎性因子，發(fā)生炎癥，甚至發(fā)生自身免疫反應，損害機體組織器官，這一切均會影響機體生命活動的正常運轉(zhuǎn)，導致動物休克甚至死亡。

2 熱應激相關基因

熱應激是影響犬及其他動物最常見的應激因素之一，是一個受到多種基因調(diào)控的復雜生理過程，目前已有多個候選基因被發(fā)現(xiàn)與熱應激相關。羅威等[22]利用轉(zhuǎn)錄組測序技術在比格犬和中華田園犬的腎和垂體2個組織應激前后中發(fā)現(xiàn)了2個共有的差異基因神經(jīng)肽B(Neuropeptide B，NPB)和蛋白脂蛋白1(Proteolipid protein 1，PLP1)，這2個差異基因可能是影響比格犬和中華田園犬應激耐受性的重要候選基因；此外，通過基因本體論(Gene Ontology，GO)富集分析發(fā)現(xiàn)腺苷受體A1(ADORA1)、代謝型谷氨酸受體1(Metabotropic Glutamate Receptor 1，GRM1)以及核受體NR4A1(Nuclear receptor subfamily 4，group A，member 1，NR4A1)等可能是影響犬品種應激耐受性差異的關鍵基因。朱騫等[18]發(fā)現(xiàn)處于熱應激狀態(tài)下犬HSP70在PBMC和血液中差異表達，表明HSP70在犬應對熱應激生理過程中可能發(fā)揮重要作用。在其他動物中也發(fā)現(xiàn)多個可能與熱應激相關的候選基因，可以為尋找犬熱應激候選基因提供參考。曾濤等[23]研究北京鴨和番鴨肝臟熱應激前后基因表達譜也發(fā)現(xiàn)，熱應激組中HSP70表達上調(diào)。宋曉燕等[24]利用全基因組表達譜芯片檢測雞大腦、肝臟和腿肌3個組織中熱應激前后差異表達的基因，發(fā)現(xiàn)HSP25和HSPH1在3個組織中表達上調(diào)，Bcl-2相關抗凋亡基因3(Bcl-2 associated athanogene 3，BAG3)在3個組織中顯著差異表達。姚毅等[25]在雞腦、肝和腿肌3個組織中通過利用蛋白互作網(wǎng)絡發(fā)現(xiàn)了1個熱應激相關基因蛋白互作網(wǎng)絡，即熱應激蛋白HSPH1，蛋白折疊相關基因FK506結合蛋白(FK506-binding proteins 5，F(xiàn)KBP5)和細胞死亡蛋白BAG3。

3 小結與展望

熱應激是犬最常發(fā)生的一種應激反應，會影響犬的生理機能，尤其是對處于南方夏季的工作犬而言，極大地干擾了工作犬的正常使用。在分子水平研究熱應激對犬的影響可以加深對犬熱應激的理解，為采取更有效的應對措施提供理論依據(jù)。目前，國內(nèi)外在熱應激對犬影響的分子機制上的研究還不夠深入，熱應激相關候選基因研究還不足，主要研究集中在犬機體處于熱應激下生理生化的指標變化，熱應激對犬細胞生長增殖和凋亡的影響以及犬機體產(chǎn)生熱應激蛋白來應對熱應激對自身的影響，但對于熱應激如何影響犬的分子機制還有待進一步研究，這將是今后研究犬熱應激的一個重點。此外，犬熱應激候選基因互作以及涉及的信號通路研究也是未來的研究方向。