馮 蕾 孫學華

(上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院肝病科，上海市中醫(yī)臨床重點實驗室，上海市 201203，電子郵箱：fenglei1121@126.com)

【提要】 賴氨酰氧化酶樣蛋白2(LOXL2)是一種新的胺氧化酶，可催化膠原及彈性蛋白交聯(lián)，其過表達將導致腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉移。大量研究表明LOXL2在肝纖維化和肝細胞癌肝臟細胞及組織中高表達，與肝纖維化的共價交聯(lián)及肝癌細胞增殖、侵襲和轉移密切相關，可作為一個良好的診斷指標和治療靶點。本文就LOXL2與肝纖維化、肝癌的關系進行綜述。

賴氨酰氧化酶樣蛋白2(lysyl oxidase-like 2，LOXL2)于1997年因在正常衰老的人成纖維細胞中過度表達而被發(fā)現(xiàn)[1]，其為賴氨酰氧化酶(lysyl oxidase，LOX)家族成員之一。研究表明，抑制LOXL2的表達可以阻斷膠原和彈性蛋白的交聯(lián)，以減少各種細胞外基質的過度沉淀，被認為可以逆轉肝纖維化。LOXL2的過表達還與腫瘤進展、轉移、侵襲和腫瘤微環(huán)境的重構有關[2-3]。LOXL2可能成為未來肝纖維化及肝癌的治療新靶點，本文就LOXL2與肝纖維化、肝癌的關系進行綜述。

1 LOX家族與慢性肝病的關系

LOX家族是一種銅依賴性氨基酸氧化酶，具有保守的C末端結構域，可催化彈力蛋白和膠原纖維蛋白中賴氨酸殘基ε-氨基基團氧化脫氨而產(chǎn)生肽基醛，形成催化膠原蛋白和彈力纖維的分子間共價交聯(lián)，這種交叉連接將膠原蛋白和彈性蛋白的可溶性單體轉變?yōu)榧毎饣|中穩(wěn)定性較強的不溶性纖維，交織成穩(wěn)定的網(wǎng)狀結構，發(fā)揮穩(wěn)定細胞外基質的作用[4-5]。LOX基因家族共有5個成員，包括LOX，LOXL1，LOXL2，LOXL3，LOXL4[6]。Vadasz等[7]采用原位雜交和免疫組化方法將正常肝臟組織、威爾森氏病和原發(fā)性膽汁性肝硬化患者的肝臟組織進行石蠟包埋切片處理，發(fā)現(xiàn)在威爾森氏病和原發(fā)性膽汁性肝硬化病中LOX和LOXL2呈高表達，并與肝細胞內膠原沉積有關。Liu等[8]在四氯化碳誘導的C57BL/6J小鼠肝纖維化模型中使用LOX抑制劑β-氨基丙腈6周后發(fā)現(xiàn)，小鼠表現(xiàn)出肝纖維化加速逆轉，同時LOX蛋白減弱了肝星狀細胞的活化，而β-氨基丙腈是一種不可逆的LOX抑制劑，LOXL2的胺氧化酶活性不受β-氨基丙腈的抑制，這表明LOXL2的結構和親和力與LOX不同。銅是LOX蛋白的輔助因子，它會導致肝臟的損傷和瘢痕。威爾森氏病作為一種銅代謝紊亂性疾病，會使肝細胞內LOX和LOXL2高表達從而導致進行性損傷肝臟[9]。目前研究表明LOX和LOXL2可促進纖維膠原Ⅰ的交聯(lián)，而纖維膠原Ⅰ是纖維細胞間質和纖維化的主要組成部分；同時發(fā)現(xiàn)與LOXL2相比，LOX特異性藥物(M64)對由丙型肝炎或脂肪性肝炎引起的肝纖維化缺乏有效性，使其在肝纖維化治療期間的效果不顯著[10]。

2 LOXL2的結構及功能

LOXL2是一種新的胺氧化酶，能夠催化膠原蛋白和彈性蛋白形成賴氨酸從而衍生為共價交聯(lián)[11]。膠原蛋白的聚合是器官纖維化的前提條件，研究表明，LOXL2被認為是肝纖維化的關鍵蛋白[12]。LOXL2的氨基酸序列由一個n端信號肽相連的774個殘基組成，鄰近n-末端4個清道夫受體富含半胱氨酸(scavenger receptor cysteine-rich，SRCR)結構域，SRCR結構域是具有110個殘基的高度保守結構域，用于細胞信號的傳導和黏附，重復的SRCR結構域通過與細胞外基質中的調節(jié)配體或蛋白質相互作用來調節(jié)LOXL2的胺氧化酶活性[11]。雖然從氨基酸序列中預測的LOXL2基因分子質量大約是84 kDa，但在最近一次研究中已經(jīng)確定了一個較小的細胞外65 kDa形式的分子量[13]，其基因定位于8號染色體p21.2-p21.3，大多數(shù)LOXL2基因外顯子-內含子交界處氨基酸序列為(C/T)AG-外顯子-GT(A/G)，通過DNA序列分析，LOXL2與LOX有45%的同源性，與LOXL1有48%同源性[14]。研究發(fā)現(xiàn)，抑制LOXL1的活化對膠原蛋白影響不大，但可以有效減少彈力蛋白的交聯(lián)，限制肝硬化的進展并抑制肝星狀細胞的活化，在肝纖維化階段LOXL2表達顯著增加，表明LOXL2可能與肝纖維化有關[10，15-16]。Barker等[17]發(fā)現(xiàn)LOXL2誘導了生長在膠原基質上的成纖維細胞α-平滑肌肌動蛋白的表達，提示LOXL2通過參與局部黏著斑激酶/蛋白激酶B信號通路而激活成纖維細胞，激活的成纖維細胞可以表達更多的LOXL2，推動前饋循環(huán)，從而進一步促進癌癥的進展。抑制LOXL2介導的成纖維細胞活化可減少腫瘤細胞的侵襲和轉移，但不能減少原發(fā)性腫瘤細胞的生長。

3 LOXL2與肝病的關系

3.1 LOXL2與肝纖維化 肝纖維化是指慢性肝炎或肝損傷過度激活肝星狀細胞轉化為肌成纖維樣細胞，最終導致細胞外基質的異常沉積是。肝纖維化進展為肝硬化將引起嚴重并發(fā)癥，包括門脈高壓、肝衰竭和肝細胞癌等，并導致較高的肝臟相關死亡率[18]。慢性肝病導致的肝纖維化是肝硬化的早期階段,而且肝纖維化的臨床癥狀常不夠典型。流行病學調查結果顯示，截至2015年，世界范圍內約有2.57億HBV攜帶者，88.7萬人死于HBV導致的肝硬化；HCV攜帶者約7 100萬人，39.9萬人死于HCV導致的肝硬化[19]。肝纖維化主要是由肝臟的慢性炎癥和趨化因子、細胞因子的活性變化而引起的免疫細胞(特別是巨噬細胞)的浸潤和基質表達細胞類型的增加。最近的臨床研究表明長期服用抑制HBV藥物的患者，肝纖維化甚至肝硬化可發(fā)生逆轉[20]。肝臟重塑瘢痕組織并且恢復到正常肝臟的能力遵循特定的機械原理，包括慢性組織損傷的終止、引發(fā)肌成纖維細胞凋亡或衰老、多余的瘢痕組織纖維蛋白溶解[21]。膠原交聯(lián)是纖維化的基本過程，細胞外基質持續(xù)量化積累導致纖維化進一步發(fā)展，同時限制肝纖維化的逆轉。肝纖維化的特點是細胞外基質蛋白沉積增多，造成組織過度瘢痕化，促進慢性肝損傷。而彈性蛋白降解的失敗是肝硬化中細胞外基質積聚的重要因素[22]。肝星狀細胞活化是肝纖維化發(fā)生過程中的關鍵[23]。近年來LOXL2在肝纖維化進程中的作用得到廣泛的關注。Weiskirchen等[21]認為LOXL2抑制劑即單克隆抗體(AB0023)是非常有效的肝纖維化和肺纖維化靶向藥物，LOXL2的表達受缺氧、轉化生長因子-β和microRNA(microRNA-26和microRNA-29)的影響，同時此藥正在進行丙肝、原發(fā)性硬化性膽管炎、非酒精性脂肪性肝炎相關的纖維化、肝硬化的2期臨床試驗。Ikenaga等[24]通過硫代乙酰胺誘導C57B1/6J小鼠肝纖維化模型，并采用特異性LOXL2單克隆抗體(AB0023)和特異性LOX單克隆抗體(M64)藥物分別治療6周，發(fā)現(xiàn)在AB0023治療組中纖維間隔變薄、細纖維增多，而M64治療組和安慰組則沒有變化，但是AB0023治療組早期干預時卻不能有效抑制肝纖維化，而是對于晚期肝纖維化的作用比較突出，且在纖維間隔中體現(xiàn)顯著優(yōu)勢；與安慰組比較，AB0023治療組小鼠的交聯(lián)膠原蛋白不溶解部分減少了45%，整體交聯(lián)膠原蛋白減少20.8%。目前的研究已闡明，抗-LOXL2抗體加速硫代乙酰胺誘導的肝纖維化的逆轉[21]。Dongiovanni等[25]在研究甲硫膽堿缺乏飲食的C57BL/6小鼠肝纖維化的發(fā)病機制時發(fā)現(xiàn)，胰島素受體(InsR+/-)促進肝纖維化，使肝星狀細胞轉化受阻，患有2型糖尿病的非酒精性脂肪肝小鼠肝臟組織中LOXL2水平上調。這些實驗表明，LOXL2在肝纖維化階段呈現(xiàn)出高表達，并且能逆轉肝纖維化。此外Meissner等[26]對18例因HCV、艾滋病毒或同時感染HCV及艾滋病毒的晚期肝纖維化或肝硬化的患者使用持續(xù)22周的LOXL2單克隆抗體(Simtuzumab)藥物治療，結果顯示受試者耐受良好，且發(fā)現(xiàn)LOXL2單克隆抗體同時也會抑制金屬蛋白酶-1和基質金屬蛋白酶-9的活性，而金屬蛋白酶對抗纖維化進程中膠原蛋白和細胞外基質的降解具有重要作用。Rosenbloom等[27]認為LOX和LOXL2為判斷纖維化的發(fā)生和分期潛在的生物學標志物。

3.2 LOXL2與肝癌 據(jù)統(tǒng)計，2012年肝癌全球發(fā)病率為0.1‰,在中國肝癌位居第二大常見癌癥，每年約有383 000人死于肝癌[28-29]。肝癌的發(fā)展是一個復雜的過程，涉及持續(xù)炎癥損傷，包括肝細胞壞死和再生，且與纖維化沉積相關[29]。Wu等[30]通過細胞四唑鹽比色法和5-溴脫氧尿嘧啶核苷細胞染色法對體外細胞培養(yǎng)進行檢測，發(fā)現(xiàn)LOXL2對肝癌細胞株(SMMC-7721細胞和HepG2細胞)的增殖有影響，在HepG2細胞和SMMC-7721細胞中LOXL2 mRNA的表達水平顯著上調，當兩個細胞株感染LOXL2-siRNA時，LOXL2 mRNA的表達水平顯著降低，沉默LOXL2基因將抑制HepG2和SMCC-7721細胞增殖、減少細胞集落形成，導致細胞周期阻滯，加速細胞的凋亡，表明LOXL2促進肝細胞癌的增殖，并且LOXL2在肝細胞癌細胞中高表達。Barry-Hamilton等[10]發(fā)現(xiàn)LOXL2 mRNA在大多數(shù)實體腫瘤中高表達且其水平上調與腫瘤分級的增加有關，并且增加肝癌轉移的風險。Wong等[31]發(fā)現(xiàn)在肝細胞癌中缺氧誘導因子-1/SMAD4的激活使LOXL2水平顯著增高和microRNA-26/29的失活，導致LOXL2的過度表達。LOXL2在腫瘤組織和肝癌患者的血清中均有表達，表明LOXL2可能是肝癌一個良好的診斷標志物。Wang等[32]將能穩(wěn)定表達短發(fā)夾RNA的HepG2細胞和BEL-7402細胞對抗含有低氧模擬劑氯化鈷的缺氧誘導因子-1后發(fā)現(xiàn)，低氯誘導因子-1α誘導LOXL2的上調，LOXL2高表達導致腫瘤進展和轉移，促進腫瘤細胞的侵襲和腫瘤微環(huán)境的重構[33]。相關研究表明，通過抑制LOXL2表達可顯著抑制腫瘤細胞的生長和轉移，因此，LOXL2的高表達可作為肝癌的診斷依據(jù)及預后不良的評價指標，也可能為抗癌藥物提供新的治療靶點[34]。

4 展 望

LOXL2抗體可以抑制膠原蛋白交聯(lián)，顯著減少膠原沉積，而膠原蛋白和彈力蛋白是細胞外基質的主要成分，肝纖維化是細胞外基質的持續(xù)定量沉積的結果。LOXL2通過調節(jié)細胞信號通路參與纖維化及腫瘤的進展，抗肝纖維化及抗肝癌藥物研究的主要目標是開發(fā)新的可靠的非侵入性方法，以取代纖維化或腫瘤評估中的肝臟活檢[35]。然而在臨床上仍存在諸多難題，如LOXL2抑制劑的毒副作用、療效是否確切等。隨著研究的深入，抑制LOXL2的活性可能是一種肝纖維化及肝細胞癌的有效治療方向。