劉晨 張玙 肖良 趙泉來 徐宏光

椎間盤退行性疾病是骨科常見疾病，其發(fā)病率及致殘率均較高，可能嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量[1-2]。目前該類疾病的治療方法主要有保守治療和手術(shù)治療兩大類。椎間融合術(shù)雖被認(rèn)為是首選治療方法，卻無法終止椎間盤退變。此外，由椎間融合術(shù)導(dǎo)致的脊柱穩(wěn)定性改變甚至可能引發(fā)或加重相鄰節(jié)段退變，從而導(dǎo)致更嚴(yán)重的脊柱退行性疾病。近年的研究表明，通過以組織工程方式培育的仿生椎間盤替代病變椎間盤的方法可用于治療椎間盤退行性疾病，其應(yīng)用前景廣闊[3-4]。此外，對(duì)組織工程方法治療髓核退變的研究也取得一定進(jìn)展。許多研究認(rèn)為，如果髓核外纖維環(huán)損傷不能得到有效修復(fù)，椎間盤退變治療終究會(huì)失敗。因此，有關(guān)纖維環(huán)組織工程的研究越來越受關(guān)注。

用組織工程技術(shù)制備的纖維環(huán)由支架材料、種子細(xì)胞和生長(zhǎng)因子3部分構(gòu)成。支架是組織工程化纖維環(huán)的重要組成部分。理想的纖維環(huán)支架應(yīng)具備以下性能：①良好的生物相容性，種子細(xì)胞可以在支架材料上黏附并增殖；②合適的機(jī)械力學(xué)性能；③仿生于天然細(xì)胞外基質(zhì)的纖維組織結(jié)構(gòu)，如合適的孔隙率和相連的孔形態(tài)；④纖維環(huán)組織的降解速率與再生速率相匹配。只有特殊的制備工藝才可以使纖維環(huán)支架達(dá)到上述要求。

靜電紡絲技術(shù)是一種特殊的纖維制造工藝。該工藝通過電場(chǎng)作用將針頭處的聚合物液滴由球形變?yōu)閳A錐形(即“泰勒錐”)，再通過圓錐尖端延展得到纖維細(xì)絲，最終生產(chǎn)出直徑為微米級(jí)及納米級(jí)的聚合物細(xì)絲[5]。靜電紡絲纖維支架的結(jié)構(gòu)類似于天然的細(xì)胞外基質(zhì)，且具有較高的表面積/容積比率，有利于種子細(xì)胞的黏附、增殖和分化[6]，近年來在各類組織工程支架的研究中備受關(guān)注。

1 靜電紡絲支架材料選擇

材料選擇在纖維環(huán)組織工程中至關(guān)重要，目前可用于靜電紡絲技術(shù)制備纖維環(huán)組織工程支架的材料主要分為兩大類，即高分子合成材料和復(fù)合材料。

1.1 高分子合成材料

人工合成材料具有低免疫原性和結(jié)構(gòu)均一性，且原材料來源可靠，近些年來越來越受關(guān)注。目前用于纖維環(huán)組織工程的高分子合成材料主要有聚氨酯(PECUU)、聚羥基乙酸、聚乳酸和聚己內(nèi)酯(PCL)等。Zhu等[7]利用不同彈性模量的PECUU制備靜電紡絲三維支架，以模擬實(shí)際纖維環(huán)徑向力學(xué)梯度差異，并在支架上種植兔纖維環(huán)源干細(xì)胞(AFSC)，發(fā)現(xiàn)AFSC可在不同彈性模量的靜電紡絲上分化成類似纖維環(huán)內(nèi)、中、外區(qū)的細(xì)胞。對(duì)植入小鼠體內(nèi)的不同彈性模量的靜電紡絲支架開展降解實(shí)驗(yàn)，則可發(fā)現(xiàn)PECUU具有較好的降解能力。Nesti等[8]以左旋聚乳酸(PLLA)為支架材料制備纖維環(huán)組織工程支架，并在支架上接種人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)，通過免疫組化和二甲基亞甲基藍(lán)法可以檢測(cè)到膠原及糖胺聚糖的分泌。Nerurkar等[9]將PCL通過靜電紡絲技術(shù)制備成厚度為1 mm、長(zhǎng)寬分別為30 mm和5 mm的矩形定向靜電紡絲纖維支架，并在支架上種植牛間充質(zhì)干細(xì)胞，培養(yǎng)120 d后發(fā)現(xiàn)支架上沉積了豐富的膠原及糖胺聚糖，同時(shí)膠原呈現(xiàn)定向排列，結(jié)果表明靜電紡絲技術(shù)非常適合于制備纖維軟骨支架材料。

1.2 復(fù)合材料

纖維環(huán)組織工程對(duì)支架性能的要求是多方面的，單一基材通常很難滿足實(shí)際需求。眾多學(xué)者嘗試通過靜電紡絲技術(shù)將兩種具有不同優(yōu)勢(shì)的材料制備成復(fù)合靜電紡絲支架，使其既具備與天然材料相近的生物相容性，又具有合成材料的優(yōu)越力學(xué)性能和抗拉強(qiáng)度，從而可以更好地為纖維環(huán)組織工程服務(wù)。Ma等[10]通過共軛紡絲的方式用明膠和聚乳酸制備三維纖維支架，電鏡檢查顯示該支架具有大的孔徑和較高的孔隙率。BMSC在支架上可較好地增殖，其Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)率也較高。

2 靜電紡絲纖維結(jié)構(gòu)及性質(zhì)

纖維環(huán)的組織結(jié)構(gòu)對(duì)功能影響較大，通常較為復(fù)雜，系由15～25層的膠原纖維以斜交層疊方式圍繞在髓核周圍形成，每層膠原纖維均具有高度的取向性[11]。斜交層疊結(jié)構(gòu)對(duì)維持髓核的初始形態(tài)和位置并保持椎間盤內(nèi)生理壓力至關(guān)重要[12]。組織工程化纖維環(huán)支架的制備應(yīng)盡量模擬實(shí)際纖維環(huán)的斜交層疊結(jié)構(gòu)，從而實(shí)現(xiàn)仿生支架的結(jié)構(gòu)及力學(xué)模擬目的。

2.1 靜電紡絲纖維取向性

Lazebnik等[13]通過靜電紡絲法制備定向的PCL納米纖維，以模擬纖維環(huán)的纖維取向特性。Koepsell等[14]為研究不同速度滾軸制備的納米纖維的取向性特點(diǎn)，用PCL構(gòu)建取向性納米纖維支架，發(fā)現(xiàn)接收纖維的滾軸轉(zhuǎn)速越快，其構(gòu)建支架中的納米纖維定向性就越強(qiáng)，平行于納米纖維方向的力學(xué)強(qiáng)度也越高；在定向納米纖維支架上種植的種子細(xì)胞分泌的纖維環(huán)細(xì)胞外基質(zhì)含量明顯高于無規(guī)支架。Koepsell等[15]用PCL制備定向、無規(guī)及兩頭圓鈍的靜電紡絲支架，并分別在支架上種植豬纖維環(huán)細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)兩頭圓鈍的靜電紡絲支架能夠更好地促進(jìn)細(xì)胞黏附，同時(shí)證明定向結(jié)構(gòu)纖維可以促進(jìn)細(xì)胞定向排布。Liu等[16]應(yīng)用靜電紡絲法將PECUU分別制備成定向和無規(guī)靜電紡絲纖維支架，并將兔AFSC種植在支架上，發(fā)現(xiàn)AFSC在定向靜電紡絲纖維上呈定向排布，其分泌的Ⅰ型膠原蛋白亦呈定向排布，且其對(duì)Ⅰ型膠原蛋白和蛋白聚醣基因的表達(dá)更多。

2.2 靜電紡絲纖維斜交層疊結(jié)構(gòu)

研究發(fā)現(xiàn)，模擬斜交層疊結(jié)構(gòu)對(duì)纖維環(huán)組織工程具有重要意義。有學(xué)者為分別模擬纖維環(huán)和髓核，制備了由斜交層疊結(jié)構(gòu)的PCL和瓊脂糖凝膠組成的雙相支架，在施加壓應(yīng)力刺激的同時(shí)分別對(duì)牛纖維環(huán)細(xì)胞進(jìn)行短期培養(yǎng)(1周)和長(zhǎng)期培養(yǎng)(6周)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞在規(guī)則斜交結(jié)構(gòu)支架上分泌的細(xì)胞外基質(zhì)同樣表現(xiàn)出斜交層疊結(jié)構(gòu)[17]。上述研究結(jié)果為構(gòu)建仿生的組織工程化椎間盤提供了新思路。此外，有學(xué)者將混合牛纖維環(huán)細(xì)胞的斜交層疊結(jié)構(gòu)PCL靜電紡絲支架植入大鼠尾椎間盤以構(gòu)建椎間盤置換動(dòng)物模型，發(fā)現(xiàn)該支架可穩(wěn)定地存在于尾椎中，且牛纖維環(huán)細(xì)胞可以遷移至支架[18]。上述研究表明，在支架材料制備過程中精確模擬實(shí)際纖維環(huán)組織微觀結(jié)構(gòu)有助于實(shí)現(xiàn)組織工程化纖維環(huán)的有效構(gòu)建。

3 靜電紡絲復(fù)合細(xì)胞因子

在多數(shù)研究中，組織工程化纖維環(huán)構(gòu)建尚不能令人滿意，主要因?yàn)槟z原和糖胺聚糖在支架中的含量與其在實(shí)際纖維環(huán)基質(zhì)中的含量差距較大。細(xì)胞生長(zhǎng)因子具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化及細(xì)胞外基質(zhì)代謝的作用，胰島素生長(zhǎng)因子(IGF)-1、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β1、成纖維生長(zhǎng)因子(FGF)-2和TGF-β3等可參與纖維環(huán)細(xì)胞生長(zhǎng)代謝，在組織工程化纖維環(huán)構(gòu)建中具有重要作用[19-22]。細(xì)胞因子是纖維環(huán)組織工程的重要組成部分。

靜電紡絲共紡方法即在支架材料中加入生長(zhǎng)因子，不僅可以達(dá)到生長(zhǎng)因子緩釋的目的，而且能夠促進(jìn)纖維環(huán)細(xì)胞外基質(zhì)的分泌。Vadalà等[23]通過將TGF-β1以20 ng：1 g的比例溶于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為13%的PLLA的方式制備TGF-β1功能性PLLA靜電紡絲支架，并以純PLLA靜電紡絲支架作為對(duì)照，結(jié)果證實(shí)實(shí)驗(yàn)組TGF-β1于4 d后開始釋放，并于第7 d達(dá)到緩釋平衡；將牛纖維環(huán)細(xì)胞分別種植于上述兩種支架上，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組緩釋TGF-β1的PLLA靜電紡絲支架上牛纖維環(huán)細(xì)胞可以分泌更多的膠原及糖胺聚糖。Sahoo等[24]通過同軸共紡方式將堿性成纖維生長(zhǎng)因子(bFGF)紡至聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)靜電紡絲纖維支架，證實(shí)bFGF的緩慢釋放有助于提高BMSC的成纖維分化能力，并可促進(jìn)Ⅰ型膠原蛋白和纖維蛋白等合成。上述研究表明，將生長(zhǎng)因子通過共紡方式加入靜電紡絲支架材料中，可通過生長(zhǎng)因子的緩慢釋放促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的分泌，使組織工程化纖維環(huán)更接近于實(shí)際纖維環(huán)的組分。

將生長(zhǎng)因子與高分子聚合物混紡可以改善支架性能，而在靜電紡絲支架表面修飾生長(zhǎng)因子則可以達(dá)到促進(jìn)基質(zhì)分泌的目的。Guo等[25]制備PECUU靜電紡絲支架，并用兔BMSC作為種子細(xì)胞模擬實(shí)際纖維環(huán)細(xì)胞外基質(zhì)的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)向細(xì)胞培養(yǎng)基添加質(zhì)量濃度為10 ng/mL的TGF-β3可使AFSC表達(dá)Ⅰ型膠原蛋白、Ⅱ型膠原蛋白和蛋白聚醣基因的能力與BMSC在支架上的表達(dá)能力接近。Nesti等[8]以PLLA靜電紡絲制備纖維環(huán)支架，以透明質(zhì)酸(HA)作為髓核支架，構(gòu)建成雙相支架來模擬實(shí)際椎間盤結(jié)構(gòu)；將人間充質(zhì)干細(xì)胞種植在該支架上，并在添加10 ng/mL的TGF-β后對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)28 d，免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅸ型膠原蛋白和糖胺聚糖可持續(xù)分泌，所得基質(zhì)接近于實(shí)際椎間盤組織。

無論是通過共紡方式還是支架表面修飾方式，生長(zhǎng)因子均可提高支架與種子細(xì)胞間的相互作用，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)分泌。但是上述生長(zhǎng)因子在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)效果仍需要體內(nèi)實(shí)驗(yàn)予以驗(yàn)證。

4 結(jié)語

用靜電紡絲技術(shù)制備的纖維紡絲支架具有表面積大、孔連通性好、孔隙率高等特點(diǎn)，有利于細(xì)胞黏附及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)滲入[26]。由于靜電紡絲支架可模擬天然的細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)，因此利用該技術(shù)制備的組織工程支架受到越來越多的關(guān)注。雖然靜電紡絲技術(shù)在制備組織工程化纖維環(huán)支架方面已經(jīng)取得一定的進(jìn)展，但隨著組織工程對(duì)支架材料的要求不斷提升，該項(xiàng)技術(shù)仍有待進(jìn)一步完善。目前采用該項(xiàng)技術(shù)制備的纖維環(huán)組織工程支架仍處于實(shí)驗(yàn)室階段，其生產(chǎn)效率較低，且制備過程中影響因素較多，各批次產(chǎn)品難以保證穩(wěn)定，且國(guó)內(nèi)外均尚未有利用靜電紡絲技術(shù)將膠原、藻酸鹽等天然材料制備成纖維環(huán)組織工程支架的文獻(xiàn)報(bào)道。有關(guān)天然生物材料與高分子合成材料混紡的報(bào)道亦少之又少。此外，大多數(shù)研究?jī)H限于體外實(shí)驗(yàn)，有關(guān)纖維環(huán)組織修復(fù)的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究不多。因此，有必要進(jìn)一步開發(fā)更為先進(jìn)的靜電紡絲技術(shù)，制備性質(zhì)更加穩(wěn)定的天然材料紡絲，并構(gòu)建具有可控三維結(jié)構(gòu)的納米纖維支架,從而更好地實(shí)現(xiàn)仿生纖維環(huán)細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能。