李容 顧玉海 多杰

1青海大學(xué)研究生院,西寧810000;2青海省人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科,西寧810000

1 細胞自噬

自噬是細胞內(nèi)的一種內(nèi)穩(wěn)態(tài)過程,通過溶酶體降解去除蛋白聚集體和受損細胞器來維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)過程。這一過程對細胞在應(yīng)激條件下生存是至關(guān)重要的,包括從細胞中消除不必要的或損壞的元素[1]。它也是清除入侵病原體的關(guān)鍵過程,使其成為定向治療的潛在靶點[2-3]。

在細胞應(yīng)激時通過溶酶體降解來降解受損的細胞成分和細胞器,幫助機體渡過難關(guān),同時其也是先天免疫的一部分,參與消滅細胞內(nèi)病原體,此外細胞自噬還可能參與調(diào)節(jié)先天和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)[2]。

2 肺結(jié)核和細胞自噬

結(jié)核分枝桿菌 (mycobacterium tuberculosis,Mtb)是結(jié)核的病原體,是一種非常成功的細胞內(nèi)病原體,可長期存活于巨噬細胞的細胞質(zhì)中并逃避細胞免疫的追殺。肺結(jié)核的感染通常由吸入含有Mtb的氣溶膠液滴進入肺泡后開始。肺結(jié)核是一種嚴重的傳染病,每年奪去無數(shù)人的生命。雖然目前肺結(jié)核可通過一線藥物治療,包括異煙肼、利福平、吡嗪酰胺、乙胺丁醇和鏈霉素,至少6 個月有效治療[4],然而肺結(jié)核的預(yù)后卻不盡如人意。一線治療往往不能治愈結(jié)核病的原因包括：患者不遵守,藥物水平不合適,藥物短缺或其他因素,導(dǎo)致肺結(jié)核治療失敗、結(jié)核播散、耐藥結(jié)核的出現(xiàn)、結(jié)核復(fù)發(fā)等。因此,迫切需要新的治療策略,包括減少機體對結(jié)核桿菌的易感性、增強機體對結(jié)核桿菌的防御力、尋找可提高受感染宿主免疫防御能力的藥物等措施。

在Mtb感染中,存在2種自噬途徑,最終導(dǎo)致自溶酶體的形成。第一個經(jīng)典途徑是噬菌體吞噬,又稱異種吞噬,它是由Mtb感染后早期激活細菌分泌性抗原靶分泌系統(tǒng),導(dǎo)致吞噬體膜的破壞[5]。接下來,干擾素刺激因子(STING)依賴性通路可識別細菌表面的DNA;STING 途徑可直接導(dǎo)致細菌泛素化,parkin連接酶、Smurf1連接酶和TRIM3連接酶均參與了細菌泛素化過程[6];從而觸發(fā)細胞自噬。接下來,lc3 經(jīng)泛素化加工后與泛素化連接酶p62和NPD52共價結(jié)合,導(dǎo)致自噬成分的募集,從而在細菌周圍形成吞噬團[7]。第二種途徑被稱為LC3 相關(guān)吞噬(LAP)途徑,其自噬體為單膜,該途徑開始于Mtb激活Toll樣受體,導(dǎo)致病原體的吞噬;這最終導(dǎo)致與細胞溶酶體融合并破壞病原體[8]。

2.1 細胞自噬與結(jié)核發(fā)生、發(fā)展的相互關(guān)系 Mtb是結(jié)核病的致病菌。吸入含有細菌的氣溶膠滴液后,肺泡巨噬細胞、樹突狀細胞和招募的單核細胞通過各種模式識別受體識別Mtb[9]。這些受體啟動不同的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,包括核轉(zhuǎn)錄因子κB和絲裂原活化蛋白激酶信號通路,誘導(dǎo)細胞因子和趨化因子在宿主細胞內(nèi)產(chǎn)生[10]。這些效應(yīng)分子可調(diào)控細菌生長,促進適應(yīng)性免疫反應(yīng)。Mtb被吞噬后,通過吞噬作用形成含有Mtb抗原的吞噬體,Mtb抗原被加工成對Mtb有特異性的CD4+T 細胞和CD8+T 細胞,產(chǎn)生多種細胞因子激活巨噬細胞和淋巴細胞。

為了成功地消滅病原體,先天免疫反應(yīng)和適應(yīng)性免疫反應(yīng)都集中于自噬。在最初的固有免疫反應(yīng)之后,開始出現(xiàn)適應(yīng)性免疫,以控制細菌的分裂;適應(yīng)免疫應(yīng)答一般出現(xiàn)在Mtb初次暴露后3～8周,宿主對Mtb感染的有效免疫應(yīng)答依賴于適當(dāng)?shù)腡 細胞亞群和受感染的巨噬細胞之間的相互作用。適應(yīng)性免疫受損常導(dǎo)致臨床結(jié)核病。自噬參與適應(yīng)性免疫,促進抗原表達,最終導(dǎo)致肉芽腫的形成。肉芽腫的形成是結(jié)核病的病理學(xué)特征,肉芽腫為T 細胞提供了合適的微環(huán)境,在這里可以激活被Mtb感染的巨噬細胞,抑制細菌生長并為細胞免疫反應(yīng)提供感染部位的具體位置。肉芽腫的形成在很大程度上依賴于T 細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)和巨噬細胞分泌的細胞因子,如干擾素γ和腫瘤壞死因子家族成員。趨化因子的即時性和持續(xù)分泌及單核細胞和淋巴細胞的募集、遷移和聚集等因素對Mtb感染部位的肉芽腫形成至關(guān)重要。肉芽腫由多種免疫細胞組成,包括巨噬細胞、樹突狀細胞、T 細胞、成纖維細胞、上皮樣組織細胞、巨細胞和自然殺傷細胞。肉芽腫提供了一個物理屏障,包裹并阻止細菌傳播。這種局部環(huán)境允許這些免疫細胞相互作用,并有效地殺死Mtb。自噬可通過增強抗原表達,促進了Mtb感染中先天免疫反應(yīng)和適應(yīng)性免疫反應(yīng)之間的相互作用。據(jù)報道[11],自噬包括向MHCⅡ類抗原呈遞分子傳遞外源性和內(nèi)源性抗原,以及通過MHCⅠ類抗原呈遞分子呈遞病毒抗原,此外自噬還可協(xié)助MHCⅡ的分類表達,增加MHCⅡ的轉(zhuǎn)化率,并提高MHCⅡ類細胞對CD4+T 細胞的表達,這些在Mtb防御中尤其重要。除了抗原呈遞,適應(yīng)性免疫系統(tǒng)和自噬還可以通過產(chǎn)生細胞因子在防御Mtb中維持協(xié)同關(guān)系。Th1細胞可產(chǎn)生干擾素γ而誘發(fā)自噬。同時,自噬能增加腫瘤壞死因子α、IL-6、IL-8的產(chǎn)生[11]。特異性T 細胞與Mtb感染的巨噬細胞之間的細胞-細胞接觸也可誘導(dǎo)自噬[12]。然后自噬信號最終通過比傳統(tǒng)吞噬體的抗菌膜更強的溶解性和抗菌性殺死分枝桿菌。此外Mtb感染時,宿主巨噬細胞通過誘導(dǎo)細胞凋亡 (或其他形式的細胞死亡),促進吞噬體-溶酶體融合、產(chǎn)生自由基和活性氮、誘導(dǎo)自噬、分泌干擾素和細胞因子來防御病原體[12]。這些反應(yīng)標(biāo)志著適應(yīng)性免疫反應(yīng)通過啟動特異性抗原T 細胞和隨后產(chǎn)生的記憶性T 細胞對病原體進行清除。

然而,Mtb可以通過逃避宿主免疫和巨噬細胞的攻擊進行反擊。例如,Mtb通過改變噬菌體的運輸途徑,阻止其自身被消滅,Mtb 可利用磷脂酰肌醇甘露糖苷刺激Rab14,促進吞噬體與早期內(nèi)胚體融合,預(yù)防吞噬體成熟和酸化。同時,Mtb可通過成功地操縱宿主膜的轉(zhuǎn)運、重組含分枝桿菌的吞噬溶酶體以及調(diào)節(jié)細胞死亡信號以實現(xiàn)其進一步定植、持續(xù)和復(fù)制的目的[13]。Mtb可以阻止自噬體和溶酶體的融合,從而降低巨噬細胞對感染刺激的敏感性[14],病原體抑制吞噬體-溶酶體融合的能力是感染開始的關(guān)鍵。且Mtb可重新編程宿主脂質(zhì)代謝,這表明Mtb可以在脂質(zhì)豐富的自噬體中生存[15]。且某些分枝桿菌蛋白會干擾吞噬體-溶酶體融合[16],一旦細菌通過抑制吞噬體融合而存活下來,它就會受到宿主防御機制 (包括程序性細胞死亡和其他調(diào)控形式的細胞死亡)的攻擊。據(jù)報道,有幾種Mtb蛋白可通過干擾多種細胞死亡途徑,而抑制細胞死亡信號可以預(yù)防T 淋巴細胞的啟動,從而延緩細胞介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫的關(guān)鍵過程,對Mtb提供保護性作用[17]。同時機體在外界環(huán)境的刺激 (饑餓、缺氧等情況)下,可通過抑制哺乳動物雷帕霉素靶蛋白 (mammalian target of rapamycin,m TOR)的表達從而抑制自噬,Mtb可以增加m TOR 的活性,抑制自噬。研究表示[18]抑制自噬可導(dǎo)致Mtb的持續(xù)性感染。

2.2 細胞自噬與結(jié)核的易感性 自噬通過回收有缺陷或功能失調(diào)的細胞器和蛋白質(zhì),維持細胞內(nèi)平衡,并構(gòu)成一種能量守恒機制。研究表明細胞自噬和Mtb的感染有明顯的關(guān)系。ULK1在細胞自噬的起始及成熟中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用,在分析ULK1基因的多態(tài)性與肺結(jié)核之間的關(guān)系中發(fā)現(xiàn)[19],ULK1的rs7138581C 等位基因,rs7138581GC 基因型和rs9481GC基因型是肺結(jié)核的保護因子,可增加患肺結(jié)核的風(fēng)險,同時rs7138581GC 基因型可間接反映肺結(jié)核患者病情的嚴重性;而rs9481A 等位基因是肺結(jié)核的危險因素,可降低患肺結(jié)核的風(fēng)險;ULK1 的CCGAA 單體基因型可降低感染肺結(jié)核的風(fēng)險,而TGAAA 可增加感染肺結(jié)核的風(fēng)險。表明肺結(jié)核的易感性與ULK1的基因多態(tài)性及單核苷酸的多態(tài)性有關(guān)。Horne 等[20]研究還表明rs12297124基因的G-C的轉(zhuǎn)變可增加潛伏肺結(jié)核的易感性(結(jié)核潛伏感染)。但是目前關(guān)于結(jié)核易感性的調(diào)節(jié)中,ULK1的相關(guān)基因的轉(zhuǎn)化機制尚不明確。

3 新型治療研究

結(jié)核感染是全球公共衛(wèi)生的一大威脅。目前的治療仍然圍繞著抗生素點療法。隨著抗生素耐藥性的增長,其他治療靶點將變得越來越重要。宿主定向治療 (host-directed therapy,HDT)是一種新的治療策略,旨在利用宿主免疫機制來對抗感染。HDT 的目的是通過使用藥理學(xué)增強內(nèi)源性宿主免疫系統(tǒng)來對抗結(jié)核病感染。自噬是HDT 治療結(jié)核病的一個重要目標(biāo)。特異性增強自噬的策略可分為兩類,一類參與抑制m TOR 通路,另一類不參與。Akt/m TOR通路中的幾個位點可能是促進自噬的靶點,如m TOR 自身或AMPK。雷帕霉素及其類似物直接抑制m TOR 復(fù)合物,也稱為 “雷帕霉素靶點”,是一種促進自噬的成熟機制。激活A(yù)MPK 抑制m TOR1 形成從而激活自噬[21](盡管其在Mtb感染治療中的作用需要進一步研究)。抑制ATGs和PIK3C3的藥物也在開發(fā)中;還有一些m TOR 無關(guān)的靶點可以促進自噬。

雷帕霉素類似物抑制m TOR 而促進自噬,增加巨噬細胞對抗Mtb感染的能力。雷帕霉素類似物包括西羅莫司、他克莫司和依維莫司[21]。這些藥物傳統(tǒng)上被用作抗癌治療,因為它們具有抑制生長的作用,然而,由于它們對Akt/m TOR 通路和自噬的影響,它們正在被研究用于治療結(jié)核病。作為一種新型的m TOR 抑制劑,有望作為Mtb感染的治療手段,并已被證明可以降低Mtb 的生長速度[22]。依維莫司是一種口服片劑,其不良反應(yīng)低;此外,依維莫司具有比西羅莫司更大的生物利用度,它比西羅莫司更能減少血管炎癥[22]。在治療Mtb感染時,必須仔細權(quán)衡依維莫司對自噬的有益作用與它對免疫系統(tǒng)的影響。在高劑量時,依維莫司是一種有效的免疫抑制劑,在低劑量時,它具有增強宿主免疫能力的作用[23]。2014年進行的一項研究顯示[23],一組健康老年人在接受完6周一定劑量的依維莫司治療后,再注射流感疫苗,他們對流感疫苗的應(yīng)答反應(yīng)較未行依維莫司治療的老人組提高了20%。研究的受試者接受依維莫司的治療劑量低于移植患者,而移植患者在使用依維莫司時,Mtb感染風(fēng)險相對較高[22]。一種被提議的機制是通過吸入納米顆粒制劑,將依維莫司傳遞到感染Mtb的靶細胞,而不引起系統(tǒng)免疫抑制[24]。吸入性雷帕霉素對細胞內(nèi)分枝桿菌的清除效果優(yōu)于溶液中的雷帕霉素。這些發(fā)現(xiàn)表明,雷帕霉素類似物如依維莫司,作為一種抗結(jié)核病的HDT 可能有很好的前景。

其他相關(guān)藥物包括鈣離子通道阻滯劑,如可樂定和米諾地爾,已被發(fā)現(xiàn)通過增加LC3水平誘導(dǎo)自噬[25]。一些抗精神病藥物,如鋰和丙戊酸,也通過降低三磷酸肌醇的水平來增加自噬,而三磷酸肌醇被認為促進自噬,盡管這一機制還知之甚少。鋰已經(jīng)被證明可以抑制其他分枝桿菌的生長,但是需要進一步的研究來確定其在Mtb發(fā)病機制中的作用[26]。許多其他藥物也提出了自噬誘導(dǎo)機制,如白藜蘆醇、精胺、EGFR 拮抗劑、維生素D 和影響B(tài)eclin1或一氧化二氮的藥物[27],盡管還需要對它們的治療效果進行更多的研究。

除HDT 治療藥物的研究外,對于細胞免疫功能受損的個體,如人類免疫缺陷病毒陽性患者和糖尿病患者,由于機體無法產(chǎn)生足夠的Th1細胞介導(dǎo)的細胞免疫,巨噬細胞無法獲得殺菌功能;故宿主對Mtb高度敏感。而免疫功能降低是由于谷胱甘肽水平的降低,這已經(jīng)在人類免疫缺陷病毒感染和2型糖尿病患者中被證明[28]。補充谷胱甘肽可以幫助恢復(fù)細胞因子平衡和增強肉芽腫反應(yīng)[28]。谷胱甘肽是細胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的重要組成部分,具有保護細胞免受氧化應(yīng)激和維持氧化還原平衡的作用。谷胱甘肽可能是抗生素和新的宿主定向療法的潛在輔助療法,有助于減輕細胞的氧化應(yīng)激。

綜上,目前研究表明細胞自噬是針對肺結(jié)核的一個極優(yōu)突破點,研究自噬相關(guān)基因的關(guān)鍵靶點及其作用機制,對降低機體對肺結(jié)核的易感性、增加機體對肺結(jié)核的抵御能力的進一步研究指明方向,而研究自噬相關(guān)基因與感染機體的靶向關(guān)系、機體中誘導(dǎo)及抑制自噬的干擾因素,可為結(jié)核藥物的進一步提升提供理論依據(jù)。在接下來的進程中我們應(yīng)該通過細胞自噬的多面角色在肺結(jié)核的發(fā)生、發(fā)展中起到不同的作用,讓肺結(jié)核的發(fā)病率降低、治愈率提高、病殘率降低、患者的生活質(zhì)量提高。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突