陳道南 田銳

上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院急診危重病科201620

肺纖維化是一種慢性、持續(xù)性的肺疾病,其中特發(fā)性肺纖維化 (idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)是最常見(jiàn)的一個(gè)類(lèi)型,臨床表現(xiàn)主要為進(jìn)行性加重的咳嗽和呼吸困難,疾病后期可嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量,診斷之后的中位生存期僅為2～4年[1]。IPF主要特點(diǎn)是成纖維細(xì)胞的過(guò)度增殖以及大量細(xì)胞外基質(zhì)的沉積,最終導(dǎo)致正常肺的結(jié)構(gòu)和功能受到破壞,在病理上主要表現(xiàn)為蜂窩狀改變、支氣管擴(kuò)張以及外周肺泡間隔的增厚。據(jù)估計(jì),全世界大約300萬(wàn)患者受到該病的困擾,并且其發(fā)病率隨著年齡的增長(zhǎng)而急劇增加,＞65歲的人群發(fā)病率可高達(dá)400/10萬(wàn)[2]。對(duì)于疾病發(fā)生發(fā)展病理生理過(guò)程的研究是目前IPF研究的熱點(diǎn)及重點(diǎn),闡明IPF的發(fā)生發(fā)展過(guò)程可以為后續(xù)預(yù)防和治療研究提供幫助。IPF 發(fā)生發(fā)展的具體機(jī)制仍未明了,目前認(rèn)為和上皮細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用有關(guān)。既往認(rèn)為IPF的發(fā)生是一個(gè)慢性炎癥反應(yīng)過(guò)程,但最近的研究表明其主要是肺泡上皮細(xì)胞不正常的激活所致[2-4]。

氧化應(yīng)激反應(yīng)是細(xì)胞內(nèi)的一個(gè)基本生理反應(yīng),正常生理情況下對(duì)于機(jī)體是無(wú)害的,但是近年來(lái)越來(lái)越多的證據(jù)表明異常的氧化應(yīng)激反應(yīng)和許多疾病發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系,其中包括肺部疾病。氧化應(yīng)激也是許多呼吸系統(tǒng)疾病以及組織纖維化的一個(gè)重要的分子機(jī)制,氧化應(yīng)激的發(fā)生主要是氧化和抗氧化作用失衡導(dǎo)致過(guò)量自由基產(chǎn)生,其中包括活性氧 (reactive oxygen species,ROS)和活性氮。過(guò)量的氧化應(yīng)激可以導(dǎo)致DNA 的損傷、蛋白質(zhì)羰基化以及脂質(zhì)過(guò)氧化,但是關(guān)于氧化應(yīng)激導(dǎo)致肺纖維化的具體機(jī)制還不明確[5-6]。氧化因素主要和過(guò)多ROS和活性氮的形成有關(guān),而抗氧化因素主要是抗氧化劑的缺乏。因此,本文就近年來(lái)氧化應(yīng)激中的氧化和抗氧化因素在肺纖維化中的作用及其具體機(jī)制的研究進(jìn)展作一綜述。

1 ROS與肺纖維化

ROS的組成中包括1個(gè)或多個(gè)未成對(duì)的電子,正是這種狀態(tài)賦予ROS很高的活性以及不穩(wěn)定性,其中最為重要的ROS包括超氧陰離子、過(guò)氧化氫和羥基。ROS 的形成過(guò)程中,外部因素例如煙草、石棉、博來(lái)霉素、大氣污染物、電離輻射等以及內(nèi)部因素包括巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和上皮細(xì)胞等炎癥細(xì)胞的激活和 NADPH 氧化酶(nicotinamide adenine dinucleotide oxidase,NOX)等胞內(nèi)氧化酶的激活都在其中發(fā)揮了重要作用[5]。正常生理情況下產(chǎn)生的ROS不會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生太大傷害,并且其氧化能力還可以幫助機(jī)體抵御外來(lái)病原體的感染。但是過(guò)量的ROS可以導(dǎo)致包括DNA、蛋白質(zhì)、細(xì)胞膜和線粒體在內(nèi)的多種分子和結(jié)構(gòu)的損傷[6-7]。研究發(fā)現(xiàn),多個(gè)ROS相關(guān)的途徑和肺纖維化有著密切聯(lián)系[6,8],ROS導(dǎo)致肺纖維化的具體機(jī)制尚不明確,下面就此來(lái)探討其可能的作用機(jī)制。

1.1 NOX NOX 是肺內(nèi)ROS 產(chǎn)生的關(guān)鍵因子,它可以催化細(xì)胞質(zhì)內(nèi)NADPH 的電子向氧分子轉(zhuǎn)移。人類(lèi)NOX蛋白家族包括5 個(gè)成員 (NOX1-NOX5)以及2 個(gè)相關(guān)的雙氧化酶 (DUOX1 和DUOX2)[9]。其中肺泡上皮細(xì)胞表達(dá) 的 NOX 有4 種 亞 型：NOX1、NOX2、NOX4 和NOX5[10],其中NOX1 可能和放射線誘導(dǎo)的肺纖維化有關(guān)。在放射線誘導(dǎo)的肺纖維化動(dòng)物模型中,使用NOX 抑制劑VAS2870可以抑制肺動(dòng)脈上皮細(xì)胞ROS的產(chǎn)生以及其纖維化的改變,進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)使用NOX1短發(fā)夾RNA也可以抑制上述纖維化改變,而使用NOX2或NOX4短發(fā)夾RNA 效果不佳。并且使用NOX1抑制劑也可以抑制內(nèi)皮細(xì)胞的膠原沉積及纖維化[11]。提示放射線可能通過(guò)抑制NOX1來(lái)抑制放射線誘導(dǎo)肺纖維化的發(fā)展。

NOX4是NOX 中與肺纖維化關(guān)系最為密切的一個(gè),無(wú)論在IPF患者、博來(lái)霉素誘導(dǎo)的嚙齒類(lèi)動(dòng)物肺纖維化模型中,還是血管重塑模型中,都能發(fā)現(xiàn)NOX4表達(dá)水平升高。而運(yùn)用NOX4抑制劑可以減輕纖維化反應(yīng),抑制細(xì)胞外基質(zhì)成分相關(guān)基因轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)、纖溶酶原激活物抑制物1、缺氧誘導(dǎo)因子1α和NOX4的表達(dá)[12]。可見(jiàn)NOX4在肺纖維化過(guò)程中起到了重要的作用。目前研究認(rèn)為NOX4主要是由TGF-β誘導(dǎo)產(chǎn)生[6]。Jain等[13]研究發(fā)現(xiàn)TGF-β可以通過(guò)電子傳遞鏈復(fù)合體Ⅲ誘導(dǎo)生成線粒體ROS,而TGF-β目標(biāo)基因的表達(dá)需要線粒體ROS的協(xié)助,其中包括NOX4。而使用作用于線粒體的抗氧化劑可以抑制TGF-β目標(biāo)基因的表達(dá)和線粒體ROS的生成,提示線粒體ROS可能也參與NOX4的生成之中。研究還表明,TGF-β激活后可以在TGF-β和線粒體ROS之間形成一個(gè)前饋環(huán)路來(lái)促進(jìn)ROS的生成和TGF-β相關(guān)基因的表達(dá),但此環(huán)路和肺纖維化的持續(xù)發(fā)展是否有關(guān)尚不明確,有待進(jìn)一步的研究。關(guān)于TGF-β誘導(dǎo)NOX4生成的途徑,Hecker等[14]認(rèn)為T(mén)GF-β1可以通過(guò)活化素受體樣激酶5和Smad3來(lái)誘導(dǎo)NOX4的產(chǎn)生和活化,通過(guò)抑制活化素受體樣激酶5或Smad3都能起到抑制間質(zhì)細(xì)胞中過(guò)氧化氫產(chǎn)生的作用。而Ghatak等[15]研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1可能還可以通過(guò)透明質(zhì)酸受體CD44V6來(lái)調(diào)節(jié)NOX4。CD44V6 可以誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變,而TGF-β1可以誘導(dǎo)NOX4和CD44V6的生成。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)CD44V6 可以通過(guò)TGF-β1/p-Smad3/TGF-βRⅠ促進(jìn)NOX4 的產(chǎn)生,并且CD44V6 還可以參與TGF-β1/TGF-βRⅠ信號(hào)通路的正反饋循環(huán),進(jìn)一步促進(jìn)NOX4/ROS的產(chǎn)生。抑制CD44V6也可以減輕小鼠肺纖維化的程度[9]。關(guān)于NOX4基因的表達(dá),Bai等[16]的研究表明位于NOX4啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游3.97～4.76 kb的激活蛋白1/Smad盒在TGF-β1誘導(dǎo)的NOX4基因轉(zhuǎn)錄中起到了重要的作用。還有許多轉(zhuǎn)錄因子可能和NOX4的基因表達(dá)有關(guān),包括Nrf2、Nrf3、Sp1/3、核轉(zhuǎn)錄因子κB、缺氧誘導(dǎo)因子1α、STAT1/3和E2F1[16],但是它們的具體作用還有待進(jìn)一步探究。

NOX4導(dǎo)致肺纖維化的機(jī)制還不十分明了。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為NOX4誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生,通過(guò)誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化,促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白合成,促進(jìn)上皮細(xì)胞凋亡,以及涉及TGF-β介導(dǎo)的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化 (epithelialmesenchymal transition,EMT)來(lái)影響肺纖維化的過(guò)程[17]。Ras同源基因家族成員A (Ras homolog gene family member A,Rho A)是一種屬于Rho亞族的小GTP酶,其參與細(xì)胞的黏附和細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)過(guò)程。Rho相關(guān)卷曲螺旋形成蛋白激酶 (Rho-associated coiled-coil containing protein kinase,Rock)是Rho的靶點(diǎn),包括2個(gè)亞型：Rock-1 和Rock-2?；罨腞ock可以使肌球蛋白磷酸酶的肌球蛋白結(jié)合亞基磷酸化,導(dǎo)致肌球蛋白磷酸酶活性受到抑制。既往研究顯示Rho A/Rock 通路和肺纖維化有著密切的關(guān)系,Kondrikov等[18]發(fā)現(xiàn)ROS可以激活Rock,而抑制Rock可以使得肺成纖維細(xì)胞膠原產(chǎn)生減少。Shimizu等[19]也發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激可能通過(guò)激活Rock促進(jìn)IPF發(fā)展。Meng等[20]研究發(fā)現(xiàn)NOX4來(lái)源的ROS和血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)誘導(dǎo)的肺成纖維細(xì)胞遷移有關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)AngⅡ可通過(guò)Rho A/Rock通路促進(jìn)肺成纖維細(xì)胞的遷移,并且運(yùn)用NOX4 siRNA 和N-乙酰半胱氨酸抑制NOX4 可以抑制AngⅡ誘導(dǎo)的Rho A 的激活,提示NOX4 來(lái)源的ROS可能通過(guò)Rho A/Rock通路來(lái)調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞的遷移,進(jìn)而影響肺纖維化的過(guò)程。

目前還發(fā)現(xiàn)NOX4可以通過(guò)其他途徑來(lái)促進(jìn)肺纖維化的發(fā)展。Guo 等[21]研究發(fā)現(xiàn)組蛋白酶去乙?；?(histone deacetylase 4,HDAC4)的激活是TGF-β1誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵步驟,運(yùn)用NOX4抑制劑可以抑制HDAC4由細(xì)胞核向胞漿的轉(zhuǎn)運(yùn)、肌成纖維細(xì)胞的標(biāo)志物α 平滑肌肌動(dòng)蛋白 (alpha-smooth muscle actin,α-SMA)的表達(dá)以及α-SMA 纖維的形成。而用萊普霉素B抑制HDAC4由細(xì)胞核向胞漿的轉(zhuǎn)運(yùn)雖然對(duì)α-SMA的表達(dá)無(wú)影響但可以阻斷α-SMA 纖維的形成。提示NOX4可能通過(guò)影響HDAC4的轉(zhuǎn)運(yùn)和肌成纖維細(xì)胞分化來(lái)促進(jìn)肺纖維化的發(fā)展。除此之外,NOX4 還可以通過(guò)上述的TGF-β和ROS之間的前饋環(huán)路來(lái)影響TGF-β誘導(dǎo)的Smad2/3的激活,進(jìn)而影響肺纖維化[17]。筆者之前的研究發(fā)現(xiàn)NOD 樣受體家族3 (NOD-like receptor 3,NLRP3)炎癥小體參與肺纖維化中EMT 的調(diào)節(jié)[22]。Moon等[23]研究發(fā)現(xiàn)NOX4的缺乏可以導(dǎo)致肉毒堿棕櫚酰基轉(zhuǎn)移酶1A的表達(dá)下降,而肉毒堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶1A 是脂肪酸氧化(fatty acid oxidation,FAO)通路中一個(gè)關(guān)鍵的線粒體酶,FAO 的減少會(huì)導(dǎo)致巨噬細(xì)胞內(nèi)NLRP3炎癥小體活性降低。他們通過(guò)乙莫克舍抑制FAO 也會(huì)達(dá)到同樣的效果。NOX4缺乏的小鼠體內(nèi)caspase-1的激活以及IL-1β和IL-18的產(chǎn)生都會(huì)大幅減少,而這三者都和NLRP3有關(guān)?？梢?jiàn)NOX4可通過(guò)FAO 來(lái)影響NLRP3炎癥小體的激活。但是NOX4是否可以通過(guò)FAO 和NLRP3來(lái)影響EMT 在肺纖維化中的過(guò)程尚不明確,有待進(jìn)一步研究。

除了上述的研究外,最近越來(lái)越多的研究表明某些藥物或藥物成分通過(guò)抑制NOX4的產(chǎn)生可以抑制肺纖維化的發(fā)展過(guò)程。有回顧性研究顯示大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物例如阿奇霉素可以延緩肺纖維化的發(fā)展[24-25]。Tsubouchi等[26]研究發(fā)現(xiàn)阿奇霉素可以通過(guò)促進(jìn)蛋白酶體的降解來(lái)抑制NOX4的產(chǎn)生,進(jìn)而抑制TGF-β誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞分化和肺纖維化的發(fā)展。近年來(lái)也發(fā)現(xiàn)二甲雙胍可以抑制肺纖維化的發(fā)展[27]。Sato等[28]發(fā)現(xiàn)二甲雙胍可以通過(guò)激活腺苷酸活化蛋白激酶來(lái)抑制TGF-β誘導(dǎo)的NOX4表達(dá),進(jìn)而抑制肺纖維化。并且運(yùn)用NOX1/NOX4抑制劑GKT137831也可以抑制TGF-β誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞分化和線粒體氧化應(yīng)激的發(fā)生[29]。丹酚酸B為丹參的有效水溶性成分,Liu等[30]研究發(fā)現(xiàn)其可通過(guò)抑制NOX4的表達(dá)來(lái)產(chǎn)生抑制肺纖維化的作用,可見(jiàn)通過(guò)調(diào)節(jié)NOX4的產(chǎn)生可以調(diào)節(jié)纖維化的進(jìn)展。不僅如此,對(duì)NOX4的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)也可影響肺纖維化的過(guò)程。過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的克隆-5 (hydrogen peroxide-inducible clone 5,Hic-5)是一個(gè)黏著斑銜接蛋白,由TGF-β1誘導(dǎo)產(chǎn)生。Desai等[31]發(fā)現(xiàn)沉默Hic-5 可以提高TGF-β1誘導(dǎo)NOX4表達(dá)的能力。Hic-5和泛素連接酶Cbl-c和泛素結(jié)合蛋白熱休克蛋白27有關(guān),而這些蛋白的相互作用和NOX4的泛素化有關(guān)。上述研究提示Hic-5 可以通過(guò)調(diào)節(jié)NOX4的降解來(lái)影響纖維化的過(guò)程。

1.2 AngⅡ AngⅡ是腎素血管緊張素系統(tǒng)中的關(guān)鍵分子,通過(guò)和血管緊張素受體 (AT 受體)結(jié)合發(fā)揮作用。人和小鼠的肺成纖維細(xì)胞中都表達(dá)AT1受體亞型,被激活后能促進(jìn)肺成纖維細(xì)胞增殖、TGF-β1的分泌和膠原形成[32]。Wang等[33]證明腎素-AngⅡ-AT1受體通路可以誘導(dǎo)肺纖維化發(fā)生并且阻斷RAS,減輕肺纖維化。臨床研究也發(fā)現(xiàn)血清AngⅡ的濃度和肺纖維化的發(fā)展有關(guān),并且可以用來(lái)預(yù)測(cè)患者的預(yù)后[34-35]。以上研究提示AngⅡ和肺纖維化密切相關(guān),但AngⅡ影響肺纖維化的具體機(jī)制尚未闡明。

研究發(fā)現(xiàn),AngⅡ可以誘導(dǎo)線粒體ROS的產(chǎn)生[36],可見(jiàn)AngⅡ可能通過(guò)ROS相關(guān)通路來(lái)調(diào)節(jié)纖維化的發(fā)生發(fā)展。p22phox為NOX 的亞基,Wang等[37]發(fā)現(xiàn)在低氧誘導(dǎo)產(chǎn)生的肺纖維化中,AngⅡ、AT1 受體、p22phox 表達(dá)均增加,并且ROS的表達(dá)水平和以上三者都呈正相關(guān)。而糜蛋白酶抑制劑NK3201可以抑制上述物質(zhì)的增加,并且降低ROS的水平,提示AngⅡ-p22phox-ROS信號(hào)通路可能和低氧誘導(dǎo)的肺纖維化有關(guān)。除此之外,降低AngⅡ水平也可起到抑制肺纖維化發(fā)展的作用。Ang-(1-7)是AngⅡ的內(nèi)源性拮抗劑,通過(guò)抵消AngⅡ的作用達(dá)到抑制肺纖維化發(fā)展的效果[38-39]。血管緊張素轉(zhuǎn)換酶 (angiotensin converting enzyme,ACE)也是RAS 系統(tǒng)中重要的一員,最近研究發(fā)現(xiàn)ACE2可能可以通過(guò)拮抗ACE/AngⅡ/AT1受體軸來(lái)發(fā)揮抑制RAS系統(tǒng)的作用[38]。例如通過(guò)ACE2/Ang-(1-7)/Mas軸可以抑制MAPK/核轉(zhuǎn)錄因子κB通路和NOX4起源的ROS介導(dǎo)的Rho A/Rock通路來(lái)抑制纖維化的發(fā)生[20]。并且過(guò)量的ACE2可以通過(guò)增強(qiáng)細(xì)胞自噬作用來(lái)抑制小鼠肺內(nèi)膠原的表達(dá)[40]。除此之外,Pan等[41]發(fā)現(xiàn)AngⅡ還可以通過(guò)活化Yes相關(guān)蛋白1促進(jìn)膠原的合成和原代肺成纖維細(xì)胞的增殖,誘導(dǎo)大鼠肺纖維化的發(fā)生。Pan等[42]發(fā)現(xiàn)Ang-(1-7)可通過(guò)減少ROS導(dǎo)致的細(xì)胞自噬損傷來(lái)減輕肺纖維化,而細(xì)胞自噬則可通過(guò)調(diào)節(jié)AngⅡ誘導(dǎo)產(chǎn)生的ROS介導(dǎo)的NLRP3炎癥小體活化減輕肺纖維化[43]。另外,Zhang等[44]發(fā)現(xiàn)Ang-(1-7)可以通過(guò)抑制NLRP3炎癥小體/IL-1β/Smad通路來(lái)抑制AngⅡ誘導(dǎo)的肝細(xì)胞EMT,但是否也可通過(guò)這條通路抑制肺纖維化中的EMT,目前尚無(wú)確切結(jié)論。

1.3 線粒體與ROS 細(xì)胞內(nèi)和ROS產(chǎn)生相關(guān)的細(xì)胞器包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、過(guò)氧化物酶體和線粒體。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可導(dǎo)致未折疊以及錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)集聚并可促進(jìn)ROS的生成,過(guò)氧化物酶體中的ROS主要作為其代謝長(zhǎng)鏈脂肪酸的副產(chǎn)物而產(chǎn)生,而線粒體內(nèi)的ROS主要和電子傳遞鏈上漏出的質(zhì)子和電子有關(guān)[45]。線粒體產(chǎn)生的ROS在肺纖維化中也起到了重要的作用[6],例如肺泡巨噬細(xì)胞可以通過(guò)啟動(dòng)免疫應(yīng)答和線粒體產(chǎn)生ROS,來(lái)影響肺纖維化的發(fā)展過(guò)程[46]。除了TGF-β 和線粒體ROS 產(chǎn)生有關(guān)之外,有研究發(fā)現(xiàn)Rac1也和線粒體ROS的生成有著密切的關(guān)系。Rac1是一種小GTP結(jié)合蛋白,Rac1的激活會(huì)導(dǎo)致線粒體產(chǎn)生過(guò)氧化氫,而抑制Rac1的激活也會(huì)抑制線粒體過(guò)氧化氫產(chǎn)生和抑制肺纖維化發(fā)展[3]。關(guān)于線粒體ROS對(duì)肺纖維化發(fā)展的作用機(jī)制,多數(shù)研究認(rèn)為和TGF-β1通路有關(guān)。在IPF 患者體內(nèi)線粒體ROS水平增高,而抑制了線粒體ROS可以抑制TGF-β1的作用,從而抑制肺纖維化?？梢?jiàn)線粒體的ROS可以通過(guò)TGF-β1來(lái)促進(jìn)肺纖維化的發(fā)展[13,47]。并且越來(lái)越多的研究注意到線粒體和NOX 的關(guān)系在肺纖維化中的作用[48],例如線粒體ROS的產(chǎn)生可以減少NOX4的表達(dá)[13]。除了作用于TGF-β1通路之外,Kim 等[49]發(fā)現(xiàn)線粒體內(nèi)過(guò)氧化氫產(chǎn)生過(guò)多還會(huì)導(dǎo)致線粒體DNA 的損害和細(xì)胞凋亡,加重肺纖維化的程度。而降低線粒體內(nèi)過(guò)氧化氫的含量可以減少線粒體DNA 的損傷和細(xì)胞凋亡的數(shù)量,減輕肺纖維化水平,可見(jiàn)線粒體ROS導(dǎo)致線粒體DNA 的損害和細(xì)胞凋亡也和肺纖維化有著一定的聯(lián)系。

除此之外,線粒體的自噬作用也和ROS有關(guān),線粒體自噬作用對(duì)于維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)起著重要的作用[46,50]。蛋白激酶B,又稱Akt1,可以介導(dǎo)過(guò)氧化氫的產(chǎn)生,而敲除Akt可以抑制小鼠肺纖維化的發(fā)展[51]。Larson-Casey等[46]發(fā)現(xiàn)Akt1可以增加TGF-β1的表達(dá),而線粒體的自噬作用在Akt1過(guò)表達(dá)的小鼠中可以降低TGF-β1的表達(dá)以及抑制成纖維細(xì)胞的分化。并且敲除Akt1的小鼠表現(xiàn)出更多的巨噬細(xì)胞凋亡,從而抑制肺纖維化的發(fā)展,而IPF 患者巨噬細(xì)胞線粒體的自噬作用增強(qiáng),并且表現(xiàn)為巨噬細(xì)胞凋亡減少。PTEN 誘導(dǎo)假定激酶1 (PTEN-induced putative kinase 1,PINK1)是線粒體損傷和線粒體自噬的標(biāo)志物,PINK1聚集于線粒體外膜,是觸發(fā)線粒體自噬的關(guān)鍵信號(hào)。而敲除PINK1的小鼠則更容易發(fā)生肺纖維化[47]?？梢?jiàn)Akt1介導(dǎo)的ROS可以增加TGF-β1的表達(dá),而線粒體自噬作用可以通過(guò)影響這個(gè)過(guò)程來(lái)抑制肺纖維化的發(fā)展。

1.4 活性氧調(diào)節(jié)劑 (reactive oxygen species modulator,ROMO) ROMO1是ROS的一個(gè)調(diào)節(jié)因子,ROMO1存在于線粒體中,可以通過(guò)線粒體電子傳遞鏈復(fù)合體Ⅲ介導(dǎo)線粒體ROS產(chǎn)生[52]。敲除ROMO1可以抑制線粒體ROS產(chǎn)生以及細(xì)胞凋亡,并且在IPF患者中也發(fā)現(xiàn)ROMO1的表達(dá)增加[53],提示ROMO1 可能通過(guò)誘導(dǎo)線粒體ROS產(chǎn)生和促進(jìn)細(xì)胞凋亡來(lái)促進(jìn)肺纖維化的發(fā)生。關(guān)于ROMO1導(dǎo)致肺纖維化的具體通路尚不明確。在腎間質(zhì)纖維化的小鼠模型中發(fā)現(xiàn)ROMO1和TGF-β1的表達(dá)升高,用過(guò)氧化氫 作 用 的 HK-2 細(xì) 胞ROMO1、TGF-β1、Smad2/3 和p-Smad2/3的表達(dá)水平也升高,而ROMO1敲除后TGF-β1、Smad2/3和p-Smad2/3的表達(dá)均被抑制,提示ROMO1可能通過(guò)TGF-β1信號(hào)通路誘導(dǎo)腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生[54]。但在肺纖維化中ROMO1 是否也是通過(guò)TGF-β1信號(hào)通路發(fā)揮作用,尚需進(jìn)一步研究。

1.5 細(xì)胞色素P450 (cytochrome P450,CYP) CYP 超家族在氧化代謝中也起到了重要的作用。CYP2E1是CYP的一個(gè)亞型。研究發(fā)現(xiàn),A549 細(xì)胞和 MRC5 細(xì)胞中CYP2E1表達(dá)增加。抑制CYP2E1的表達(dá)可以顯著降低放射線誘導(dǎo)的ROS水平和減少AE2細(xì)胞的凋亡,并且運(yùn)用CYP2E1特異性抑制劑二烯丙基二硫可以抑制放射線誘導(dǎo)的IPF在小鼠體內(nèi)的發(fā)展[55]。提示抑制CYP2E1也可能是治療肺纖維化的一個(gè)新的作用靶點(diǎn)。

2 抗氧化作用和肺纖維化

肺內(nèi)的抗氧化作用在肺纖維化形成的過(guò)程中也起到了重要作用。既往研究主要集中于抗氧化的酶類(lèi),包括超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase,SOD)、過(guò)氧化氫酶以及谷胱甘肽過(guò)氧化物酶 (glutathione peroxidase,GPx)等,另外非酶類(lèi)的抗氧化劑也在其中發(fā)揮了重要作用,包括了白蛋白、黏蛋白、維生素E、維生素C、類(lèi)胡蘿卜素以及黃酮類(lèi)化合物等[5]。但是最近越來(lái)越多的證據(jù)表明核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2 (nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)可能是抗氧化反應(yīng)的主要調(diào)控者,它的失調(diào)和肺纖維化的發(fā)展有著密切的聯(lián)系[6]。Nrf2是一個(gè)堿性亮氨酸拉鏈應(yīng)激反應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子,在維持細(xì)胞的氧化還原動(dòng)態(tài)平衡中起到了關(guān)鍵作用。它可以轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞核,通過(guò)激活抗氧化反應(yīng)元件 (antioxidant responsive element,ARE)來(lái)調(diào)節(jié)上百種基因的轉(zhuǎn)錄[56]。目前有許多模型用來(lái)解釋Nrf2的激活過(guò)程,其中氧化Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1 (Kelch-like ECH-associated protein 1,Keap1)是研究最廣泛的一個(gè)機(jī)制。正常情況下,在細(xì)胞質(zhì)中Keap1和Nrf2結(jié)合,氧化應(yīng)激使得Keap1-Nrf2 復(fù)合體分離,釋放出的Nrf2跟隨著磷酸化的蛋白激酶轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞核,進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)在細(xì)胞保護(hù)基因啟動(dòng)子區(qū)域和ARE/親電子反應(yīng)元件結(jié)合,調(diào)節(jié)細(xì)胞保護(hù)基因的轉(zhuǎn)錄[57]。

Nrf2涉及基因眾多,與許多疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān),其中包括免疫炎癥反應(yīng)、組織重塑和纖維化、腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移等。而Nrf2在肺纖維化中的作用也是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。Liu等[58]發(fā)現(xiàn)使用博來(lái)霉素可顯著降低小鼠體內(nèi)Nrf2的表達(dá),其機(jī)制可能是通過(guò)細(xì)胞外信號(hào)相關(guān)激酶的磷酸化來(lái)抑制Nrf2的激活,而使用Nrf2激活劑咖啡酸苯乙酯可以抑制博來(lái)霉素誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞增殖和膠原的產(chǎn)生以及增加SOD、過(guò)氧化氫酶等抗氧化蛋白的表達(dá)。相反,敲除Nrf2可以誘發(fā)氧化應(yīng)激和肌成纖維細(xì)胞的分化,使用Nrf2激活劑蘿卜硫素 (sulforaphane,SFN)則可誘導(dǎo)肌成纖維細(xì)胞去分化的發(fā)生[59]。以上研究提示Nrf2 的激活可能在抑制肺纖維化的發(fā)生發(fā)展中起到了重要作用。但是,Zucker等[60]研究發(fā)現(xiàn)Nrf2是否能夠發(fā)揮抗氧化的作用和其含量有密切關(guān)系。在低程度氧化應(yīng)激的情況下產(chǎn)生的Nrf2確實(shí)可以激活細(xì)胞的抗氧化防御機(jī)制,使得ROS的水平降低到不足以對(duì)細(xì)胞生存產(chǎn)生危害。如果ROS的水平繼續(xù)上升,Nrf2會(huì)在細(xì)胞核內(nèi)聚集,導(dǎo)致其和Klf9的啟動(dòng)子結(jié)合,使得Klf9 轉(zhuǎn)錄增多,而Klf9 可以進(jìn)一步增加ROS的水平,最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。而且在小鼠敲除Klf9基因也可以減輕博來(lái)霉素誘導(dǎo)產(chǎn)生的氧化應(yīng)激和肺纖維化。

Nrf2抑制肺纖維化的具體機(jī)制尚不明了,除了可以增加ARE/Nrf2依賴的相關(guān)抗氧化相關(guān)蛋白 (例如GPx1、HO-1和NQO1 等)的表達(dá)之外[61],Nrf2 還可通過(guò)抑制snail以及Numb的表達(dá)來(lái)抑制EMT 的發(fā)展。snail是鋅指轉(zhuǎn)錄因子snail家族的一員,snail家族被認(rèn)為是EMT 的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。Zhou 等[62]發(fā)現(xiàn)運(yùn)用SFN 可以抑制TGF-β1誘導(dǎo)的EMT 和snail的表達(dá),沉默Nrf2則可以提高EMT程度以及snail含量,而抑制了snail的表達(dá)后運(yùn)用SFN,TGF-β1誘導(dǎo)產(chǎn)生的EMT 反而增多。提示Nrf2可能可以通過(guò)抑制snail的表達(dá)來(lái)減少EMT 和抑制纖維化的發(fā)展過(guò)程。而Numb作為一種進(jìn)化上保守的蛋白,其在決定細(xì)胞命運(yùn)中發(fā)揮了重要的作用[63]。例如它可以作為NOTCH、WNT 以及Hedgehog信號(hào)通路的負(fù)調(diào)節(jié)因子來(lái)影響細(xì)胞的分化、遷移以及組織再生。Zhang等[64]發(fā)現(xiàn)在Nrf2表達(dá)降低的小鼠體內(nèi)Numb 水平是升高的,使用SFN 或抑制Numb可以減緩EMT 的發(fā)展,而抑制Numb則會(huì)降低激活Nrf2起到的預(yù)防EMT 的作用。提示Nrf2可能通過(guò)抑制Numb的異常表達(dá)來(lái)延緩肺纖維化的發(fā)展。另一方面,高遷移率族蛋白B1和EMT 的發(fā)生有關(guān)。Qu等[65]研究發(fā)現(xiàn)Nrf2也可通過(guò)高遷移率族蛋白B1來(lái)抑制EMT。除了抑制EMT 之外,Nrf2可能還可以通過(guò)其他途徑促進(jìn)EMT 的產(chǎn)生,是否是通過(guò)上述的Klf9 或是其他通路,有待進(jìn)一步研究。

作為機(jī)體抗氧化作用的重要一員,Pekovic-Vaughan等[66]發(fā)現(xiàn)在正常生理情況下體內(nèi)的生物鐘可以有節(jié)律地調(diào)節(jié)Nrf2/谷胱甘肽介導(dǎo)的抗氧化通路,來(lái)影響肺纖維化的發(fā)生。在Nrf2生理水平的最低點(diǎn)使用博來(lái)霉素可以使小鼠發(fā)生更嚴(yán)重的纖維化,而使用SFN 可以阻斷這一現(xiàn)象的產(chǎn)生。并且發(fā)現(xiàn)在生物鐘節(jié)律不規(guī)律的小鼠體內(nèi)Nrf2和還原性谷胱甘肽的水平都比較低,可見(jiàn)體內(nèi)Nrf2和谷胱甘肽水平的波動(dòng)對(duì)于肺纖維化的發(fā)生發(fā)展,甚至對(duì)于治療用藥時(shí)間的選擇,可能會(huì)起到一定的作用。另一方面,Hecker等[67]研究表明NOX4-Nrf2 氧化還原失衡,可能是導(dǎo)致肺纖維化的發(fā)病率隨著年齡的增長(zhǎng)而急劇增加的一個(gè)重要因素。NOX4和肺纖維化小鼠肺內(nèi)成纖維細(xì)胞的衰老和抗凋亡有關(guān),在肺纖維化老年鼠的肺內(nèi)可見(jiàn)大量衰老和抗凋亡的肌成纖維細(xì)胞聚集,并且NOX4 的水平也是增高的,Nrf2水平則是降低的。通過(guò)抑制NOX4,可以減少這類(lèi)肌成纖維細(xì)胞的產(chǎn)生,甚至可以逆轉(zhuǎn)肺纖維化的過(guò)程。提示年齡的變化可能通過(guò)NOX4-Nrf2來(lái)影響肺纖維化的發(fā)生。

目前研究表明某些藥物或物質(zhì)可以通過(guò)Nrf2通路來(lái)發(fā)揮抑制肺纖維化發(fā)展的作用。Bach1是一種轉(zhuǎn)錄抑制因子,與Maf識(shí)別元件結(jié)合發(fā)揮對(duì)抗Nrf2激活A(yù)RE 的作用[68]。而敲除Bach1可以抑制博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺纖維化發(fā)生[61]。吡非尼酮是目前批準(zhǔn)用于治療IPF的藥物之一,臨床試驗(yàn)已表明它有很好的延緩肺纖維化發(fā)展的效果[69]。Liu等[70]發(fā)現(xiàn)吡非尼酮可以抑制Bach1及其相關(guān)蛋白的表達(dá),促進(jìn)Nrf2及其下游相關(guān)抗氧化蛋白的產(chǎn)生,并且ROS相關(guān)蛋白的水平也顯著下降。提示吡非尼酮可以通過(guò)調(diào)節(jié)Nrf2/Bach1的平衡來(lái)抑制肺纖維化。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞也是肺纖維化研究中的一個(gè)熱點(diǎn)。Ni等[71]發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以顯著減少博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺纖維化中組織學(xué)改變和膠原沉積,并且可以增加SOD 的活性以及抑制丙二醛的產(chǎn)生。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以通過(guò)Nrf2 通路激活NQO1、γ-GCS和HO-1的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)抑制肺纖維化發(fā)展的作用。

除了Nrf2以外,一些抗氧化的酶類(lèi)以及非酶類(lèi)抗氧化劑在肺纖維化中的作用也逐步被闡明。M2 型巨噬細(xì)胞因?yàn)槟軌虍a(chǎn)生纖維化的信號(hào)而被認(rèn)為和肺纖維化的發(fā)展密切相關(guān),而M2型巨噬細(xì)胞主要通過(guò)巨噬細(xì)胞極化轉(zhuǎn)變而來(lái)。巨噬細(xì)胞極化可以分為2種：一種是經(jīng)典的巨噬細(xì)胞極化,這種極化的巨噬細(xì)胞能夠促進(jìn)炎癥產(chǎn)生,因而具有殺滅微生物和消除腫瘤的能力,其產(chǎn)生的巨噬細(xì)胞為M1型巨噬細(xì)胞;另一種選擇性的巨噬細(xì)胞極化產(chǎn)生的是M2型巨噬細(xì)胞,目前認(rèn)為它可以參與腫瘤的進(jìn)展和組織的重塑過(guò)程,因而具有促進(jìn)纖維化的作用。既往觀點(diǎn)認(rèn)為SOD 主要是抗氧化作用,但He等[72]發(fā)現(xiàn)SOD 中的Cu，Zn-SOD (SOD1)可以通過(guò)增加氣道巨噬細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化氫的產(chǎn)生而促進(jìn)肺纖維化的發(fā)生。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)其誘導(dǎo)產(chǎn)生的過(guò)氧化氫可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2型轉(zhuǎn)變[73],而其調(diào)控機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)節(jié)Jmjd3來(lái)實(shí)現(xiàn)的[74]。

近年來(lái),研究也發(fā)現(xiàn)越來(lái)越多的藥物通過(guò)抗氧化作用延緩肺纖維化的發(fā)生發(fā)展。Wang等[75]發(fā)現(xiàn)依達(dá)拉奉可以減輕ARDS誘導(dǎo)的早期肺纖維化。作為一種自由基清除劑,依達(dá)拉奉在臨床上用于治療缺血性腦損傷已有十余年的歷史。在此之前,Zhi等[76]已經(jīng)發(fā)現(xiàn)依達(dá)拉奉可能在治療肺纖維化中發(fā)揮一定的作用。給百草枯誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠使用依達(dá)拉奉治療,肺組織和支氣管肺泡灌洗液中丙二醛、IL-6、TNF-α 和羥脯氨酸的水平顯著降低,并且SOD 和GPx的含量增高。在另一個(gè)研究中,Yu等[77]進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)了依達(dá)拉奉可以通過(guò)調(diào)節(jié)氧化和抗氧化作用的平衡來(lái)抑制博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺纖維化的發(fā)展。而Wang等[75]發(fā)現(xiàn)依達(dá)拉奉可以減輕脂多糖誘導(dǎo)的肌成纖維細(xì)胞的分化和減緩肺纖維化的過(guò)程,一方面依達(dá)拉奉可以通過(guò)減輕脂多糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激來(lái)減輕肺纖維化,另一方面可以通過(guò)TGF-β1/Smad3通路來(lái)抑制纖維化的發(fā)展。雷帕霉素作為一種抗真菌藥和免疫抑制劑,Tai等[78]發(fā)現(xiàn)其可以通過(guò)激活Nrf2通路來(lái)減輕肺纖維化。阿密曲替林作為一種三環(huán)類(lèi)抗抑郁藥,Zaafan等[79]研究發(fā)現(xiàn)其也可通過(guò)Nrf2 通路來(lái)抑制肺纖維化。除此之外,研究顯示某些中藥成分也能夠通過(guò)抗氧化作用延緩肺纖維化的發(fā)展。An等[80]發(fā)現(xiàn)丹參酮ⅡA 能夠激活Nrf2/谷胱甘肽通路來(lái)限制肌成纖維細(xì)胞增殖時(shí)谷氨酰胺的分解,達(dá)到抑制肺纖維化發(fā)展的作用。Tian等[81]發(fā)現(xiàn)大黃素也可通過(guò)Nrf2通路起到抑制肺纖維化的效果。

雖然某些抗氧化藥物對(duì)于肺纖維化的患者可能是有效的,但也有研究發(fā)現(xiàn)在臨床上運(yùn)用抗氧化藥物治療的效果并不明顯。以N-乙酰半胱氨酸為例,Okuda等[82]研究表明N-乙酰半胱氨酸對(duì)于IPF 患者是有利的;而Martinez等[83]認(rèn)為對(duì)于延緩IPF的發(fā)展,N-乙酰半胱氨酸并沒(méi)有給患者帶來(lái)好處。Kandhare等[84]總結(jié)了12篇研究一共1 062例IPF患者應(yīng)用抗氧化藥物治療的情況,發(fā)現(xiàn)應(yīng)用了抗氧化藥物的患者的肺功能測(cè)驗(yàn)以及6分鐘步行試驗(yàn)等指標(biāo)并沒(méi)有太大的改善,相反,還大大增加了不良反應(yīng)的發(fā)生,但是患者的死亡率并沒(méi)有太大的變化。所以,對(duì)于抗氧化藥物是否真的能在肺纖維化治療中發(fā)揮作用,還需進(jìn)一步深入研究。

3 討論與展望

肺纖維化是一個(gè)慢性持續(xù)性的過(guò)程,目前世界上沒(méi)有很好的藥物和治療措施能阻止肺纖維化的發(fā)展。對(duì)肺纖維化分子機(jī)制的研究有助于找到新的治療手段或新的治療靶點(diǎn),以延緩、停止疾病的發(fā)展甚至是治愈疾病。近年來(lái),研究發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激涉及到許多疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程,包括與肺纖維化之間也有著密切的聯(lián)系。對(duì)氧化應(yīng)激分子機(jī)制的探索也取得了一定的成果,起氧化作用的NOX4、起抗氧化作用的Nrf2 都是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。除此之外,AngⅡ、線粒體自噬、ROMO、細(xì)胞色素P450等也在肺纖維化的過(guò)程中發(fā)揮了一定的作用,并且也發(fā)現(xiàn)許多藥物可以通過(guò)上述分子或通路發(fā)揮抗肺纖維化的效果。但是從目前的研究結(jié)果轉(zhuǎn)化到臨床實(shí)際應(yīng)用還有一段很長(zhǎng)的路要走,大多數(shù)相關(guān)通路的具體分子機(jī)制尚未明了,仍需進(jìn)一步探索。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突