劉蘭，陳雅楠，尚云濤，范寶莉*，王振英

(1.天津師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，天津 300387；2.天津市動植物抗性重點實驗室，天津 300387；3.天津市水資源與水環(huán)境重點實驗室，天津 300387)

大蒜素是大蒜中重要的天然活性成分，具有促進(jìn)消化，抑菌，增強(qiáng)機(jī)體免疫力等功效[1]。目前，大蒜素的生產(chǎn)主要依靠大蒜提取和化學(xué)合成。從大蒜中提取大蒜素易受大蒜種質(zhì)退化、氣候、貯藏及價格等多種因素影響。化學(xué)合成則存在原料雜質(zhì)多、產(chǎn)品純度低等問題[2]。植物愈傷組織培養(yǎng)技術(shù)不僅是保護(hù)植物種質(zhì)資源的重要手段，還能夠高效、穩(wěn)定地獲得植物次級代謝產(chǎn)物，并已在中藥資源領(lǐng)域獲得廣泛應(yīng)用[3-6]。目前，對于大蒜愈傷組織的研究主要集中于大蒜脫毒快繁、種質(zhì)資源研究及多倍體育種方面[7-9]。從大蒜愈傷組織中提取大蒜素不但可以作為大蒜素生產(chǎn)的重要補(bǔ)充，還能夠充分利用我國現(xiàn)有優(yōu)質(zhì)大蒜資源，具有十分廣闊的發(fā)展前景和實際應(yīng)用價值。

大蒜中含硫化合物種類較多[10]，本研究利用高效液相色譜法對大蒜愈傷組織中的二烯丙基二硫進(jìn)行分析檢測。該方法靈敏度高，重現(xiàn)性好，操作簡便，結(jié)果準(zhǔn)確，為大蒜愈傷組織中大蒜素的提取提供一種分析檢測技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大蒜愈傷組織材料：寶坻大蒜鱗莖誘導(dǎo)生成愈傷組織，繼代1次后作為供試材料。

二烯丙基二硫標(biāo)準(zhǔn)品：Sigma試劑公司；甲醇(梯度級色譜純)：康科德公司；超純水(≥18.2 MΩ·cm)；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

1200型高效液相色譜儀(配有二元泵、在線真空脫氣系統(tǒng)、自動進(jìn)樣器、柱溫箱、DAD檢測器、Chem Station工作站)：美國Agilent公司；電子天平、水浴鍋、離心機(jī)。

1.3 色譜體系

色譜柱：Eclipse Plus C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，保護(hù)柱：Eclipse Plus C18Grd(4.6 mm×12.5 mm，5 μm)，柱溫35 ℃，流動相為甲醇∶水(含0.2% 甲酸，80∶20)，流速1.0 mL/min，二極管陣列檢測器檢測波長240 nm，進(jìn)樣量50 μL。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備

精密稱取二烯丙基二硫標(biāo)準(zhǔn)品30.0 mg，溶于甲醇中定容至50 mL，再吸取上述混合溶液1 mL用甲醇定容至10 mL，梯度稀釋作為系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.5 樣品前處理

稱取約2.0 g愈傷組織加入提取液(磷酸緩沖液)研磨，定容至10 mL，吸取愈傷組織勻漿以12000 r/min離心3 min，取上清液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜準(zhǔn)備上機(jī)檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC分析檢測的建立

2.1.1 HPLC檢測二烯丙基二硫標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖及樣品

根據(jù)1.3的HPLC色譜體系，測得標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的色譜圖(見圖1和圖2)。實驗結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品中的二烯丙基二硫保留時間一致，分離度較高，該方法可以準(zhǔn)確完成對大蒜愈傷組織中二烯丙基二硫的高效分離及檢測。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

根據(jù)1.4的方法，以濃度0.3，0.6，1.2，1.8，2.4，3.0，4.5 μg/mL為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖3。

圖1 二烯丙基二硫標(biāo)樣色譜圖Fig.1 Chromatogram of diallyl disulfide standard

圖2 大蒜愈傷組織樣品色譜圖Fig.2 Chromatogram of garlic callus sample

注：1為二烯丙基二硫。

圖3 二烯丙基二硫標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve of diallyl disulfide

實驗結(jié)果表明，二烯丙基二硫濃度在0.30～4.57 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好，其線性方程為y=20.65x-1.48，相關(guān)系數(shù)R2=0.999，以3倍信噪比計算檢出限為0.028 μg/mL。

2.2 樣品前處理對愈傷組織提取大蒜素含量的影響

2.2.1 溫度對愈傷組織提取大蒜素含量的影響

不同提取溫度對大蒜素含量影響的實驗結(jié)果見圖4。

圖4 溫度對愈傷組織提取大蒜素的影響Fig.4 Effects of temperature on extraction of allicin in garlic callus

由圖4可知，隨著提取溫度的升高，大蒜素含量呈先增加后減少的趨勢。當(dāng)提取溫度為35 ℃時，大蒜素含量達(dá)到最高，約為27 μg/g。這可能是因為當(dāng)提取溫度過低時，蒜氨酸酶的活性較低，蒜氨酸酶不能有效催化蒜氨酸生成大蒜素。隨著提取溫度的升高，蒜氨酸酶的活性逐漸增強(qiáng)，大蒜素含量顯著升高。但當(dāng)提取溫度達(dá)到40 ℃時，蒜氨酸酶活性受到抑制，大蒜素含量則明顯降低。

2.2.2 料液比對愈傷組織提取大蒜素含量的影響

不同料液比對大蒜素含量影響的實驗結(jié)果見圖5。

圖5 料液比對愈傷組織提取大蒜素的影響Fig.5 Effects of material-liquid ratio on extraction of allicin in garlic callus

由圖5可知，料液比在1∶1～1∶3的范圍內(nèi)，隨著料液比的增大，大蒜素含量增加，當(dāng)料液比為1∶3時，大蒜素含量達(dá)到最高，約為29 μg/g。當(dāng)料液為1∶4時，大蒜素含量又有所降低?？傮w上講，料液比對大蒜素含量有一定的影響。

2.2.3 孵育時間對愈傷組織提取大蒜素含量的影響

不同孵育時間對大蒜素含量影響的實驗結(jié)果見圖6。

圖6 孵育時間對愈傷組織提取大蒜素的影響Fig.6 Effects of time on extraction of allicin in garlic callus

由圖6可知，隨著孵育時間的延長，大蒜素含量先上升，達(dá)到最大值后開始下降并逐漸趨于平衡。當(dāng)處理時間為15 min時，大蒜素含量達(dá)到最高，約為33 μg/g。這可能是因為孵育時間在15 min以內(nèi)時，蒜氨酸在蒜氨酸酶的作用下，大量產(chǎn)生大蒜素，并充分向水相轉(zhuǎn)移。但當(dāng)孵育時間過長時，大蒜素則可能轉(zhuǎn)化為其他副產(chǎn)物，造成其含量下降。

2.2.4 pH值對愈傷組織提取大蒜素含量的影響

不同提取液pH值對大蒜素含量影響的實驗結(jié)果見圖7。

圖7 pH值對愈傷組織提取大蒜素的影響Fig.7 Effects of pH values on extraction of allicin in garlic callus

由圖7可知，隨著提取液pH值的升高，大蒜素含量呈現(xiàn)先下降，后逐漸升高，再下降的趨勢。這可能原因是由于蒜氨酸酶在接近中性的提取液條件下活性較高，且大蒜素在堿性條件下穩(wěn)定性較差。在酸性條件下隨著提取液pH值的升高，大蒜素的轉(zhuǎn)化動力增大，當(dāng)提取液pH為7.0時，大蒜素含量達(dá)到最高，約為27 μg/g。隨著pH值繼續(xù)增大，大蒜素處于堿性環(huán)境，結(jié)構(gòu)受到影響，含量降低。

2.3 精密度實驗

取繼代1次的大蒜愈傷組織樣品按1.5的方法進(jìn)行前處理，按1.3的色譜分析體系上機(jī)進(jìn)行5次平行測試，計算保留時間及峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，見表1。結(jié)果表明，該方法精密度良好，大蒜素保留時間RSD<1%，峰面積RSD<1%。

表1 精密度實驗結(jié)果Table 1 The results of accuracy experiment

2.4 重復(fù)性實驗

取繼代1次的大蒜愈傷組織樣品5份按1.5的方法進(jìn)行前處理，按1.3的色譜分析體系上機(jī)測試，計算保留時間及峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，見表2。結(jié)果表明，該方法重復(fù)性良好，大蒜素保留時間RSD<1%，峰面積RSD<2%。

表2 重復(fù)性實驗結(jié)果Table 2 The results of repeatability experiment

2.5 穩(wěn)定性實驗

取繼代1次的大蒜愈傷組織樣品按1.5的方法進(jìn)行前處理，分別靜置0，2，4，8，12，24 h，按1.3的色譜分析體系上機(jī)測試，計算保留時間及峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，見表3。結(jié)果表明，該方法穩(wěn)定性良好，大蒜素保留時間RSD<1%，峰面積RSD<3%。

表3 穩(wěn)定性實驗結(jié)果Table 3 The results of stability experiment

2.6 回收率實驗

取繼代1次的大蒜愈傷組織樣品5份按1.5的方法進(jìn)行前處理，添加一定量的大蒜素標(biāo)準(zhǔn)品，按1.3的色譜分析體系上機(jī)測試，計算回收率。結(jié)果表明，大蒜素回收率為95%～102%，加標(biāo)回收率較理想，見表4。

表4 樣品加標(biāo)回收率Table 4 Sample recovery rate

3 討論

目前，大蒜素的檢測方法主要有高效液相色譜法、氣相色譜法、定硫法和紫外可見分光光度法等[11-14]。其中高效液相色譜法因重現(xiàn)性好、精密度高、操作便捷等優(yōu)勢成為大蒜素檢測的重要技術(shù)手段。

研究表明，影響植物愈傷組織提取代謝產(chǎn)物效果的因素很多，主要包括提取溫度、料液比、孵育時間和提取液pH等。大蒜素是由蒜氨酸酶在一定條件下催化蒜氨酸產(chǎn)生的，而溫度和pH是影響酶活性的重要因素。研究表明，蒜氨酸酶在溫度33～35 ℃，pH 6.5～7.0范圍內(nèi)具有較高的催化效率[15,16]。本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)提取溫度低于30 ℃或高于35 ℃及pH低于6.5時大蒜素提取效率明顯降低。當(dāng)孵育時間過短時，蒜氨酸酶不能與蒜氨酸充分反應(yīng)生成大蒜素。而孵育時間過長，大蒜素又可能進(jìn)一步分解為其他化合物。

與傳統(tǒng)大蒜種植相比，愈傷組織具有誘導(dǎo)增殖快、生長周期短、結(jié)構(gòu)疏松、纖維素含量低、易于破碎、細(xì)胞發(fā)育程度相近等特點。從大蒜愈傷組織中提取大蒜素有利于降低生產(chǎn)成本，擺脫季節(jié)、氣候、地域等因素對大蒜品質(zhì)的影響，具有便于生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)化及品質(zhì)控制，易于基因表達(dá)調(diào)控等優(yōu)勢。因此，將愈傷組織作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)大蒜素將有著較為廣闊的應(yīng)用前景。

4 結(jié)論

本研究對大蒜愈傷組織中提取的大蒜素進(jìn)行初步分析鑒定。在不同前處理提取條件下，大蒜素提取效果不同，結(jié)果表明：提取溫度為35 ℃，料液比為1∶3，孵育時間為15 min，提取液pH為7.0時大蒜素提取效果較好，并應(yīng)用HPLC技術(shù)檢測大蒜愈傷組織中的大蒜素含量。該方法靈敏度高，分離效果好，操作簡便，效率高，精密度及重復(fù)性均較為理想，實驗成本低，環(huán)境好，可以鑒定并精確檢測出大蒜愈傷組織中的大蒜素含量。