張曉紅 胡根海 王寒濤 王聰聰 魏恒玲 付遠(yuǎn)志 喻樹迅,*

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棉花中和基因的表達(dá)及啟動(dòng)子分析

張曉紅1胡根海1王寒濤2王聰聰2魏恒玲2付遠(yuǎn)志1喻樹迅2,*

1河南科技學(xué)院生命科技學(xué)院 / 現(xiàn)代生物育種協(xié)同創(chuàng)新中心, 河南新鄉(xiāng) 453003;2中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所 / 棉花生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 河南安陽 455000

從陸地棉中克隆了磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白和基因, 并對(duì)該基因進(jìn)行表達(dá)分析、啟動(dòng)子預(yù)測和啟動(dòng)子活性研究。利用啟動(dòng)子分析軟件PlantCARE預(yù)測得出,啟動(dòng)子區(qū)域有脫落酸響應(yīng)元件、干旱誘導(dǎo)的MYB結(jié)合位點(diǎn)和頂芽特異表達(dá)響應(yīng)元件等;啟動(dòng)子區(qū)域有乙烯響應(yīng)元件、干旱誘導(dǎo)的MYB結(jié)合位點(diǎn)和水楊酸響應(yīng)元件。因此, 將和分別構(gòu)建到啟動(dòng)子檢測載體pBI121-GUS上形成融合表達(dá)載體, 通過煙草瞬時(shí)轉(zhuǎn)化檢測得出這2個(gè)基因的啟動(dòng)子都具有活性。實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析表明,和在光周期處理和不同材料的陸地棉(栽培種和半野生種)中表達(dá)模式呈相反趨勢(shì)?；蚴苊撀渌?abscisic acid, ABA)、水楊酸(salicylic acid, SA)和鹽脅迫誘導(dǎo), 而可以響應(yīng)赤霉素(gibberellin, GA)、SA和ABA脅迫研究結(jié)果初步表明,和可能參與了植物逆境脅迫脫落酸和水楊酸響應(yīng)的調(diào)控, 為在棉花中進(jìn)一步闡明其功能奠定了基礎(chǔ)。

陸地棉;;; 表達(dá)分析; 啟動(dòng)子活性

棉花是我國最重要的經(jīng)濟(jì)作物之一, 在我國國民經(jīng)濟(jì)中占有舉足輕重的地位。目前在棉花種植結(jié)構(gòu)調(diào)整, 推進(jìn)植棉全程機(jī)械化進(jìn)程的大形勢(shì)下, 早熟作為棉花育種的重要目標(biāo)性狀顯得尤為重要[1]。開花是棉花由營養(yǎng)生長向生殖生長過渡的標(biāo)志, 也是培育早熟棉的一個(gè)重要指標(biāo), 同時(shí)也是決定棉花能否獲得豐產(chǎn)的重要農(nóng)藝性狀[2]。通過對(duì)花發(fā)育相關(guān)基因的功能分析, 進(jìn)行棉花品種熟性分子改良, 對(duì)實(shí)現(xiàn)棉花機(jī)械化直播和采收具有重要意義。

磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白(phosphatidylethanolamine binding protein, PEBP)在原核生物和真核生物中均被發(fā)現(xiàn)[3-5],其氨基酸結(jié)構(gòu)均有保守的磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域, 但是在原核生物和真核生物中仍然存在很大差異。TFL1 (TERMINAL FLOWER1)是磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白中的一個(gè)亞組, 該亞組基因的功能大部分都集中在開花調(diào)控通路。在擬南芥中,()是TFL1亞組中的一個(gè)基因, 其功能主要表現(xiàn)在鹽脅迫信號(hào)途徑[6]。和()也是該亞組中的2個(gè)基因, 這2個(gè)基因在營養(yǎng)生長階段頂芽中積累較少, 但是在開花之后其表達(dá)量急劇升高。擬南芥中通過維持莖頂端分生組織和花序分生組織的無限性, 延長植株的營養(yǎng)生長過程, 從而延遲植株的生殖生長進(jìn)程[7]。Conti等[8]研究表明TFL1蛋白通過運(yùn)輸?shù)竭_(dá)頂芽, 并且調(diào)控?cái)M南芥的植株結(jié)構(gòu)。同時(shí), TFL1蛋白能抑制和基因的表達(dá)并且保持花序的無限生長[9]。對(duì)基因進(jìn)行啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)的研究發(fā)現(xiàn), 該基因是在營養(yǎng)器官的分生組織中表達(dá)來控制開花時(shí)間[10]。Liu等[11]在山茱萸中發(fā)現(xiàn)過表達(dá)轉(zhuǎn)化擬南芥后, 擬南芥開花時(shí)間推遲, 植株高度增加, 頂端花芽和次生花序分枝增多。Rantanen等[12]發(fā)現(xiàn)在溫度和光周期的互作下, 林地草莓中基因能適時(shí)調(diào)控開花時(shí)間。Si等[13]研究發(fā)現(xiàn)陸地棉基因與果枝形成發(fā)育相關(guān), 但是棉花中該基因的啟動(dòng)子分析還無報(bào)道。

本研究依據(jù)棉花基因組測序結(jié)果[14-15], 克隆到和基因及其啟動(dòng)子, 同時(shí)進(jìn)行光周期、激素和脅迫處理分析其表達(dá)模式, 并分析其啟動(dòng)子活性, 旨在摸清和表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)制, 從而為棉花分子改良提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選用陸地棉栽培種“中棉所36”和半野生種“尖斑棉”。試驗(yàn)所用到的DNA聚合酶、反轉(zhuǎn)錄酶、pMD18-T載體、質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒和熒光定量試劑盒均購自Takara公司, RNA提取試劑盒購自天根公司, 大腸桿菌感受態(tài)DH5a、pBI121載體及農(nóng)桿菌LBA4404由本實(shí)驗(yàn)室制備并保存。

1.2 材料處理及取樣

用于光周期處理試驗(yàn)的材料種植于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所早熟組人工氣候培養(yǎng)室, 栽培種為“中棉所36”和半野生種為“尖斑棉”, 培養(yǎng)條件為長日照, 等到二葉展平時(shí)期, 短日照處理一周, 并將處理過后的棉花分兩批繼續(xù)培養(yǎng), 一批為長日照(14 h/10 h 光照/黑暗, 光照時(shí)間為8:00–22:00), 另一批為短日照(10 h/14 h 光照/黑暗, 光照時(shí)間為8:00–18:00), 溫度都為28℃, 取樣時(shí)期分別于子葉展平期到五葉展平期, 取樣后快速放入液氮中冷凍并存于-80℃冰箱中備用。激素處理所用材料為“中棉所36”水培材料, 室內(nèi)種植條件為14 h光照/10 h黑暗, 溫度為26℃。于三葉期水培液中增加激素和脅迫處理, 以清水為對(duì)照。所用SA濃度為200 μmol L–1, ABA和GA濃度為100 μmol L–1, 處理后的1、3、7、12和24 h時(shí)間段進(jìn)行根部取樣, 選取10株左右水培苗剪下幼嫩根部, 吸取根部水分后液氮冷凍并置-80℃冰箱備用, 試驗(yàn)重復(fù)3次, 利用GraphPad Prism 5軟件作圖及統(tǒng)計(jì)分析。

1.3 GhTFL1a和GhTFL1c的生物信息學(xué)分析

研究中所用到的氨基酸序列下載自NCBI網(wǎng)站, 使用ClustalX2軟件多重序列比對(duì), 使用MEGA6.06最大似然法構(gòu)建進(jìn)化樹。利用ExPASy網(wǎng)站上的Compute pI/Mw (http://web.expasy.org/compute_pi/)對(duì)其蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測和分析, 并用NCBI的CDD (https://www.ncbi. nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml)數(shù)據(jù)庫對(duì)其結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測。用PlantCARE (http://bioinformatics.psb.ugent.be/ webtools/plantcare/html/)預(yù)測啟動(dòng)子區(qū)域順式作用元件。

1.4 基因的定量表達(dá)分析

RNA用天根多糖多酚RNA提取試劑盒提取, RNA的質(zhì)量必須保證OD260/280為1.8~2.1, OD260/230大于1.8。用Takara RR047A試劑盒反轉(zhuǎn)錄, 使用gDNA Eraser消化總RNA中殘留的基因組DNA后進(jìn)行15 min的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA。使用Takara RR420A試劑盒及SYBR Green分析熒光定量, 所用儀器為Applied Biosystems Q6實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。陸地棉中以為內(nèi)參。所用引物見表1。

1.5 GhTFL1a和GhTFL1c啟動(dòng)子克隆和瞬時(shí)表達(dá)

利用Perl語言編寫的腳本, 從陸地棉基因組中獲取和基因上游約2000 bp的序列, 根據(jù)啟動(dòng)子順式作用元件預(yù)測結(jié)果設(shè)計(jì)引物(表1), 從翻譯起始位點(diǎn)(ATG)上游開始, 以中棉所36基因組為模板, 克隆啟動(dòng)子片段。使用 Infusion 連接酶(寶生物, 大連)與載體pBI121連接啟動(dòng)子片段, 雙酶切位點(diǎn)是d III和I, 將和構(gòu)建到啟動(dòng)子檢測載體pBI121-GUS上形成融合表達(dá)載體, 將連接后新鮮菌液送金唯智生物科技有限公司測序, 并保存測序正確的單克隆菌液以供后續(xù)試驗(yàn)使用。本氏煙草()按照Sparkes等[16]的方法種植和瞬時(shí)表達(dá)。

表1 本研究所用引物

1.6 GUS染色

取瞬轉(zhuǎn)后的煙草葉片組織, 加入GUS染色液, 37℃培養(yǎng)箱中溫育過夜24 h。接著, 依次用體積分?jǐn)?shù)為70%、80%、90%和無水乙醇脫色。最后, 在體式顯微鏡(SOPTOP, SZN)下觀察組織的染色情況并照相。

2 結(jié)果與分析

2.1 陸地棉GhTFL1a和GhTFL1c的序列分析

基因位于陸地棉A亞組第11染色體上, 編碼框長522 bp, 編碼氨基酸長度為173 aa。經(jīng)ExPASy網(wǎng)站預(yù)測知, 其編碼蛋白質(zhì)約為19.3 kDa, 等電點(diǎn)為9.68。基因位于D亞組第4染色體上, 編碼框長519 bp, 編碼氨基酸長度為172 aa, 編碼蛋白質(zhì)約為19.1 kDa, 等電點(diǎn)為8.09。進(jìn)化樹分析結(jié)果表明,和分別與擬南芥中的和親緣關(guān)系相近(圖1-A), 根據(jù)TAIR網(wǎng)站提供的擬南芥氨基酸序列進(jìn)行序列比對(duì), 氨基酸序列具有比較保守的磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域(圖1-B)。

圖1 GhTFL1a和GhTFL1c的進(jìn)化樹及氨基酸多重序列比對(duì)

A: 進(jìn)化樹分析; B: 氨基酸多重序列比對(duì)。*代表氨基酸完全一致,、和序列號(hào)分別為NM_125597、U77674和NM_128315,和在陸地棉中序列號(hào)分別為Gh_A11G0088和Gh_D04G0971。

A: phylogentic analysis of/and their homologous genes in; B: alignment of amino acid sequences of/and their homologous genes in. * indicates the same amino acid, the ID of,, andis NM_125597, U77674, and NM_128315, respectively, the ID ofandis Gh_A11G0088 and Gh_D04G0971, respectively.

2.2 苗期葉片中GhTFL1a和GhTFL1c基因的表達(dá)模式分析

為研究和是否受光周期影響, 利用光周期試驗(yàn)處理半野生種和栽培種材料, 對(duì)不同時(shí)期幼苗葉片取樣分析表明,和在半野生種及栽培種陸地棉中表達(dá)趨勢(shì)一致,表達(dá)在長日照下明顯高于短日照下(圖2-A和圖2-C), 而三葉期的表達(dá)量在短日照下高于長日照下, 隨后表達(dá)量逐漸降低并低于長日照下(圖2-B和2-D)。同時(shí), 對(duì)這2個(gè)基因在栽培種棉和半野生棉中的表達(dá)模式進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),在半野生棉中表達(dá)量高于栽培棉(圖3-A), 而在栽培棉中表達(dá)量高于半野生棉(圖3-B)。說明從半野生種棉到栽培種棉的進(jìn)化過程中, 光照條件從短日照促進(jìn)開花基因的表達(dá)向光照不敏感轉(zhuǎn)化, 同時(shí)在光周期的影響下,和可能具有相反的生物學(xué)功能, 仍需對(duì)多個(gè)栽培種和半野生種材料進(jìn)行后續(xù)驗(yàn)證。

圖2 GhTFL1a和GhTFL1c在光周期處理試驗(yàn)中的表達(dá)模式分析

A和B為和基因在栽培種“中棉所36” 中的表達(dá); C和D為和基因在半野生種“尖斑棉”中的表達(dá)。誤差棒為3次重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)差。

A and B indicate the expression ofandin cotton cultivar “CCRI 36”; C and D indicate the expression ofandin semi-wild cotton. Error bars indicate the standard deviation (±SD).

圖3 GhTFL1a和GhTFL1c在栽培種和半野生種中表達(dá)模式分析

橫坐標(biāo)代表取樣時(shí)期, 分別為長日照子葉、一葉、二葉、三葉、四葉、五葉以及短日照三葉、四葉和五葉。

The abscissa shows period, which from left to right is expanded cotyledon, first, second, third, forth, and fifth leaves in long day, and third, forth and fifth leaves in short day.

2.3 GhTFL1a和GhTFL1c的啟動(dòng)子分析及其對(duì)外源激素的應(yīng)答

該基因擁有磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白的保守結(jié)構(gòu)域, 因此分析啟動(dòng)子的順式作用元件對(duì)于揭示和的功能是非常必要的。從中棉所陸地棉基因組數(shù)據(jù)庫中獲取和基因起始密碼子上游2000 bp的序列, 并利用PlantCARE數(shù)據(jù)庫對(duì)其順式作用元件進(jìn)行了預(yù)測。結(jié)果如表2所示。這2個(gè)基因的啟動(dòng)子上主要存在兩大類順式作用元件, 一類是光響應(yīng)元件和生物鐘節(jié)律響應(yīng)元件, 一類是脅迫響應(yīng)元件, 如與脅迫相關(guān)的水楊酸、脫落酸和干旱脅迫等元件。已知GA是一種能促進(jìn)種子發(fā)芽、植物生長和提早開花的生長調(diào)節(jié)劑, 而ABA、SA和鹽脅迫都是與植物逆境和脅迫響應(yīng)相關(guān)的因素。

表2 陸地棉基因GhTFL1a和GhTFL1c啟動(dòng)子順式作用元件預(yù)測

利用棉花水培方法來研究和在激素和脅迫處理下的應(yīng)答模式。經(jīng)SA處理3 h后的表達(dá)量開始升高, 12 h到達(dá)峰值, 表達(dá)量約是對(duì)照組的32倍(圖4-A)。經(jīng)ABA處理3 h后處理組中的表達(dá)量開始升高, 7 h達(dá)到最大值, 隨后下降(圖4-B)。經(jīng)GA處理后,的表達(dá)量與對(duì)照相比沒有顯著的倍數(shù)差異(圖4-C)。NaCl處理后,的表達(dá)量在3 h和12 h出現(xiàn)峰值(圖4-D)。以上結(jié)果表明, SA、ABA和鹽脅迫都可以顯著促進(jìn)陸地棉中的表達(dá), 而GA對(duì)的轉(zhuǎn)錄無明顯作用,可以響應(yīng)SA、ABA和鹽脅迫。經(jīng)SA處理后,的表達(dá)量一直在降低, 到12 h表達(dá)量降到最低點(diǎn), 對(duì)照組中表達(dá)量約是該基因表達(dá)量的26倍(圖5-A)。經(jīng)ABA處理3 h后處理組中的表達(dá)量開始下降, 7 h達(dá)到最小值, 隨后上升(圖5-B)。經(jīng)GA處理后,的表達(dá)量開始上升, 3 h后表達(dá)開始下降(圖5-C)。NaCl處理后,的表達(dá)量與對(duì)照相比沒有明顯的倍數(shù)差異(圖5-D)。SA、ABA和GA處理后,的表達(dá)量都比對(duì)照低。以上結(jié)果表明, SA、ABA和GA都可以抑制陸地棉中的表達(dá), 而鹽脅迫對(duì)的轉(zhuǎn)錄無明顯作用,可以響應(yīng)SA、ABA和GA脅迫。

圖4 棉花水培苗經(jīng)過處理后24 h內(nèi)GhTFL1a基因表達(dá)量變化

A: 水楊酸; B: 脫落酸; C: 赤霉素; D: NaCl。誤差棒為3次重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)差。

A: salicylic acid; B: gibberellins; C: abscisic acid; D: NaCl. Error bars on the columns indicate the standard deviation (±SD).

2.5 GhTFL1a和GhTFL1c的啟動(dòng)子活性分析

對(duì)和的啟動(dòng)子進(jìn)行克隆, 得到基因啟動(dòng)子全長1558 bp,基因啟動(dòng)子全長1631 bp。以煙草瞬時(shí)表達(dá)分析啟動(dòng)子活性表明,和基因的啟動(dòng)子都具有啟動(dòng)活性, 與陽性對(duì)照pBI121相比, 活性較弱(圖6)。

圖5 棉花水培苗經(jīng)過處理后24小時(shí)內(nèi)GhTFL1c基因表達(dá)量變化

A: 水楊酸; B: 赤霉素; C: 脫落酸; D: NaCl。誤差棒為3次重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)差。

A: salicylic acid; B: gibberellins; C: abscisic acid; D: NaCl; Error bars indicate the standard deviation (±SD).

圖6 煙草瞬時(shí)表達(dá)GhTFL1a和GhTFL1c的啟動(dòng)子

A: 陽性對(duì)照pBI121; B: pGhTFL1a∷GUS; C: pGhTFL1c∷GUS; D: 陰性對(duì)照。

A: positive control pBI121; B: pGhTFL1a∷GUS; C: pGhTFL1c∷GUS; D: negative control.

3 討論

開花是陸地棉的重要農(nóng)藝性狀之一?；ㄆ诘脑缤碛绊懏a(chǎn)量, 也影響品種的區(qū)域適應(yīng)性。雖然開花是一個(gè)由多基因控制的數(shù)量性狀, 經(jīng)典遺傳學(xué)研究也表明許多開花相關(guān)的基因符合孟德爾遺傳定律[17]。陸地棉全基因組測序的完成對(duì)深入研究目標(biāo)性狀的遺傳控制具有重要的意義和推動(dòng)作用[14-15]。

近年來, 對(duì)棉花開花相關(guān)基因的克隆及功能研究較多[18-20], 而針對(duì)開花基因的啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)分析和蛋白表達(dá)調(diào)控等研究較少。本研究從陸地棉基因組數(shù)據(jù)庫中共檢 索到4條亞組基因, 并對(duì)其中的和進(jìn)行表達(dá)調(diào)控、啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)和活性分析。啟動(dòng)子順式作用元件預(yù)測出和啟動(dòng)子區(qū)域不僅包括基本的調(diào)控元件, 還包含許多與光、生物鐘、植物激素和逆境響應(yīng)相關(guān)的調(diào)控元件。在植物的生長發(fā)育過程中, 光周期是一種重要的信號(hào)途徑來調(diào)控開花相關(guān)基因的表達(dá)[21-22]。本研究利用光周期對(duì)不同材料的陸地棉(栽培種和半野生種)處理發(fā)現(xiàn)和在半野生種及栽培種陸地棉中表達(dá)趨勢(shì)一致, 這也說明從半野生種棉到栽培種棉的進(jìn)化過程中, 光照條件從短日照促進(jìn)開花基因的表達(dá)向光照不敏感轉(zhuǎn)化。Zhang等[23]研究表明和在根中優(yōu)勢(shì)表達(dá), 我們根據(jù)啟動(dòng)子區(qū)域的調(diào)控元件選擇了幾種激素和脅迫對(duì)棉花的水培苗進(jìn)行處理, 并對(duì)這2個(gè)基因表達(dá)模式分析表明SA、ABA和鹽脅迫都可以促進(jìn)陸地棉中的表達(dá),與擬南芥中的親緣關(guān)系相近, 在高鹽脅迫下,基因通過介導(dǎo)FT-FD模型來提供合適的保護(hù)機(jī)制適應(yīng)光周期途徑并促使開花[24]。由此推測可能參與鹽脅迫響應(yīng)的調(diào)控通路。而陸地棉中與擬南芥中親緣關(guān)系相近, 該基因的表達(dá)在SA和GA處理下受到抑制。同時(shí),和基因啟動(dòng)子在煙草瞬時(shí)表達(dá)中具有活性。上述試驗(yàn)處理都呈現(xiàn)出和在表達(dá)分析上是一種相反的表達(dá)模式, 這種結(jié)果是否可以推測2個(gè)基因具有相反的生物學(xué)功能, 還需要進(jìn)一步通過轉(zhuǎn)基因?qū)ζ溥M(jìn)行驗(yàn)證, 并通過對(duì)轉(zhuǎn)基因后代植株的脅迫處理來分析; 同時(shí)啟動(dòng)子分析試驗(yàn)表明這2個(gè)基因的啟動(dòng)子都具有活性, 后期還需在擬南芥中進(jìn)行表達(dá)部位的驗(yàn)證來確定其是?；砸只蚴墙M成性啟動(dòng)子, 這樣才能進(jìn)一步深入掌握和基因及其啟動(dòng)子的功能。

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Expression and promoter activity ofandin Upland cotton

ZHANG Xiao-Hong1, HU Gen-Hai1, WANG Han-Tao2, WANG Cong-Cong2, WEI Heng-Ling2, FU Yuan-Zhi1, and YU Shu-Xun2,*

1College of Life Science and Technology, Henan Institute of Science and Technology / Henan Collaborative Innovation Center of Modern Biological Breeding, Xinxiang 453003, Henan, China;2Institute of Cotton Research, Chinese Academy of Agricultural Sciences / State Key Laboratory of Cotton Biology, Anyang 455000, Henan, China

In this study, we cloned the phosphatidylethanolamine-binding proteinandgenes from Upland cotton, and analyzed their expression and promoter activity. The results of promoter structure prediction revealed thatpromoter contains abscisic acid (ABA) responsiveness elements, drought-induced MYB binding sites and shoot-specific expression and light responsiveness elements, and the promoter region ofcontains ethylene-responsive element, drought-induced MYB binding sites and salicylic acid (SA) responsiveness elements. Thus, we constructed the fusion vector pBI121-GhTFL1a-GUS and pBI121-GhTFL1c-GUS, respectively. Transient transformation of tobacco showed that both promoters had the activity to drive the expression of target gene. Quantitative Real-time PCR result indicated that the expression profile ofandwas opposite during different photoperiod treatments of cultivated and semi-wild cotton. Meanwhile, theexpression ofwas induced by ABA, SA, and salt (NaCl), whileexpression was induced by SA, gibberellin (GA) and ABA. Taken together, the results suggest thatandmight be involved in the regulation of response to abiotic stresses (SA and ABA), which could provide a solid foundation for further function identification.

upland cotton;;; expression analysis; promoter activity

2018-06-20;

2018-12-24;

2019-01-04.

10.3724/SP.J.1006.2019.84082

喻樹迅, E-mail: ysx195311@163.com

E-mail: 12-126meinv@163.com

本研究由河南省高等學(xué)校重點(diǎn)科研項(xiàng)目(18A210002)和棉花生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題基金(CB2018A08)的資助。

This study was supported by the Key Scientific Research Projects of Colleges and Universities in Henan (18A210002) and the State Key Laboratory of Cotton Biology Open Fund (CB2018A08).

URL: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20181230.2243.008.html