馬曉寒 張 杰 張環(huán)緯 陳 彪 溫心怡 許自成

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通過外源MeJA抑制H2O2積累提高煙草的耐冷性

馬曉寒 張 杰 張環(huán)緯 陳 彪 溫心怡 許自成*

河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院, 河南鄭州 450002

茉莉酸甲酯(MeJA)是可參與多種生理生化過程的激發(fā)子, 為探究外源MeJA對低溫環(huán)境下煙草幼苗的影響, 以煙草品種“豫煙10號”為材料, 在其六葉一心時(shí)用4個(gè)不同濃度(1、10、100和1000 μmol L–1MeJA)進(jìn)行噴施處理3 d后, 再進(jìn)行低溫處理, 同時(shí)以正常溫度和低溫處理作為陽性和陰性對照。分析各處理的長勢指標(biāo)、相對電解質(zhì)滲透率、光合色素含量、抗氧化酶活性以及激素含量。結(jié)果表明: 在10 μmol L–1茉莉酸甲酯處理下能降低低溫對煙草幼苗的損傷。然后在材料和時(shí)期不變的情況下, 進(jìn)行DPI、10 μmol L–1MeJA以及DPI+MeJA處理以低溫處理為對照, 測定了H2O2、O2–、CAT、MDA以及ASA-GSH循環(huán)的含量。證明在外源茉莉酸甲酯協(xié)同低溫的處理下, 煙草植株中的H2O2主要作為毒害分子而非第二信使存在。

低溫脅迫; 煙草幼苗; 茉莉酸甲酯; H2O2傳導(dǎo)

煙草作為全球重要的經(jīng)濟(jì)作物和模式植物是喜溫作物的典型代表。它原產(chǎn)于熱帶亞熱帶地區(qū), 因此容易受寒冷天氣的影響[1]。對于煙草植株, 其適宜生長溫度(25~28℃)是前期較低, 中期較高, 成熟期不低于20℃。低溫作為一種非生物脅迫已經(jīng)在全世界成為限制作物生長和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的環(huán)境因素[2], 會(huì)對植物細(xì)胞造成不可逆的損傷。低溫造成冷害和凍害, 冷害是指溫度介于0℃和植株最低生長溫度之間, 凍害則表示溫度低于0℃[3]。冷害低溫是本文探索的重點(diǎn), 在冷害低溫環(huán)境下, 雖然不會(huì)完全抑制植物生長和代謝但卻能大幅度減緩作物生產(chǎn), 尤其是對于像煙草類的冷敏感作物。在其移栽期, 倒春寒會(huì)加劇低溫脅迫。經(jīng)大量研究表明, 低溫引起的植物損傷主要因細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)功能受損和活性氧過量[4]。

茉莉酸甲酯(MeJA)是一種與損傷相關(guān)的植物激素和信號分子, 作為天然植物生長調(diào)節(jié)劑, 廣泛存在于各種高等植物中, 并在調(diào)節(jié)應(yīng)激反應(yīng)和植物發(fā)育中發(fā)揮重要作用[5]。大量的研究也證實(shí)了MeJA能夠增強(qiáng)采后果蔬對低溫的抗性[6-7], 也可以通過積累植物螯合素賦予擬南芥對Cu和Cd脅迫的耐受性[8]。并且茉莉酸甲酯的施用能夠增強(qiáng)腺毛的分泌, 在病蟲害、低溫干旱等逆境中發(fā)揮防御的積極作用[9]。

脫落酸(ABA)和生長素(IAA)作為植物中重要的激素, 過氧化氫(H2O2)作為植物中關(guān)鍵的信號分子在應(yīng)對非生物脅迫中有重要的作用[10]。二亞苯基碘(DPI)是NADPH氧化酶的抑制劑, 可以通過抑制NADPH氧化酶的產(chǎn)生間接抑制H2O2的生成[11]。

然而現(xiàn)階段未曾探究外源MeJA對于煙草幼苗細(xì)胞組織耐冷性的影響, 同時(shí)對于MeJA與ABA、IAA以及H2O2的交叉串?dāng)_機(jī)理沒有一定的研究。為了檢驗(yàn)早期產(chǎn)生的H2O2是否是MeJA誘導(dǎo)耐冷性的關(guān)鍵因素, 遂在初期應(yīng)用抑制植物中H2O2積累的DPI進(jìn)行探究。

本試驗(yàn)基于以往的研究, 探究外源一定濃度的茉莉酸甲酯是否能夠增強(qiáng)煙草對低溫的耐受性, 并驗(yàn)證H2O2在MeJA介導(dǎo)的信號中的作用。本研究有助于進(jìn)一步闡明外源MeJA應(yīng)對低溫脅迫的生理機(jī)制, 為MeJA在煙草等作物幼苗中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與處理

通過預(yù)實(shí)驗(yàn)選取“豫煙10號”為供試材料。于2017年4月在河南農(nóng)業(yè)大學(xué)品質(zhì)生態(tài)實(shí)驗(yàn)室采用霍格蘭(Hoagland)營養(yǎng)液為水培育苗, 前期以育苗盤和工字格海綿為介質(zhì), 將種子用10%過氧化氫消毒后均勻地點(diǎn)在海綿中, 待煙草種子露白發(fā)芽后選取長勢一致的幼苗用鑷子移至蛭石中生長。煙草幼苗長至四葉期時(shí)從蛭石中移至水培盒中生長。培養(yǎng)箱晝夜溫度為(28±2)℃/(18±2)℃、光周期為14 h/10 h循環(huán)、相對濕度為70%、光照強(qiáng)度為440 μmol m–2s–1。

煙草幼苗在六葉齡時(shí)對低溫敏感[12], 待煙草幼苗在水培盒中長至六葉一心時(shí), 采用單因素隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì), 選取長勢一致的幼苗進(jìn)行處理。共進(jìn)行2個(gè)不同試驗(yàn)。

試驗(yàn)1: 有６種處理, 每個(gè)處理３次重復(fù), 每個(gè)重復(fù)3株煙苗。以正常溫度處理的煙苗作為陽性對照, 低溫處理(11℃/8℃)的煙苗作為陰性對照, 分別噴施1、10、100和1000 μmol L–1的MeJA預(yù)處理 3 d, 分別標(biāo)記為CK、C0、C1、C10、C100、C1000。預(yù)處理期間保持正常生長溫度, 預(yù)處理結(jié)束后進(jìn)行5 d低溫處理。期間保證每3 d換一次營養(yǎng)液, 每天通氧2 h。在低溫處理的第5 天分別選取兩片真葉測定各生理生化指標(biāo)。本試驗(yàn)旨在探討MeJA誘導(dǎo)煙草耐冷性的生理機(jī)制, 同時(shí)為試驗(yàn)2確定低溫下幼苗生長發(fā)育的最適MeJA處理濃度。

試驗(yàn)2: 共4種處理, 每處理3次重復(fù), 每個(gè)重復(fù)3株煙苗。低溫處理(11℃/8℃)的煙苗為對照, 噴施10 μmol L–1MeJA、5 mmol L–1DPI (二亞苯基碘, NADPH氧化酶抑制劑)和10 μmol L–1MeJA+5 mmol L–1DPI, 保持正常生長溫度預(yù)處理3 d。預(yù)處理結(jié)束后進(jìn)行 5 d的低溫處理。在此生長期間保證每3 d換一次營養(yǎng)液, 每天通氧2 h。在低溫處理的第0、3、5天分別選取兩片真葉測定各生理生化指標(biāo), 以探討H2O2在MeJA誘導(dǎo)煙草幼苗的耐冷性中的作用。

所用試劑MeJA、DPI購于Sigma試劑公司, MeJA純度為95%。

1.2 煙草幼苗鮮重、干重、最大葉面積的測定

在低溫處理的每天測量同一葉的葉長和葉寬, 通過鄭鳳君等[13]的方法計(jì)算葉面積。在處理后的第5 天稱量煙草幼苗的鮮重, 將幼苗以105℃烘箱殺青30 min, 70℃烘48 h至恒重后稱量其干重。

1.3 相對電解質(zhì)滲透率及光合色素含量的測定

參照K?hle等[14]的方法稍加改動(dòng), 使用雷磁DDS-11A電導(dǎo)率儀測定煙草植株自頂點(diǎn)的第2片完全展開葉的相對電解質(zhì)滲透率。將0.5 g待測葉片加入25 mL雙蒸水浸泡24 h, 使用電導(dǎo)率儀測定電解質(zhì)滲透率R1, 通過在沸水浴中煮沸30 min后經(jīng)冷卻測定其電解質(zhì)滲透率R2, 葉片相對電解質(zhì)泄漏率為初始與最終的電導(dǎo)率的百分比。

參照Lichtenthaler和Buschmann[15]的方法加以改進(jìn)測定葉綠素、葉綠素和類胡蘿卜素的含量, 取相同葉位葉片0.2 g, 加入10 mL 80%的丙酮放置黑暗中處理24 h后測定其在665 nm、649 nm、470 nm的吸光值。

1.4 ABA和IAA含量測定

稱取約0.1 g煙草樣本, 在80%乙醇中均質(zhì)化并在4℃浸提過夜。將勻漿以8000′離心10 min, 取上清液, 加0.5 mL試劑二萃取脫色3次, 氮吹儀吹至液面0.5 mL以下。將流動(dòng)相定容至0.5 mL, 以針頭式過濾器過濾于帶有內(nèi)襯管的樣品瓶內(nèi)待測。用HCl將其酸化至pH 2.5, 并用乙醚(有機(jī)物至水相1∶3)分配２次。隨后將ABA和IAA從有機(jī)相轉(zhuǎn)移到1%碳酸氫鈉(pH 7~8; 有機(jī)相與水相的比例為1∶3)中, 用乙醚再萃取, 用重氮甲烷甲基化并使用針對ABA和IAA進(jìn)行免疫測定[16]。

1.5 H2O2、O2–和MDA的含量測定

使用南京建成生物科技有限公司生產(chǎn)的試劑盒檢測H2O2含量; 參照J(rèn)abs等[17]的羥胺氧化法測定超氧陰離子(O2–)的含量。按照Dhindsa和Matowe[18]方法, 使用硫代巴比妥酸(TBA)比色法測定丙二醛(MDA)含量。

1.6 抗氧化酶系統(tǒng)及非酶促系統(tǒng)測定

稱取相同葉位煙草葉片0.5 g, 加入預(yù)冷的5 mL pH為7.8的磷酸緩沖液進(jìn)行冰浴研磨, 并冷凍離心20 min, 上清液即酶活性提取液, 置4℃冰箱低溫保存。按照Pinheiro等[19]的方法測定超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)活性。

將0.5 g葉片在5 mL 5%TCA溶液中均質(zhì)化, 在4℃條件下以12,000′離心20 min。上清液即酶活性提取液。參考Law等[20]的方法測定抗壞血酸(ASA)、還原性谷胱甘肽(GSH)含量。

將0.5 g葉片用2 mL 6%的偏磷酸冰浴中研磨, 在4℃條件下以8000′離心20 min。上清液即酶活性提取液。參考Nakano等[21]的方法測定抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性, 參照Foyer等[22]的方法測定谷胱甘肽還原酶(GR)活性。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

每次測定數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值。采用方差分析(ANOVA)和鄧肯氏多重比較顯示處理之間的差異。使用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 MeJA對低溫下煙草幼苗生長的影響

如表1所示, 暴露于低溫環(huán)境下的煙草幼苗在整個(gè)處理時(shí)期的鮮重干重以及最大葉面積都有顯著的下降趨勢。在低溫處理5 d后, C0處理較CK處理的煙草幼苗地上部和根部的鮮重、干重分別減少了54.82%、65.17%、84.22%、63.00%; 而C10則分別減少了11.52%、28.65%、34.49%、23.33%。相對比下可以發(fā)現(xiàn)10 μmol L–1MeJA能夠有效地促進(jìn)低溫下煙草的生長發(fā)育。并且100 μmol L–1MeJA處理的煙草幼苗也能夠抵御低溫的侵害, 但效果較10 μmol L–1MeJA差; 而濃度為1 μmol L–1和1000 μmol L–1的茉莉酸甲酯緩解效果不顯著(表1)。

圖1顯示的是在低溫處理5 d內(nèi)各處理的最大葉面積的變化。在第１天和第２天各處理的最大葉面積沒有顯著差異, 自第3天開始處理間有顯著性差異, 在第4、第5天處理間差異增大。表現(xiàn)為正常溫度處理的煙草幼苗最大葉面積呈指數(shù)型態(tài)勢增長, 其次是C10、C100處理的煙草幼苗。而C0、C1、C1000處理增量及差異均不顯著。

表1 MeJA對低溫脅迫下煙草幼苗地上部、根部的鮮重和干重的影響

CK: 正常溫度處理; C0: 低溫處理無MeJA噴施; C1: 低溫處理+1 μmol L–1MeJA噴施; C10: 低溫處理+10 μmol L–1MeJA噴施; C100: 低溫處理+100 μmol L–1MeJA噴施; C1000: 低溫處理+1000 μmol L–1MeJA噴施。數(shù)值后不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著。

CK: Normal temperature treatment; CO: Low-temperature treatment without MeJA spray; C1: Low temperature treatment and 1 μmol L–1MeJA spray; C10: Low temperature treatment and 10 μmol L–1MeJA spray; C100: Low temperature treatment and 100 μmol L–1MeJA spray; C1000: Low temperature treatment and 1000 μmol L–1MeJA spray. Values followed by different letters are significantly different at< 0.05.

圖1 低溫處理5 d內(nèi)各處理的最大葉面積

縮寫同表1。圖柱上不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著。

Abbreviations are the same as those given in Table 1. Bar superscripted by different letters are significantly different at< 0.05.

2.2 MeJA對低溫下煙草幼苗相對電導(dǎo)率及光合色素的影響

相對電導(dǎo)率和光合色素是脅迫下體現(xiàn)植物細(xì)胞損傷的重要指標(biāo)。經(jīng)過5 d的處理, 低溫下不同濃度MeJA噴施較正常溫度處理的相對電導(dǎo)率有不同程度的提高, 分別提高了2.66、2.75、0.22、1.11和2.97倍(圖2-A)。即在C10和C100處理下煙草幼苗的相對電導(dǎo)率增長量較其他處理低, 尤其在C10處理下與CK處理的相對電導(dǎo)率無顯著差異。說明在10 μmol L–1和100 μmol L–1MeJA處理下細(xì)胞膜完整性較好。

各處理光合色素含量的變化與相對電導(dǎo)率的變化一致。低溫5 d后各處理的煙草葉片的葉綠素、葉綠素和類胡蘿卜素含量都顯著下降, 其中C10和C100處理下的光合色素維持在較高的含量水平, C10處理在類胡蘿卜素含量上甚至高于CK處理的煙苗, C100處理的類胡蘿卜素含量與CK處理的煙苗無顯著差異(圖2-B)。

圖2 低溫處理5 d后各處理的相對電導(dǎo)率和光合色素含量

縮寫同表1。圖柱上不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著。

Abbreviations are the same as those given in Table 1. Bar superscripted by different letters are significantly different at< 0.05.

2.3 MeJA對低溫下煙草激素含量的影響

圖3表示的是在外源噴施不同濃度的MeJA時(shí), 煙草幼苗細(xì)胞中的ABA和IAA含量。在5 d低溫的處理下, C0處理脫落酸有少許增加, 而生長素顯著下降, 較CK處理下降了37.21%。在茉莉酸甲酯噴施下, C10處理ABA和IAA含量分別是C0的2.83倍和4.83倍?？梢园l(fā)現(xiàn), 低溫下噴施合適濃度的MeJA能夠有效地提高激素含量以應(yīng)對逆境。

圖3 低溫處理5 d后各處理的激素含量

縮寫同表1。圖柱上不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著。

Abbreviations are the same as those given in Table 1. Bar superscripted by different letters are significantly different at< 0.05.

2.4 MeJA對低溫下煙草幼苗抗氧化酶的影響

煙草幼苗隨著遭受低溫脅迫時(shí)間的增長, SOD、CAT活性顯著上升, 而POD顯著下降(圖4), 通過噴施茉莉酸甲酯會(huì)改變煙草幼苗體內(nèi)的的抗氧化酶活性。C1000處理的SOD活性最高, C10處理的POD和CAT活性最高。整體對比下來, C10處理的SOD、POD、CAT較CK處理分別增加了3.39、0.52和2.41倍; C100處理的SOD、POD、CAT較CK處理分別增加了2.98、0.10和1.28倍。很明顯除了SOD在C1000處理時(shí)較高外, C1和C1000處理與C0處理的煙草幼苗的抗氧化酶活性無顯著差異。

圖4 低溫處理5 d后各處理的抗氧化酶系統(tǒng)活性

縮寫同表1。圖柱上不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著。

Abbreviations are the same as those given in Table 1. Bar superscripted by different letters are significantly different at< 0.05.

2.5 DPI對MeJA誘導(dǎo)煙草幼苗耐冷性的影響

在低溫環(huán)境下的第0天, H2O2、O2–和CAT含量在4個(gè)處理中無顯著差異, 在低溫后的第3天差異開始明顯顯現(xiàn)。

低溫處理下的煙草幼苗的H2O2、O2–含量顯著升高, MeJA、DPI以及MeJA+DPI處理的煙草幼苗在處理后第3天含量最高, 第5天較第3天含量低。整體含量都低于低溫脅迫下的煙草幼苗。而CAT呈現(xiàn)出相反的狀態(tài), 低溫處理的煙苗隨著時(shí)間的推移增量較小, 而低溫下施用MeJA、DPI以及MeJA+ DPI的煙草幼苗CAT隨著時(shí)間而不斷增加。CAT在低溫處理組第5天較第3天高7.22%, 較第0天高43.10%; MeJA組第5天較第3天高1.01倍, 較第0天高1.78倍; DPI組第5天較第3天高1.02倍, 較第0天高2.10倍; MeJA+DPI組第5天較第3天高0.97倍, 較第0天高2.28倍?？梢娫诘蜏叵率┯肕eJA、DPI、以及MeJA+DPI都能極大地提高CAT活性, 并且整體看來H2O2、O2–和CAT呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(圖5-A, B, C)。

MDA是已知的逆境條件下重要的脂膜過氧化指標(biāo), 其含量顯示了細(xì)胞膜質(zhì)過氧化程度和植物對逆境反應(yīng)的強(qiáng)弱。通過３個(gè)時(shí)間段檢測４個(gè)處理間煙草的MDA含量發(fā)現(xiàn), 在第0天4個(gè)處理間的MDA沒有顯著差異。在第3天差異開始顯著, 其中低溫處理的MDA含量較第0天增長了4.68倍, 第5天的含量較第0 天增長了7.89倍; MeJA組第3天較第0天高1.32倍, 第5天較第0天高2.12倍; DPI組第3天較第0 天高1.52倍, 第5天較第0天高2.08倍; MeJA+DPI組第3天較第0天高1.27倍, 第5天較第0 天高2.02倍(圖5-D)。這組數(shù)據(jù)說明在低溫脅迫下植物中的MDA含量都會(huì)升高, 而在施用MeJA、DPI和MeJA+DPI時(shí)能夠有效降低MDA的增長量。

2.6 DPI對MeJA誘導(dǎo)的ASA-GSH循環(huán)的影響

由圖6可以發(fā)現(xiàn), 隨著時(shí)間的推移, 在低溫處理下除了APX的活性, 其他含量都表現(xiàn)為先升高后降低; 而施用外源MeJA、DPI以及MeJA+DPI的處理都表現(xiàn)為持續(xù)升高。其中在處理的第0天, 4個(gè)處理的GR、GSH、APX、ASA差異不大, 在處理3 d后低溫下處理與外源施用的各處理含量有顯著差異, 5 d后差異明顯加劇。在抗壞血酸–谷胱甘肽循環(huán)中, APX活性與其他3個(gè)含量的變化趨勢不同, 表現(xiàn)為在脅迫的第0、3、5天4個(gè)處理含量都持續(xù)升高, 并且在脅迫第5 天低溫處理組APX活性高達(dá)5.73 μmol min–1g–1, 是同處理第0、3天的2.69倍和2.35倍。也分別高出同時(shí)期MeJA、DPI以及MeJA+DPI處理41.30%、44.84%和46.50% (圖6-C)。

圖5 低溫下各處理的活性氧、CAT及MDA的含量

圖柱上不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著。

Bar superscripted by different letters are significantly different at< 0.05.

圖6 低溫下各處理的GR、GSH、APX、ASA含量

圖柱上不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著。

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3 討論

近年來由于茉莉酸甲酯參與植物發(fā)育和防御信號傳導(dǎo)而被廣泛關(guān)注。茉莉酸通路受到外界復(fù)雜信號的調(diào)節(jié), 經(jīng)研究發(fā)現(xiàn), 茉莉酸類化合物與其他植物激素信號途徑之間存在調(diào)節(jié)植物響應(yīng)的相互作用, 并能避免多種非生物脅迫的影響[23]。Battal等[24]發(fā)現(xiàn)低溫下施用一定濃度茉莉酸甲酯能夠誘導(dǎo)玉米的生理和分子的變化。Fan等[25]發(fā)現(xiàn)1 μmol L–1的MeJA可通過減少儲(chǔ)存期間的PPO活性來抑制冷害指數(shù)和重量損失來維持采后豇豆的感官品質(zhì)。本試驗(yàn)結(jié)果表明, 10 μmol L–1的MeJA處理煙草幼苗, 通過對內(nèi)源激素水平的調(diào)控和對活性氧的消除機(jī)制, 促進(jìn)了脫落酸和生長素的合成, 增強(qiáng)了細(xì)胞膜的可塑性, 有效提高了煙草幼苗的耐冷性。

在低溫脅迫下煙草有著高敏感特征, 使其幼苗的鮮重、干重和最大葉面積都顯著降低, 煙草的生長受到抑制。冷害隨著時(shí)間的延長對細(xì)胞造成的傷害會(huì)進(jìn)一步加大。通常導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷, 喪失細(xì)胞完整性, 因此細(xì)胞膜通透性、相對電解質(zhì)滲漏和丙二醛含量被用作冷害的定量指標(biāo)[26]。在本研究中發(fā)現(xiàn), MeJA能顯著降低冷害下煙草的相對電導(dǎo)率的指數(shù), 尤其在低溫下噴施10 μmol L–1的MeJA能使葉片受損率減少, 使冷害引起的生長抑制得到緩解, 這表明噴施合適濃度的MeJA能提高煙草幼苗抗低溫脅迫的能力。這與先前關(guān)于用MeJA處理其他植株的報(bào)道一致[27]。

ABA是重要的抗寒信號分子, 并且可以維持種子休眠、調(diào)節(jié)生長[28]。IAA對植物生長發(fā)育起重要作用, 其含量的增加能夠增強(qiáng)細(xì)胞壁的延展性, 增強(qiáng)細(xì)胞受外界的脅迫程度[29]。噴施茉莉酸甲酯能夠促進(jìn)煙草植株體內(nèi)ABA和IAA的合成, 增加植株體內(nèi)抗氧化酶的活性, 減少相對電導(dǎo)率和丙二醛的含量, 增加光合色素的含量。并隨著外源茉莉酸甲酯濃度的升高, 出現(xiàn)了緩解低溫效果的程度先增大后減小的現(xiàn)象, 說明外源茉莉酸甲酯同大部分外源物質(zhì)一樣具有劑量效應(yīng)。在濃度為10 μmol L–1時(shí)緩解低溫最有效。

H2O2在植物中有著較為復(fù)雜的作用。它既可以作為對細(xì)胞具有破壞性的毒性分子又可以作為信號分子發(fā)揮作用, 不同的作用取決于活性氧產(chǎn)生和清除的適當(dāng)位置以及時(shí)間的平衡關(guān)系[30]。早期產(chǎn)生的H2O2可以引發(fā)防御反應(yīng), 而在MeJA誘導(dǎo)煙草抵御低溫時(shí)是否啟動(dòng)了H2O2作為第二信使的傳導(dǎo)途徑不得而知。本試驗(yàn)在確定外源茉莉酸甲酯緩解低溫的最適濃度基礎(chǔ)上, 通過施用抑制H2O2積累的DPI發(fā)現(xiàn), 代表著冷害指標(biāo)的MDA含量較低, CAT活性升高。CAT是抗氧化酶系統(tǒng)中的一部分, 能直接消除H2O2, 這說明低溫下MeJA不需要H2O2進(jìn)行耐冷性的誘導(dǎo), 也可判定低溫下活性氧的積累會(huì)加大細(xì)胞膜等蛋白組分的損害。本試驗(yàn)與Shin外源水楊酸提高菠菜耐凍性[10]的研究結(jié)果不一致, 說明水楊酸和茉莉酸甲酯都作為生長調(diào)節(jié)劑在抗逆的機(jī)理上可能是有差別的。

在分解活性氧的機(jī)制中主要有兩部分, 一是抗氧化酶系統(tǒng)機(jī)制, 包括SOD、POD和CAT; 二是非酶促的抗氧化機(jī)制, 包含ASA、APX、GSH、GR等。植物中的活性氧水平可以通過兩部分的協(xié)同作用被調(diào)節(jié)。保護(hù)酶體系在緩解脅迫方面有重要的作用, SOD是膜保護(hù)的第一層防線, 可以將O2–轉(zhuǎn)化為H2O2, 繼而POD、CAT發(fā)揮作用將H2O2轉(zhuǎn)化為H2O和O2。而在非酶促的抗氧化機(jī)制中, GSH和ASA在維持細(xì)胞氧化還原和抗氧化保護(hù)中發(fā)揮重要作用, GR能通過NADPH將GSSG還原為GSH。GSH是ASA合成關(guān)鍵酶的底物, 在ASA的作用下, APX可以將H2O2還原成水, 從而減少H2O2的含量。試驗(yàn)表明, 在MeJA和DPI的處理下, 與H2O2清除有關(guān)的指標(biāo)CAT含量和ASA-GAH循環(huán)含量都顯著上升, 減輕了低溫對煙草幼苗造成的氧化應(yīng)激。這說明抑制NADPH氧化酶的DPI也能通過提高非酶促抗氧化防御系統(tǒng)的含量來減少H2O2的含量。進(jìn)一步說明H2O2更多的是作為活性氧毒性積累而不是第二信使的身份進(jìn)行信號傳導(dǎo)。

4 結(jié)論

MeJA作為頻繁參與非生物脅迫和病原體防御反應(yīng)的生物相關(guān)組分, 能夠有效地抑制煙草幼苗在低溫脅迫損傷。H2O2并沒有作為第二信使參與由MeJA介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)。MeJA緩解低溫脅迫主要的生理機(jī)制是調(diào)控植株內(nèi)的激素水平和減少活性氧的危害, 其噴施濃度以10 μmol L–1效果最好, 并隨著濃度的變化表現(xiàn)出高抑低促的效果。

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Exogenous MeJA improves cold tolerance of tobacco by inhibiting H2O2accumulation

MA Xiao-Han, ZHANG Jie, ZHANG Huan-Wei, CHEN Biao, WEN Xin-Yi, and XU Zi-Cheng*

College of Tobacco Science, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, Henan, China

Methyl jasmonate (MeJA) is an elicitor evolving in a variety of physiological and biochemical processes. To explore the effects of exogenous MeJA on tobacco seedlings under low temperature conditions, we used the tobacco variety “Yuyan 10” and sprayed four concentrations (1, 10, 100, 1000 μmol L–1) of MeJA for 3 days on plants. Under low temperature with the treatment under normal temperature as positive and that under low temperature on negative control. The growth indicators, relative electrolyte permeability, photosynthetic pigment content, antioxidant enzyme activity and hormone content of each treatment were measured, showing that the treatment with 10 μmol L–1methyl jasmonate could reduce the damage of tobacco seedlings caused by low temperature. The effect of H2O2was then verified by applications of DPI, 10 μmol L–1MeJA, and DPI+MeJA with the same material and growth period, while low temperature treatment was used as a control. The contents of H2O2, O2–, CAT, MDA, and ASA-GSH cycle were determined. In conclusion, H2O2in tobacco plants mainly exists as a poison molecule instead of a second messenger under the treatment of exogenous methyl jasmonate combined with low temperature.

low temperature stress; tobacco seedlings; MetJA; H2O2conduction

2018-07-02;

2018-10-08;

2018-11-07.

10.3724/SP.J.1006.2019.84090

許自成, E-mail: zichengxu@126.com

E-mail: maxiaohan1994@126.com

本研究由中國煙草總公司河南省公司科技攻關(guān)項(xiàng)目(201641170024100, 201641170024099)資助。

This study was supported by the China National Tobacco Corporation’s Henan Provincial Science and Technology Research Project (201641170024100, 201641170024099).

URL: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20181106.1631.005.html