張 陽， 張玲玲，2??， 李若佼， 謝欣冉， 李仰平， 李婉茹， 包振民，2

(1. 中國(guó)海洋大學(xué)海洋生物遺傳學(xué)與育種教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島266003; 2. 海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實(shí)驗(yàn)室，青島海洋科學(xué)與技術(shù)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266237)

FOXL2(Forkhead box L2)是叉頭轉(zhuǎn)錄因子超家族的成員之一，在脊椎動(dòng)物性別決定與分化的過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，主要參與卵巢早期發(fā)育及成體卵巢的功能維持。迄今，已在多個(gè)物種中鑒定了FOXL2基因[1-5]，但較深入的研究主要集中在脊椎動(dòng)物。研究發(fā)現(xiàn)，該基因在大多數(shù)哺乳動(dòng)物的性腺中呈性別二態(tài)性表達(dá)模式。FOXL2在人性別分化前的生殖嵴細(xì)胞中表達(dá)，且在卵巢中特異性表達(dá)[1]。小鼠(Musmusculus)、雞(Gallusgallus)、紅耳龜(Trachemysscripta)的早期卵巢中檢測(cè)到，F(xiàn)OXL2在性別決定前后表達(dá)，推測(cè)該基因參與了卵巢分化[6]。FOXL2缺失突變的XX型小鼠，其性腺表現(xiàn)出精巢特征，表明FOXL2對(duì)成體的卵巢具有維持功能[7]。此外，F(xiàn)OXL2已被確定為山羊(Caprahircus)的雌性決定基因[8]。Oshima等也發(fā)現(xiàn)蛙(Ranarugosa)的FOXL2在卵巢分化的早期階段起著關(guān)鍵作用[9]。在羅非魚(Oreochromisniloticus)中，F(xiàn)OXL2基因在卵巢分化早期到成體持續(xù)表達(dá)，說明該基因參與了魚類性腺分化以及卵巢的功能維持[10]。

雖然在一些無脊椎動(dòng)物中已經(jīng)獲得FOXL2基因，但關(guān)于該基因的研究相對(duì)較少。Zhang等分析了太平洋牡蠣(Crassostreagigas)FOXL2基因在性腺等組織的表達(dá)情況，認(rèn)為該基因可能是牡蠣性別決定的關(guān)鍵基因[11]。在櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)中，F(xiàn)OXL2基因也呈現(xiàn)性別二態(tài)性表達(dá)，推測(cè)其為雌性相關(guān)基因[12]，并可能參與卵巢分化[13]。Li等分析了蝦夷扇貝(Patinopectenyessoensis)的精巢和卵巢轉(zhuǎn)錄組，認(rèn)為FOXL2是蝦夷扇貝性別決定/分化的關(guān)鍵候選基因[14]。珠母貝(Pinctadamargaritifera)的研究也發(fā)現(xiàn)FOXL2在其性反轉(zhuǎn)和性別分化過程中起著重要作用[15]。

由此推測(cè)，F(xiàn)OXL2很可能是跨無脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物類群的保守的雌性決定與分化的關(guān)鍵基因。在脊椎動(dòng)物中，F(xiàn)OXL2主要通過調(diào)控芳香化酶CYP19A1的表達(dá)，決定或維持雌性性別[16-17]；但已有研究顯示，CYP19A1在脊索動(dòng)物才出現(xiàn)[18]，在諸如扇貝之類的無脊椎動(dòng)物并不存在?？梢?，F(xiàn)OXL2性別決定的機(jī)制在脊椎動(dòng)物與無脊椎動(dòng)物之間可能有所不同。該基因在無脊椎動(dòng)物中究竟與哪些蛋白相互作用，如何行使功能，目前尚不清晰。本研究將以蝦夷扇貝為材料，應(yīng)用酵母雙雜交系統(tǒng)初步篩選與FOXL2相互作用的蛋白，為解析無脊椎動(dòng)物FOXL2的性別決定機(jī)制提供思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)材料二齡蝦夷扇貝采自遼寧省大連市獐子島養(yǎng)殖中心，取扇貝性腺組織，液氮固定后保存于-80 ℃冰箱以備提取RNA。蝦夷扇貝酵母雙雜交cDNA文庫和E．coliDH5α由本實(shí)驗(yàn)室保存；酵母菌株Y2HGold和Y187購自Clonetech公司；限制性內(nèi)切酶購自Takara公司；X-α-Gal、Aureobasidin A(AbA)、MatchmakerTMGold Yeast Two-Hybrid System試劑盒和YeastmakerTMYeast Transformation System 2試劑盒及各種酵母缺陷型培養(yǎng)基均購自Clontech公司。

1.2 方法

1.2.1 誘餌質(zhì)粒pGBKT7-FOXL2的構(gòu)建 參考In-Fusion?HD Cloning Kit說明書設(shè)計(jì)蝦夷扇貝FOXL2基因的PCR引物，在FOXL2基因的ORF區(qū)5’端引入一段與線性化載體pGBKT7末端同源的16個(gè)堿基序列，引物序列如下：FOXL2-F：5’-CATGGAGGCCGAATTCATGGCCTTGTCATTTTACGACTCC-3’，F(xiàn)OXL2-R：5’-GCAGGTCGACGGATCCTCACCTCTCTCCCCAGTACGTGTA-3’(下劃線部分為線性載體同源序列)；提取蝦夷扇貝性腺組織RNA，以反轉(zhuǎn)錄的蝦夷扇貝cDNA為模板，高保真DNA擴(kuò)增酶擴(kuò)增FOXL2基因片段，純化PCR產(chǎn)物。利用EcoR Ι和BamH Ι雙酶切空載體pGBKT7并純化。將純化后的目的基因和線性化載體pGBKT7構(gòu)建In-Fusion反應(yīng)體系，50 ℃孵育15 min，然后置于冰上，反應(yīng)液轉(zhuǎn)化E.coliDH5α，于含有卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基37 ℃過夜培養(yǎng)。挑取單克隆，菌液PCR驗(yàn)證，陽性克隆提取質(zhì)粒并測(cè)序。

1.2.2 誘餌蛋白毒性及自激活檢測(cè) 利用YeastmakerTMYeast Transformation System 2試劑盒制備以及轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)。將誘餌質(zhì)粒pGBKT7-FOXL2、空載體pGBKT7分別轉(zhuǎn)化到Y(jié)2HGold感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于SD/-Trp，SD/-Trp/X-α-Gal固體培養(yǎng)基；質(zhì)粒pGBKT7-53和pGADT7-T、質(zhì)粒pGBKT7-Lam和pGADT7-T共轉(zhuǎn)化Y2HGold感受態(tài)作為陽性對(duì)照和陰性對(duì)照，涂布于SD/-Leu/-Trp/X-α-Gal固體培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)3～5 d，觀察酵母菌株的生長(zhǎng)情況，檢測(cè)誘餌蛋白對(duì)酵母菌株是否具有毒性和自激活活性。

1.2.3 蝦夷扇貝酵母雙雜交cDNA文庫滴定實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)室前期已構(gòu)建蝦夷扇貝酵母雙雜交cDNA文庫，將1/100，1/10 000的文庫稀釋液涂布于SD/-Leu固體培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)3～5 d，統(tǒng)計(jì)菌落個(gè)數(shù)，計(jì)算文庫滴度。

1.2.4 酵母雙雜交篩選FOXL2互作蛋白 從SD/-Trp固體培養(yǎng)基挑取2～3 mm的Y2HGold[pGBKT7-FOXL2]新鮮克隆，于50 mL SD/-Trp液體培養(yǎng)基30 ℃過夜培養(yǎng)，至OD600達(dá)0.8。離心，棄上清液，4～5 mL SD/-Trp液體培養(yǎng)基重懸菌體并置于2 L的錐形瓶中，加入1 mL蝦夷扇貝酵母雙雜交cDNA文庫和45 mL含有50 μg/mL卡那霉素的 2×YPDA液體培養(yǎng)基，30 ℃、30～50 r/min培養(yǎng)20～24 h，離心，10 mL含有50 μg/mL卡那霉素的0.5×YPDA液體培養(yǎng)基重懸菌體。各取100 μL 1/10，1/100，1/1 000，1/10 000的稀釋雜交菌液涂布于SD/-Trp、SD/-Leu、SD/-Leu/-Trp固體培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)3～5 d后，統(tǒng)計(jì)各板菌落數(shù)，計(jì)算雜交效率。剩余雜交菌液涂布于SD/-Leu/-Trp/X-α-Gal/AbA固體培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)3～5 d。挑取培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的藍(lán)色單菌落，接種到高篩選強(qiáng)度的SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal/AbA培養(yǎng)基上，進(jìn)一步篩選出藍(lán)色陽性克隆，提取陽性克隆酵母質(zhì)粒，PCR鑒定并測(cè)序。

1.2.5 共轉(zhuǎn)化驗(yàn)證 陽性克隆酵母質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliDH5α，于含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基進(jìn)行選擇培養(yǎng)，提取獵物質(zhì)粒，分別和質(zhì)粒pGBKT7-FOXL2共轉(zhuǎn)化Y2HGold感受態(tài)細(xì)胞，30 ℃培養(yǎng)3～5 d后，觀察酵母菌株的生長(zhǎng)情況。

2 結(jié)果

2.1 誘餌質(zhì)粒pGBKT7-FOXL2的構(gòu)建

根據(jù)蝦夷扇貝FOXL2基因序列和線性化載體pGBKT7序列設(shè)計(jì)特異性引物，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，目的片段大小在1 000～2 000 bp之間，與理論值(1 139 bp)一致(見圖1)。構(gòu)建的誘餌質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliDH5α，陽性克隆進(jìn)行測(cè)序。序列比對(duì)分析確定陽性克隆包含蝦夷扇貝FOXL2基因的ORF框序列，重組的誘餌質(zhì)粒讀碼框無移碼突變，說明誘餌質(zhì)粒pGBKT7-FOXL2構(gòu)建成功。

2.2 誘餌蛋白毒性及自激活檢測(cè)

將誘餌質(zhì)粒pGBKT7-FOXL2、空載體pGBKT7分別轉(zhuǎn)化Y2HGold感受態(tài)細(xì)胞，涂布于SD/-Trp固體培養(yǎng)基。結(jié)果顯示兩者菌落大小相近(見圖2)，說明誘餌蛋白無毒性。將誘餌質(zhì)粒pGBKT7-FOXL2轉(zhuǎn)化Y2HGold感受態(tài)細(xì)胞，涂布于SD/-Trp/X-α-Gal固體培養(yǎng)基，結(jié)果如圖3A所示，誘餌質(zhì)粒pGBKT7-FOXL2轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞在SD/-Trp/X-α-Gal培養(yǎng)基上長(zhǎng)出單菌落但未變藍(lán)。而陽性對(duì)照共轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pGBKT7-53和pGADT7-T的酵母細(xì)胞在SD/-Leu/-Trp/X-α-Gal培養(yǎng)基上生長(zhǎng)且顯藍(lán)色(見圖3B)，陰性對(duì)照共轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pGBKT7-Lam和pGADT7-T的酵母細(xì)胞在SD/-Leu/-Trp/X-α-Gal培養(yǎng)基上生長(zhǎng)但不顯藍(lán)色(見圖3C)。這說明pGBKT7-FOXL2誘餌蛋白不能激活報(bào)告基因MEL1，誘餌蛋白無自激活活性。

(F：FOXL2基因PCR產(chǎn)物；M：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(DL2 000)。F:FOXL2 PCR product; M: DL2 000 DNA marker. )

圖1FOXL2基因PCR產(chǎn)物電泳圖
Fig.1 Electrophoretic result ofFOXL2 PCR product

(A：pGBKT7-FOXL2涂布SD/-Trp培養(yǎng)基；B：pGBKT7涂布SD/-Trp培養(yǎng)基。A: pGBKT7-FOXL2 on SD/-Trp medium; B: pGBKT7 on SD/-Trp medium. )

圖2 誘餌蛋白毒性檢測(cè)
Fig.2 Testing on the toxicity of bait protein

(A：pGBKT7-FOXL2涂布SD/-Trp/X-α-Gal培養(yǎng)基；B：陽性對(duì)照(pGBKT7-53 + pGADT7-T)涂布SD/-Leu/-Trp/X-α-Gal培養(yǎng)基；C：陰性對(duì)照(pGBKT7-Lam + pGADT7-T)涂布SD/-Leu/-Trp/X-α-Gal培養(yǎng)基。A: pGBKT7-FOXL2 on SD/-Trp/X-α-Gal medium; B: positive control (pGBKT7-53 + pGADT7-T) on SD/-Leu/-Trp/X-α-Gal medium; C: negative control (pGBKT7-Lam + pGADT7-T) on SD/-Leu/-Trp/X-α-Gal medium. )

圖3 誘餌蛋白自激活活性檢測(cè)
Fig.3 Testing on the autoactivation of bait protein

2.3 文庫滴定結(jié)果

稀釋104倍的50 μL文庫稀釋液涂布SD/-Leu培養(yǎng)基，獲得約200個(gè)酵母單菌落。根據(jù)滴度計(jì)算公式：滴度=(菌落個(gè)數(shù)/涂板體積mL)×稀釋倍數(shù)，計(jì)算得到文庫滴度為4×107cfu/mL，大于2×107cfu/mL，說明蝦夷扇貝酵母雙雜交cDNA文庫符合酵母雙雜交的滴度要求。

2.4 FOXL2互作蛋白的篩選

酵母雜交菌液涂布后，統(tǒng)計(jì)各培養(yǎng)基平板的菌落個(gè)數(shù)，經(jīng)計(jì)算共篩選的二倍體克隆數(shù)為6×106，雜交效率為7.14%，符合實(shí)驗(yàn)要求。本研究利用酵母雙雜交系統(tǒng)，在SD/-Leu/-Trp/X-α-Gal/AbA固體培養(yǎng)基上篩選出24個(gè)藍(lán)色單菌落，進(jìn)一步在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal/AbA培養(yǎng)基上篩選出17個(gè)藍(lán)色陽性克隆(見圖4)。

提取藍(lán)色陽性克隆酵母質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定(見圖5)，結(jié)果顯示陽性克隆均含有插入片段，片段大小主要集中在750～2 000 bp。陽性克隆酵母質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliDH5α，涂布于含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基后，提取獵物質(zhì)粒，測(cè)序鑒定。測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，驗(yàn)證出12個(gè)讀碼框正確的陽性克隆，共得到4種蝦夷扇貝FOXL2的候選相互作用蛋白，分別是COP9信號(hào)復(fù)合體亞基5、鈉/鉀ATP酶β3、哺乳動(dòng)物室管膜相關(guān)蛋白1和胰脂肪酶相關(guān)蛋白2(見表1)。

圖4 酵母雙雜交篩選陽性克隆結(jié)果圖Fig.4 The positive clones screened by yeast two-hybrid system

圖5 FOXL2篩選的陽性克隆PCR鑒定結(jié)果(部分)Fig.5 Identification of the positive clones by PCR (partial)

候選互作蛋白Candidate interacting proteins登錄號(hào)Accession number克隆個(gè)數(shù)No. of clonesCOP9信號(hào)復(fù)合體亞基5 COP9 signalosome complex sub-unit 5XP_021363137.14鈉/鉀ATP酶β3 sodium/potassium-transporting ATPase subunit beta-3XP_021377712.14哺乳動(dòng)物室管膜相關(guān)蛋白1 mammalian ependymin-related pro-tein 1-likeXP_021339375.13胰脂肪酶相關(guān)蛋白2 pancreatic lipase-related protein 2-likeXP_021367396.11

2.5 共轉(zhuǎn)化驗(yàn)證結(jié)果

將4種互作蛋白的獵物質(zhì)粒分別和質(zhì)粒pGBKT7-FOXL2共轉(zhuǎn)化Y2HGold感受態(tài)細(xì)胞，涂布于SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal/AbA固體培養(yǎng)基。共轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果(見圖6)顯示，培養(yǎng)基上均出現(xiàn)藍(lán)色菌落，說明激活了報(bào)告基因的表達(dá)，驗(yàn)證結(jié)果均為陽性，表明這4種蛋白與蝦夷扇貝FOXL2都可能存在相互作用。

圖6 4種FOXL2互作蛋白的共轉(zhuǎn)化驗(yàn)證Fig.6 Cotransformation analysis between FOXL2 and the four interacting proteins

3 討論

蝦夷扇貝屬于軟體動(dòng)物門(Mollusca)、瓣鰓綱(Lamellibranchia)、珍珠貝目(Pterioida)、扇貝科(Pectenidae)，是具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的海洋貝類。蝦夷扇貝全基因組測(cè)序的完成，為我們提供了一個(gè)全新的視角去探究FOXL2在無脊椎動(dòng)物中的功能。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，與脊椎動(dòng)物相似，F(xiàn)OXL2很可能參與蝦夷扇貝的卵巢發(fā)育和維持。但FOXL2在無脊椎動(dòng)物中的研究較少，對(duì)該基因的功能分析還不夠深入。本研究成功構(gòu)建了重組誘餌質(zhì)粒pGBKT7-FOXL2，且實(shí)驗(yàn)表明誘餌蛋白對(duì)酵母菌株無毒，也無自激活活性，可以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。利用酵母雙雜交系統(tǒng)共篩選出了4種可能與蝦夷扇貝FOXL2的相互作用蛋白，為研究FOXL2基因在蝦夷扇貝中的功能提供了參考。

研究結(jié)果顯示，COP9信號(hào)復(fù)合體亞基5(COP9 signalosome complex subunit 5，CSN5)是FOXL2的候選互作蛋白。COP9信號(hào)復(fù)合體(CSN)由8個(gè)亞基組成，在物種間較為保守[19]。CSN的主要功能是參與去Nedd化(Deneddylation)和磷酸化反應(yīng)，它能使E3泛素連接酶的Cullin去Nedd化，從而調(diào)控Cullin-Ring泛素連接酶的活性。CSN5是COP9信號(hào)復(fù)合體的第五個(gè)亞基，具有催化中心并可以穩(wěn)定的獨(dú)立存在，對(duì)CSN起著關(guān)鍵作用[20]。研究發(fā)現(xiàn)，CSN5的對(duì)應(yīng)蛋白BmJM在家蠶(Bombyxmori)生殖腺的表達(dá)水平較其它組織高，推測(cè)家蠶CSN5蛋白通過參與細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的降解來調(diào)控細(xì)胞增殖發(fā)育過程[21]。Doronkin等發(fā)現(xiàn)果蠅(Drosophilamelanogaster)中CSN5突變阻止Gurken蛋白在卵母細(xì)胞中的積累，說明了CSN5對(duì)卵子發(fā)生的重要性[22]。Smith等利用RNAi干擾秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans)CSN5，發(fā)現(xiàn)F1代線蟲卵子發(fā)生缺陷，導(dǎo)致其性腺變小且缺少卵母細(xì)胞，由此可知CSN5對(duì)線蟲卵子發(fā)生具有關(guān)鍵作用[23]。酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)初步表明CSN5與蝦夷扇貝FOXL2相互作用，鑒于CSN5在細(xì)胞周期和配子發(fā)生中的重要作用，推測(cè)CSN5可能調(diào)控FOXL2蛋白的表達(dá)進(jìn)而影響卵子發(fā)生過程。此外CSN能使一些轉(zhuǎn)錄因子磷酸化，關(guān)于CSN5與FOXL2之間的作用還有待進(jìn)一步研究。

蝦夷扇貝酵母雙雜交結(jié)果顯示FOXL2和胰脂肪酶相關(guān)蛋白(Pancreatic lipase-related protein，PLRP)具有直接的相互作用，這與之前的研究結(jié)果一致。比如，Kim等在扇貝卵巢中獲得了編碼PLRP的基因，RT-PCR結(jié)果顯示該基因在卵巢中高表達(dá)，而在精巢中低表達(dá)，暗示PLRP在扇貝卵母細(xì)胞的成熟和卵黃發(fā)生時(shí)期的脂質(zhì)代謝中發(fā)揮作用[24]。Dheilly等在太平洋牡蠣中篩選得到配子形成早期表達(dá)的雌性特異性基因，其中就包括FOXL2和PLRP[25]。以上研究結(jié)果說明FOXL2和PLRP關(guān)系密切，可能共同參與卵巢發(fā)育過程。

哺乳動(dòng)物室管膜相關(guān)蛋白1(Mammalian ependymin-related protein 1，MERP1)和鈉/鉀ATP酶β3(Sodium/potassium-transporting ATPase subunit beta-3)是扇貝FOXL2的另兩個(gè)互作蛋白。目前室管膜素相關(guān)蛋白的功能尚不清晰，但室管膜素相關(guān)蛋白在成體小鼠卵巢的體細(xì)胞中表達(dá)量較高[26]，這與FOXL2主要在卵巢中表達(dá)這一現(xiàn)象類似，暗示MERP很可能與FOXL2有直接的相互作用。此外，已有研究發(fā)現(xiàn)，鈉/鉀ATP酶是主動(dòng)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)鈉鉀離子的載體蛋白，具有信號(hào)傳導(dǎo)功能，參與調(diào)控基因的表達(dá)及細(xì)胞的生長(zhǎng)[27]。鈉/鉀ATP酶還可能通過腦對(duì)卵巢的激素發(fā)揮調(diào)控作用[28]。由于相關(guān)報(bào)道較少，鈉/鉀ATP酶與FOXL2之間到底有怎樣的聯(lián)系有待進(jìn)一步的研究。