王曉昱 徐興祥

1大連醫(yī)科大學(xué)116041；2蘇北人民醫(yī)院呼吸科，揚(yáng)州225001

肺癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤，其發(fā)病率和病死率分別位居惡性腫瘤排行的第2位和第1位[1]。有研究顯示，肺癌患者5年生存率低于20%[2-3]，其5年生存率與臨床診治及療效監(jiān)測(cè)等密切相關(guān)。而液體活檢作為一種便捷、非入侵性、能夠動(dòng)態(tài)反映腫瘤基因譜全貌的方法，在肺癌精準(zhǔn)醫(yī)療中發(fā)揮著舉足輕重的作用。其中血液循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells，CTCs)檢測(cè)作為開展最早的液體活檢技術(shù)，現(xiàn)已經(jīng)在腫瘤早期診斷、制定個(gè)體化治療策略、預(yù)后判斷以及療效評(píng)估等方面獲得了廣泛應(yīng)用。

1 檢測(cè)CTCs的優(yōu)勢(shì)

1.1 對(duì)肺癌的診斷 目前常用于肺癌檢查的方法主要包括影像學(xué)檢查、血清腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)、組織病理學(xué)檢查等，但這些方法在診斷肺癌以及實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)療效等方面有很明顯的缺陷。通常，影像學(xué)改變?cè)跁r(shí)間上存在一定的滯后性；血清腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)缺乏特異性；組織病理學(xué)檢查則需局部穿刺取材，有時(shí)為明確診斷甚至需反復(fù)多次活檢，而大部分腫瘤患者并不能接受反復(fù)多次穿刺，因此這些方法在早期發(fā)現(xiàn)肺癌方面的能力有限，目前約有67%的肺癌確診時(shí)已為晚期，失去了手術(shù)機(jī)會(huì)[4]。而CTCs相較于上述方法有明顯優(yōu)勢(shì)。(1)早期診斷：CTCs能夠早于影像學(xué)發(fā)現(xiàn)更小的腫瘤[5]； (2)輔助確診：CTCs計(jì)數(shù)可作為輔助診斷指標(biāo)，用來(lái)判斷腫瘤的良惡性； (3)輔助分型分期：近年來(lái)，CTCs檢測(cè)在臨床上的應(yīng)用使其成為了對(duì)TNM傳統(tǒng)分期系統(tǒng)的有效補(bǔ)充[6]，從而可擬定下一步治療方案。

1.2 對(duì)肺癌療效的評(píng)價(jià) 在治療肺癌過(guò)程中，需要全程進(jìn)行療效評(píng)價(jià)，RECIST標(biāo)準(zhǔn)是目前最常用的療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。但是，腫瘤病灶一般在治療后2個(gè)月左右才能出現(xiàn)影像學(xué)檢測(cè)的改變，因此根據(jù)RECIST標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)到的結(jié)果在時(shí)間上存在一定的滯后性[7]。這不利于腫瘤進(jìn)展的早期發(fā)現(xiàn)，還會(huì)影響患者的預(yù)后。而檢測(cè)CTCs有一定的優(yōu)勢(shì)。 (1)快速評(píng)估療效：根據(jù)CTCs數(shù)量判斷治療效果，簡(jiǎn)便、快速、無(wú)創(chuàng)[8]；(2)輔助評(píng)估生存期：CTCs個(gè)數(shù)用來(lái)預(yù)估存活時(shí)間，是一個(gè)較好的量化指標(biāo)； (3)療效實(shí)時(shí)監(jiān)控：實(shí)時(shí)監(jiān)控放化療的療效，根據(jù)CTCs的數(shù)量判斷是否產(chǎn)生耐藥或者轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)，從而有益于及時(shí)調(diào)整用藥。

2 檢測(cè)CTCs計(jì)數(shù)存在的問(wèn)題

雖然CTCs計(jì)數(shù)在臨床上得到了較為廣泛的應(yīng)用，但是CTCs計(jì)數(shù)也存在一定的缺陷。CTCs是一種細(xì)胞，同時(shí)也是一個(gè)高異質(zhì)性的細(xì)胞群，很大一部分進(jìn)入血液中的CTCs會(huì)凋亡，只有很小一部分細(xì)胞能夠幸存并發(fā)生轉(zhuǎn)移，但正是這一小部分具有轉(zhuǎn)移潛能的細(xì)胞是我們最需要關(guān)注的重點(diǎn)。隨著腫瘤的不斷發(fā)生、發(fā)展，CTCs的組成也在不斷變化，故單純檢測(cè)其計(jì)數(shù)已經(jīng)不能準(zhǔn)確反映這種變化。目前，CTCs入血以及血漿清除機(jī)制尚未明了，在收集標(biāo)本時(shí)，各個(gè)環(huán)節(jié) (采血時(shí)間、部位、標(biāo)本儲(chǔ)存等)都會(huì)影響到CTCs計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性。因此，研究者將目光轉(zhuǎn)向了CTCs的生物學(xué)特性研究，該研究進(jìn)一步加深了人們對(duì)CTCs的認(rèn)識(shí)，使人們能夠更加精準(zhǔn)地捕捉和分析CTCs，從而為腫瘤的精準(zhǔn)治療提供更加可靠的診治及預(yù)后判斷的證據(jù)。

3 CTCs生物學(xué)特性

3.1 CTCs的增殖和休眠 大多CTCs在循環(huán)過(guò)程中處于休眠期，在休眠期間還有一部分會(huì)發(fā)生凋亡，因此只有少部分CTCs最終能夠形成轉(zhuǎn)移灶。由于CTCs的半衰期較短暫，僅為1～2.4 h[9]，故CTCs在外周血中的存在依賴于細(xì)胞復(fù)制和凋亡之間的平衡。因此，外周血中的CTCs是以活化和休眠2種狀態(tài)存在，但目前所用的檢測(cè)方法難以將兩者區(qū)分開來(lái)。同樣，對(duì)于是否有CTCs處于分裂期也無(wú)法判斷。若能明確CTCs的狀態(tài)與分期，便能實(shí)現(xiàn)個(gè)體化治療。有研究提示，某些處于活動(dòng)期的CTCs能分泌細(xì)胞角蛋白19和黏蛋白1，可通過(guò)上皮免疫斑點(diǎn)法將其在外周血中檢測(cè)出來(lái)[10]。通過(guò)檢測(cè)CTCs凋亡早期相關(guān)蛋白M30與細(xì)胞角蛋白 (cytokeratin，CK)，進(jìn)一步計(jì)算它們的比值可評(píng)估CTCs中活躍細(xì)胞所占的比例[11]。另有一項(xiàng)研究提示，若檢測(cè)CTCs中Ki-67(Ki-67是一種增殖細(xì)胞相關(guān)的核抗原，其功能與有絲分裂密切相關(guān)，在細(xì)胞增殖中不可缺少，Ki-67標(biāo)記的是處于增殖周期中的細(xì)胞)表達(dá)水平很低或缺失，則提示該類CTCs可能為休眠腫瘤細(xì)胞，無(wú)法進(jìn)入細(xì)胞分裂周期，而該類CTCs因?qū)ΜF(xiàn)有化療藥物應(yīng)答率較低，故可以耐受化療而存活[12]。還有研究發(fā)現(xiàn)，處于休眠狀態(tài)的CTCs在經(jīng)過(guò)若干年后可重新形成轉(zhuǎn)移灶[13]。因此，還需要研究者努力探尋能夠反映CTCs增殖與凋亡的標(biāo)志物，才能更好地制定治療方案。

3.2 發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的CTCs CTCs是由實(shí)體瘤或轉(zhuǎn)移灶釋放入血的腫瘤細(xì)胞。在此過(guò)程中，腫瘤細(xì)胞上皮標(biāo)志物表達(dá)下降，間質(zhì)標(biāo)志物表達(dá)上升，細(xì)胞黏附性丟失、運(yùn)動(dòng)性增強(qiáng)，從而CTCs獲得更強(qiáng)的遷移和侵襲能力，這一現(xiàn)象與EMT密切相關(guān)[14]。而腫瘤細(xì)胞在轉(zhuǎn)移到遠(yuǎn)處器官后，可以發(fā)生間質(zhì)上皮轉(zhuǎn)化，從而再次轉(zhuǎn)變?yōu)樯掀ば螒B(tài)，在器官中定植，形成與原發(fā)腫瘤組織形態(tài)相同的繼發(fā)克隆[15]。有研究表明，EMT在腫瘤的進(jìn)程和轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用。發(fā)生EMT后，上皮細(xì)胞黏附分子E-鈣黏素缺失，間質(zhì)細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記物N-鈣黏素、波形蛋白 (Vimentin)、ZEB1、LEF-1等表達(dá)上調(diào)，上皮細(xì)胞進(jìn)而轉(zhuǎn)變?yōu)榫邆涓鼜?qiáng)的遷移和侵襲能力的間質(zhì)細(xì)胞，繼而參與腫瘤的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及耐藥的過(guò)程[16]。

對(duì)EMT的進(jìn)一步研究[14-15]發(fā)現(xiàn)，完全間質(zhì)型的腫瘤細(xì)胞容易入血但是不容易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。而介于上皮型和間質(zhì)型的腫瘤細(xì)胞可能具有腫瘤干細(xì)胞 (cancer stem cells，CSCs)樣的特征[16]。因此，對(duì)CTCs進(jìn)行上皮和間質(zhì)的分型更有助于認(rèn)識(shí)CTCs的生物學(xué)特性。Yu等[17]對(duì)11例乳腺癌患者CTCs進(jìn)行檢測(cè)及分析后發(fā)現(xiàn)：CTCs可以分為上皮型、間質(zhì)型和上皮-間質(zhì)混合型3種類型，其中以上皮-間質(zhì)混合型居多。不同類型的CTCs在治療過(guò)程中會(huì)發(fā)生變化，治療初期，上皮型向間質(zhì)型轉(zhuǎn)化，該期間治療有效，到了治療后期，間質(zhì)型CTCs逐漸增多，則發(fā)生了耐藥，因此CTCs的上皮型和間質(zhì)型轉(zhuǎn)化可以作為檢測(cè)腫瘤治療過(guò)程中是否發(fā)生耐藥的標(biāo)志物。Liu等[18]報(bào)道稱，乳腺癌CTCs有明顯的上皮樣 (ALDH+)和間質(zhì)樣 (CD24-/CD44+)表型，前者位于更中心位置，后者則位于癌入侵邊緣 (與基質(zhì)的毗鄰處)，間質(zhì)型CTCs具有更強(qiáng)的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。

3.3 具有CSCs特性的CTCs CSCs是一小部分存在于腫瘤組織中的具有自我更新能力及分化潛能的干細(xì)胞性質(zhì)的細(xì)胞亞群，也是導(dǎo)致惡性腫瘤轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)的根本原因[19]。很多研究表明，CSCs持續(xù)存在于腫瘤中，能夠通過(guò)干細(xì)胞的自我更新和向多種細(xì)胞類型分化發(fā)展，在腫瘤發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)和放化療耐藥等方面具有重要作用[20-22]。

CSCs轉(zhuǎn)移能力很強(qiáng)，在血中也更易存活，因而它在CTCs研究中具有更重要的意義。本課題組在前期研究中，利用CK、Vimentin雙標(biāo)進(jìn)行CTCs鑒定，發(fā)現(xiàn)大多陰轉(zhuǎn)的CTCs Vimentin表達(dá)明顯增加，CK陰性、Vimentin陽(yáng)性的CTCs CD133、Oct4表達(dá)陽(yáng)性，從而進(jìn)一步證實(shí)EMT可能參與CTCs CK的陰轉(zhuǎn)，CK陰轉(zhuǎn)的CTCs細(xì)胞干性增強(qiáng)。越來(lái)越多的研究顯示[23-25]，部分CTCs在生物學(xué)特性上具有同CSCs相似的特點(diǎn)，并且少部分CTCs中可檢測(cè)出CSCs標(biāo)志物的表達(dá)[26]。此外，也有研究發(fā)現(xiàn)，在誘導(dǎo)EMT的過(guò)程中可以產(chǎn)生具有CSCs樣特征的CTCs，這類CSCs樣CTCs的自我更新能力和侵襲能力更強(qiáng)，對(duì)藥物也存在更高的耐受性，且更易出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[27]。因此，對(duì)CTCs進(jìn)行生物學(xué)特性研究，從CTCs中尋找出真正能夠形成轉(zhuǎn)移的亞群細(xì)胞，篩選出具有CSCs特性CTCs亞群的標(biāo)志物，將會(huì)十分有利于CTCs的檢測(cè)。

4 小結(jié)及展望

隨著對(duì)CTCs研究的逐步深入，關(guān)于CTCs的研究有助于了解其在肺癌耐藥以及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移等方面的作用，從而為肺癌早期診斷、個(gè)體化治療方案的制定、預(yù)后評(píng)估以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)等提供更可靠的依據(jù)。但是，在CTCs研究的過(guò)程中還存在幾個(gè)問(wèn)題：(1)關(guān)于CTCs生物學(xué)特性變化以及不同CTCs之間在轉(zhuǎn)錄組、基因組、表觀遺傳組的差異的研究較為稀少，這應(yīng)是我們近期研究的重點(diǎn)。(2)目前尚缺乏一種完善的CTCs分離技術(shù)?，F(xiàn)有的技術(shù)或多或少都存在一部分問(wèn)題，例如無(wú)法獲得足量的CTCs、分離出的CTCs純度較低、獲得的CTCs活性被破壞以至于后期無(wú)法進(jìn)行培養(yǎng)、無(wú)法分離出全部類型的CTCs。(3)CTCs富集、分離和鑒定的方法有多種，各種檢測(cè)方法的結(jié)果存在較大差異，這就使所得數(shù)據(jù)很難進(jìn)行比較，臨床也沒(méi)有固定的參考值。因此，需要建立統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)方法和參考值，才能進(jìn)一步比較和研究。相信隨著生物科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，以上問(wèn)題將被一一解決，而關(guān)于CTCs的研究也將不斷深入，繼而更全面地應(yīng)用于臨床實(shí)踐。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突