龔文婷 萬蒞

湖北省婦幼保健院藥劑科,武漢430070

支氣管哮喘(哮喘)是一種發(fā)病機(jī)制復(fù)雜的氣道慢性炎癥性疾病。近年來,其在幼兒群體中,發(fā)病率逐年升高,已引起極大的關(guān)注[1]。研究表明小兒哮喘涉及多種細(xì)胞,尤其與免疫細(xì)胞,氣道上皮細(xì)胞等細(xì)胞之間的互動(dòng)異常有關(guān),其病理生理特性主要表現(xiàn)為氣道高反應(yīng)性(airway hyper-responsiveness,AHR)和氣道黏液的異常高分泌[2]。氣道黏液的正常分泌可維持氣道屏障,維持氣道上皮細(xì)胞功能正常方面發(fā)揮重要作用,但其異常分泌則可能導(dǎo)致哮喘患者氣道阻塞,進(jìn)而導(dǎo)致氣流受限,引起哮喘患者病情加重,甚至引起死亡[3]。

調(diào)控哮喘狀態(tài)下的氣道黏液分泌,可能對哮喘的治療具有重要意義,本文主要從與氣道黏液分泌密切相關(guān)的氣道上皮細(xì)胞分化調(diào)控角度[4],分析其可能干預(yù)環(huán)節(jié),總結(jié)調(diào)控氣道上皮細(xì)胞分化的潛在靶點(diǎn)及藥物,以期為相關(guān)藥物的開發(fā)提供思路[1,4]。

1 哮喘下的氣道杯狀細(xì)胞分化異常

1.1 氣道杯狀細(xì)胞的分化 人氣道上皮是保護(hù)人體呼吸道免受外部刺激損傷的主要屏障。它主要由三種細(xì)胞組成：分別為基底細(xì)胞、纖毛細(xì)胞和分泌細(xì)胞(杯狀細(xì)胞和棒狀細(xì)胞)。其中杯狀細(xì)胞與黏膜下腺體一起分泌MUC5AC 和MUC5B這兩種黏蛋白,進(jìn)而作為氣道黏液的重要組成部分,維持氣道的正常功能[5]。

氣道杯狀細(xì)胞的分化可導(dǎo)致氣道杯狀細(xì)胞數(shù)目增加,同時(shí)可上調(diào)黏蛋白,如MUC5AC和MUC5B的上調(diào),進(jìn)而使氣道中黏液分泌增加,保護(hù)機(jī)體免受外界病毒、細(xì)菌對氣道或肺部的感染[6]。但在某些慢性氣道炎癥狀態(tài)下,其氣道杯狀細(xì)胞表現(xiàn)為異常分化,進(jìn)而使黏蛋白異常分泌與積聚,并隨著時(shí)間的推移增加感染概率及氣道阻塞[4]。

1.2 哮喘與氣道杯狀細(xì)胞分化異常 在幼兒哮喘患者的氣道中,可見平滑肌細(xì)胞增生、杯狀細(xì)胞增生、黏膜下層腺體增生/肥大、上皮細(xì)胞纖維化等細(xì)胞異常病變。這種氣道重塑可造成細(xì)胞的反復(fù)損傷,進(jìn)而導(dǎo)致吸入更多的過敏原和環(huán)境刺激物、感染,進(jìn)而誘導(dǎo)一系列炎癥和免疫異常應(yīng)答。其中氣道杯狀細(xì)胞分化異常是其中的一個(gè)重要病理學(xué)改變[4]。

幼兒哮喘患者體內(nèi),多見與氣道黏液密切相關(guān)的黏蛋白的異常表達(dá)。在正常的氣道黏液中,MUC5B 可以線性排列同時(shí)通過杯狀細(xì)胞分泌的 MUC5AC 進(jìn)行錨定[6],除這些黏蛋白外,還有鹽、脂蛋白等,其中固體含量約為3%左右。而在哮喘患者的黏液中,其固體比例可達(dá)到15%[7]。而固體比例的增加將導(dǎo)致更多的分子間相互作用,并形成更厚、黏性更強(qiáng)的凝膠層。進(jìn)而進(jìn)一步的影響哮喘的疾病進(jìn)程[4,8]。

2 與氣道杯狀細(xì)胞分化密切相關(guān)的信號(hào)通路

氣道杯狀細(xì)胞的分化調(diào)控與多種信號(hào)通路有關(guān),且這些信號(hào)通路間還存在著交互調(diào)控,目前報(bào)道較多的主要有表皮細(xì)胞生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR),Th2型細(xì)胞因子,Notch 通路,信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子6(signal transducers and activators of tranion 6,STAT6)信號(hào)通路以及Wnt信號(hào)通路[8]。

2.1 EGFR EGFR 是與生長密切相關(guān)的多功能受體蛋白,在哮喘模型小鼠的氣道中,可見EGFR 免疫反應(yīng)性與氣道杯狀細(xì)胞的分化增加呈正相關(guān),提示EGFR 參與調(diào)控了氣道杯狀細(xì)胞的分化。EGFR 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)涉及四種細(xì)胞表面受體蛋白(EGFR/ErbB1、ErbB2、ErbB3 和 ErbB4)。多種配體如表皮生長因子[6],轉(zhuǎn)化生長因子α與ErbB受體二聚體結(jié)合,后續(xù)經(jīng)歷構(gòu)象變化,導(dǎo)致激活多種下游蛋白質(zhì)復(fù)合物,包括磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B,絲裂原活化蛋白激酶/細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶等,進(jìn)而調(diào)控氣道穩(wěn)態(tài)。轉(zhuǎn)化生長因子α和表皮細(xì)胞生長因子可由多種炎癥細(xì)胞,如嗜酸粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞分泌。而影響這些炎性細(xì)胞,則會(huì)使EGFR 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)異常,導(dǎo)致哮喘疾病狀態(tài)下的氣道黏液異常分泌[9]。

雖然EGFR 明顯與氣道杯狀細(xì)胞分化有關(guān),但靶向EGFR 的治療方法仍面臨巨大挑戰(zhàn)。EGFR 酪氨酸激酶抑制劑BIBW 2948在臨床試驗(yàn)中未能減少慢性肺阻塞患者氣道黏液量及黏蛋白的表達(dá)。后續(xù)可重點(diǎn)關(guān)注EGFR 下游的信號(hào)通路,或通過調(diào)控相關(guān)信號(hào)通路的互動(dòng)起到相應(yīng)的治療作用[10]。

2.2 Th2型細(xì)胞因子 除EGFR 信號(hào)通路外,許多細(xì)胞因子,如IL-13、IL-4、IL-5和IL-9等[11],有研究表明IL-13可以在許多物種的氣道上皮細(xì)胞中誘導(dǎo)持續(xù)性的氣道杯狀細(xì)胞分化,這可能與IL-13激活EGFR 信號(hào)通路有關(guān),而通過特異性抑制劑拮抗EGFR,可抵消IL-13 誘導(dǎo)的杯狀細(xì)胞分化[12]。

此外IL-4和IL-5亦是黏液誘導(dǎo)劑,特別是在哮喘患者中。另外,IL-4與IL-13表現(xiàn)出高度的結(jié)構(gòu)相似性[13],通過相同的受體復(fù)合物發(fā)出信號(hào)并且兩者共享幾種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。雖然過表達(dá)IL-4和IL-5的小鼠都表現(xiàn)出顯著的杯狀細(xì)胞分化異常,但這些細(xì)胞因子缺乏的小鼠在用腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)進(jìn)行外源性治療后顯示與對照相似的杯狀細(xì)胞分化[11,14]。

2.3 Notch通路 Notch家族由4種(Notch1～4)跨膜受體蛋白組成,與配體結(jié)合后,Notch細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域通過兩次蛋白水解切割釋放事件和轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核以打開/關(guān)閉關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄譜[15]。其中關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄效應(yīng)子為重組信號(hào)結(jié)合蛋白-κJ。Notch信號(hào)通路可抑制氣道上皮中的多纖毛素蛋白和Forkhead Box J1的表達(dá),進(jìn)而抑制纖毛細(xì)胞的分化[16]。

盡管Notch 與肺上皮細(xì)胞命運(yùn)密切相關(guān),但不同的Notch蛋白異構(gòu)體引起的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)效應(yīng)并不一樣[17]。例如,Notch1和Notch2可激活淋巴增強(qiáng)子結(jié)合因子1(lymphoid enhancer-binding factor 1,LEF-1),而Notch3確不能激活LEF-1[18]。最近,Notch2已經(jīng)被鑒定為小鼠肺中炎性細(xì)胞因子驅(qū)動(dòng)的杯狀細(xì)胞化生的關(guān)鍵,且在體外分化的人支氣管上皮細(xì)胞中也觀察到這種效應(yīng)。與此發(fā)現(xiàn)相反,Notch1或Notch3的過表達(dá)已被證明可以驅(qū)動(dòng)在沒有炎性細(xì)胞因子如IL-13的系統(tǒng)中的杯狀細(xì)胞化生[14,17]。

2.4 STAT6信號(hào)通路 STAT6是由IL-13和IL-4選擇性激活的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,其影響多個(gè)靶基因的表達(dá),包括激活后參與杯狀細(xì)胞分化的部分重要基因[19],因此STAT6是細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的中樞介質(zhì)。STAT6 缺陷小鼠在IL-13暴露后不表現(xiàn)出杯狀細(xì)胞的分化,但在STAT6重建后可恢復(fù)。STAT6也顯示在哮喘氣道上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)表現(xiàn)出異常的組蛋白乙?；Ｊ健TAT6 可上調(diào)GATA 結(jié)合蛋白3表達(dá)[20],其與Th2細(xì)胞因子和氣道重塑的產(chǎn)生密切相關(guān)。有趣的是,盡管STAT6 缺陷型小鼠對IL-13刺激不敏感,但它們?nèi)匀荒軌蛟贜otch信號(hào)通路激活后表現(xiàn)出杯狀細(xì)胞分化的異常[4],表明盡管IL-13 介導(dǎo)的杯狀細(xì)胞分化除依賴于STAT6外,還涉及IL-13/STAT6的獨(dú)立途徑[15]。

2.5 Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路 Wnt蛋白及其配體對成人肺部的肺形態(tài)發(fā)生和組織維持至關(guān)重要[14]。Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路主要有經(jīng)典(穩(wěn)定和β-連環(huán)蛋白向細(xì)胞核易位)或非經(jīng)典(β-連環(huán)蛋白非依賴)的兩條信號(hào)通路。在經(jīng)典途徑中,Wnt配體用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄共激活因子β-連環(huán)蛋白在細(xì)胞溶質(zhì)和核內(nèi)的穩(wěn)定表達(dá),進(jìn)而結(jié)合并激活許多下游轉(zhuǎn)錄因子[8],包括眾所周知的LEF-1 和TCF-1/3/4。這受到Wnt配體與卷曲蛋白受體結(jié)合的調(diào)節(jié)[21]。

β-連環(huán)蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是響應(yīng)Wnt配體和其他細(xì)胞外配體介導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞中分化和增殖的關(guān)鍵。在化學(xué)誘導(dǎo)哮喘的甲苯二異氰酸酯模型中,使用端錨聚合酶抑制劑(穩(wěn)定β-連環(huán)蛋白破壞復(fù)合物)或使用β-連環(huán)蛋白/CBP抑制劑ICG-001進(jìn)行治療[12],兩種情況下均顯著降低杯狀細(xì)胞的分化,表明β-連環(huán)蛋白在杯狀細(xì)胞分化中的作用可能是刺激特異性的[22]。

2.6 其他相關(guān)的信號(hào)通路 除了上面列出的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和細(xì)胞因子之外,還有許多新興的候選蛋白和miRNA 也影響氣道上皮細(xì)胞內(nèi)的杯狀細(xì)胞分化。如驅(qū)動(dòng)蛋白家族成員3A 是已知的哮喘易感基因,它可通過氣道上皮細(xì)胞中的Th2介導(dǎo)的途徑調(diào)節(jié)氣道過敏原反應(yīng)。Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2也與杯狀細(xì)胞分化密切相關(guān)[23]。使用Runx相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2的sh RNA 干預(yù)后的小鼠也顯著減少了氣道黏液的產(chǎn)生和改善肺功能。另外miRNA 在影響上皮細(xì)胞分化上的能力也得到越來越多的認(rèn)可。miR125b在哮喘兒童的痰液中顯著降低,尤其是那些患有嗜酸粒細(xì)胞性哮喘的兒童。已顯示miR-125a和miR-125b可直接靶向TNF-α誘導(dǎo)的蛋白3,進(jìn)而影響杯狀細(xì)胞的分化[24]。

3 相關(guān)藥物及治療策略

基于上述分析,我們可以發(fā)現(xiàn)有多重信號(hào)通路可影響杯狀細(xì)胞的分化,進(jìn)而使氣道黏液分泌產(chǎn)生異常,引起哮喘等慢性氣道炎癥反應(yīng)的加重[7]。針對相關(guān)靶點(diǎn)的藥物及可能干預(yù)環(huán)節(jié),我們總結(jié)了以下幾點(diǎn)。但除了這些之外,我們還需要選擇合適的細(xì)胞模型或者動(dòng)物模型,以方便我們進(jìn)行后續(xù)的藥物篩選,靶點(diǎn)確認(rèn),藥效評價(jià)等[10,15]。

3.1 藥物治療 多年來,杯狀細(xì)胞異常分化的癥狀(即黏液分泌過多)而不是調(diào)控杯狀細(xì)胞分化本身構(gòu)成了主要的藥理學(xué)靶點(diǎn)。這導(dǎo)致了針對黏液溶解/黏液調(diào)節(jié)活性的化合物數(shù)量的大量增加。氨溴索、N-乙酰半胱氨酸和碳半胱氨酸是常用的祛痰藥[7],用于治療具有失調(diào)的黏液分泌過多表型的疾病。盡管臨床及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)都已經(jīng)顯示這些藥物可以改善黏膜纖毛清除率并具有一定的抗哮喘效果[25],但它們并不針對黏液失調(diào)的原因,并且通常僅提供晚期改善和癥狀控制[12]。目前已經(jīng)有一些針對杯狀細(xì)胞分化中涉及的關(guān)鍵靶點(diǎn)的相關(guān)藥物,并且已經(jīng)產(chǎn)生了許多治療藥物。

皮質(zhì)類固醇是治療哮喘最常用的處方藥,目前是緩解過敏性哮喘患者氣道炎癥的最有效方法。對于哮喘和COPD 更嚴(yán)重的患者,它們通常是無效的[26]。臨床試驗(yàn)已經(jīng)表明,布地奈德已被證明可顯著降低哮喘患者杯狀細(xì)胞異常分化。此外,皮質(zhì)酮類藥物如地塞米松已被證明可降低哮喘動(dòng)物模型中的MUC5AC 產(chǎn)生和杯狀細(xì)胞的異常分化。然而,單獨(dú)的研究表明,皮質(zhì)類固醇戒斷后,可反彈性的引起杯狀細(xì)胞的異常分化,甚至高過前期的過敏原誘導(dǎo)水平。有研究表明布地奈德治療后[27],人支氣管刷和支氣管內(nèi)活組織檢查中,許多與杯狀細(xì)胞分化相關(guān)的基因,如ErbB4和PI3K/AKT 信號(hào)通路,均受布地奈德影響而上調(diào)。因此,雖然皮質(zhì)類固醇顯然可以有效減少氣道炎癥,但是長期誘導(dǎo)參與杯狀細(xì)胞分化的基因可能會(huì)增加炎癥外持續(xù)性杯狀細(xì)胞分化的可能性[28]。

抗膽堿能藥,特別是噻托溴銨,在抗擊COPD 方面顯示出較好的效果,目前抗膽堿能藥已被批準(zhǔn)作為難以治療的哮喘的附加治療[29]。盡管乙酰膽堿作為調(diào)節(jié)支氣管收縮和黏膜下腺黏液分泌的神經(jīng)遞質(zhì)的作用最為人所知,但最近的研究結(jié)果也支持氣道上皮細(xì)胞分泌的非神經(jīng)元乙酰膽堿的作用[8]。通過噻托溴銨處理可以預(yù)防和逆轉(zhuǎn)由IL-13在人氣道上皮細(xì)胞中有炎癥誘導(dǎo)的杯狀細(xì)胞異常活化[12]。

山萘酚是一種常見的黃酮類化合物,可作為抗氧化劑,已知可阻斷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)。山萘酚減少卵清白蛋白致敏/攻擊小鼠中的嗜酸粒細(xì)胞浸潤和炎癥以及下游黏液細(xì)胞分化。在除了抑制脂多糖誘導(dǎo)的嗜酸粒細(xì)胞趨化蛋白11表達(dá)外,山奈酚還能劑量依賴性地降低TNF-α刺激的細(xì)胞間黏附分子1在上皮細(xì)胞中的表達(dá)和整合素β2 在嗜酸粒細(xì)胞中的表達(dá),從而減弱嗜酸粒細(xì)胞-氣道相互作用。山萘酚被認(rèn)為通過緩和JAK/STAT6信號(hào)通路,最終抑制核因子κB的活化[30]。

包括克拉霉素和雷帕霉素在內(nèi)的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素亦可減輕慢性氣道疾病的癥狀,除了減少氣道高反應(yīng)性、細(xì)胞因子分泌和氣道炎癥之外[31]。在過敏原暴露后,通過大環(huán)內(nèi)酯類抗生素治療后始終觀察到杯狀細(xì)胞數(shù)量的減少?？死顾乜娠@著抑制IL-13 誘導(dǎo)的杯狀細(xì)胞分化。同樣,雷帕霉素已被證明可抑制急性哮喘模型小鼠氣道內(nèi)的黏液細(xì)胞的數(shù)量[7]。

另一類藥物是EGFR 酪氨酸激酶抑制劑吉非替尼。迄今為止,吉非替尼已被確定為杯狀細(xì)胞增生的潛在抑制劑。用吉非替尼預(yù)處理小鼠7 d,可減輕卵清白蛋白誘導(dǎo)的過敏性氣道癥狀和病理,包括杯狀細(xì)胞的異常分化,這種緩解可能是時(shí)間依賴性的。因此,吉非替尼可能更適合作為預(yù)防藥物來治療與過敏性哮喘相關(guān)的過量杯狀細(xì)胞分化[32]。

3.2 單克隆抗體治療 大量的研究表明,單克隆抗體因其靶向性好、特異性高、療效佳而受到人們的廣泛關(guān)注。在多種疾病中,如哮喘和COPD 等的治療中都具有較大的優(yōu)勢。其相對小分子藥物而言,優(yōu)勢主要體現(xiàn)在以下幾點(diǎn)：(1)單克隆抗體具有較好的靶點(diǎn)特異性；(2)它們在分解后不形成有毒代謝物；(3)它們通常具有更長的半衰期。其中最公認(rèn)的治療靶點(diǎn)是結(jié)合并中和IgE,單克隆抗體的嵌合單克隆抗體[33]。奧馬珠單抗是唯一批準(zhǔn)用于治療早發(fā)性嚴(yán)重IgE依賴性哮喘的單克隆抗體,并通過靶向IgE 的高親和力結(jié)構(gòu)域,阻止其與肥大細(xì)胞的相互作用起作用。奧馬珠單還顯著降低哮喘患者體內(nèi)IL-13和外周嗜酸粒細(xì)胞,這對氣道重塑的影響很大,尤其是杯狀細(xì)胞的分化。其他一些靶點(diǎn)還包括IL-13、IL-5Rα和IL-4Rα等[34]。

3.3 利用miRNA 技術(shù)的療法 通過外源性miRNA 的補(bǔ)充,進(jìn)而靶向參與持久性杯狀細(xì)胞異常分化的一些特定蛋白,從而達(dá)到哮喘的治療亦是一個(gè)可行的治療策略[13]。我們把這些外源性的 miRNA 稱為antagomirs。Antagomirs是與特定miRNA 完全互補(bǔ)的小寡核苷酸,已被證明可導(dǎo)致miRNA 的有效降解。實(shí)際上,在小鼠中許多基于antagomir的研究已經(jīng)取得了較好的結(jié)果。例如,哮喘小鼠模型中miR-126和let-7 miRNA 家族的抑制減少了炎癥細(xì)胞的總數(shù),促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生以及MUC5AC 的水平。同樣抑制miR-106a或miR221可減輕哮喘小鼠模型中的炎癥。因此,使用miRNA antagomirs和模擬物不僅可以改善持續(xù)性杯狀細(xì)胞異常分化,還可以改善慢性氣道疾病的其他病理生理學(xué)特征[14]。

目前對于antagomirs的遞送,可以采用氣溶膠遞送,這可以增加氣道上皮對藥物的有效利用,并減少全身遞送帶來的潛在不良反應(yīng)。但在慢性氣道疾病患者中,如哮喘患者中,其氣道黏液層較厚,這對氣溶膠的遞送有一定的影響。我們可以將antagomir分子與黏液溶解氣溶膠性能增強(qiáng)劑(如D-甘露醇)結(jié)合,以增加氣道上皮相互作用并允許其轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞中,此外納米顆粒的吸入技術(shù)亦可解決上述問題[33]。

4 結(jié)論

氣道中黏液的積累是慢性氣道疾病,尤其是小兒哮喘的關(guān)鍵特征。解決慢性氣道疾病期間持續(xù)性的杯狀細(xì)胞分化是消除腔內(nèi)黏液積聚,進(jìn)而引起下游系列病變,對于哮喘的治療至關(guān)重要。目前幾種關(guān)鍵信號(hào)通路的失調(diào)可導(dǎo)致哮喘疾病狀態(tài)下的持續(xù)性杯狀細(xì)胞分化異常,如EGFR 信號(hào)通路,IL-13、IL-4、IL-5和IL-9,Notch,WNT/β-連環(huán)蛋白,STAT6等。而針對上述靶點(diǎn)的治療策略,如相關(guān)藥物、相關(guān)的單克隆抗體、miRNA 等都可以有效緩解杯狀細(xì)胞的異常分化,進(jìn)而改善哮喘的相關(guān)癥狀。后續(xù)仍需重點(diǎn)關(guān)注相關(guān)動(dòng)物模型,人源化的細(xì)胞模型等來進(jìn)行相關(guān)藥物的開發(fā),從而為滿足小兒哮喘的治療提供保障。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突