李子微 鄧仲良

（南華大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，衡陽(yáng) 417000）

土拉弗朗西斯氏菌（Francisella tularensis）是一種革蘭氏陰性菌，可引起急性、感染性人畜共患疾?。?-2］。野兔和鼠類(lèi)為主要傳染源，蜱蟲(chóng)為主要傳播媒介。土拉弗朗西斯氏菌有4個(gè)亞種［3］，其中A型土拉熱亞種毒力最強(qiáng)［4］，在缺乏抗生素治療的情況下，感染10個(gè)細(xì)菌可引發(fā)急性的、甚至致命的病癥［5］，臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、黃瘟等，嚴(yán)重者死亡。其傳播途徑多樣，易擴(kuò)散、毒性強(qiáng)、病死率高，被美國(guó)預(yù)防與疾控控制中心列為A類(lèi)生物恐怖制劑［6］。40年前，在我國(guó)新疆、黑龍江和內(nèi)蒙古曾有“野兔熱”的報(bào)道［7］。

土拉弗朗西斯氏菌生長(zhǎng)十分緩慢且可經(jīng)氣溶膠傳播，采用細(xì)菌培養(yǎng)的方法檢測(cè)診斷難度較大，同時(shí)，土拉弗朗西斯氏菌易與變形桿菌、鼠疫耶爾森氏菌菌產(chǎn)生血清學(xué)交叉反應(yīng)。目前，土拉弗朗西斯氏菌病早期的核酸快速檢測(cè)方法有普通PCR、Realtime PCR等，需借助大型儀器，且不適合現(xiàn)場(chǎng)實(shí)時(shí)檢測(cè)和基層的推廣。近年來(lái)尋求對(duì)土拉弗朗西斯氏菌進(jìn)行快速、準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)便的檢測(cè)技術(shù)一直是相關(guān)研究的熱點(diǎn)。2000年，Notomi等［8］發(fā)明了一種新型的核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)-環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP），利用具有鏈置換活性的BstDNA 聚合酶（Bst DNA polymerase）提供反應(yīng)的動(dòng)力，在65℃條件下反應(yīng)15-60 min，能將目標(biāo)片段可以擴(kuò)增到1010倍左右，反應(yīng)結(jié)果可通過(guò)反應(yīng)副產(chǎn)物焦磷酸鎂白色沉淀的混濁度來(lái)判定［9-11］。該方法規(guī)避了常規(guī)PCR反應(yīng)的變性、退火、延伸等一系列復(fù)雜的過(guò)程，大大節(jié)省了反應(yīng)時(shí)間和成本，且同時(shí)具有高特異性、高靈敏度、高效簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，為臨床和現(xiàn)場(chǎng)一線的快速檢測(cè)提供可能。自開(kāi)發(fā)以來(lái)，LAMP技術(shù)已被應(yīng)用于對(duì)細(xì)菌、病毒、寄生蟲(chóng)的檢測(cè)和動(dòng)物胚胎性別鑒定等領(lǐng)域［12］。

目前，國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)LAMP方法檢測(cè)土拉弗朗西斯氏菌的報(bào)道，本研究根據(jù)土拉弗朗西斯氏菌FopA基因片段設(shè)計(jì)LAMP引物［13］，對(duì)土拉弗朗西斯氏菌進(jìn)行檢測(cè)，優(yōu)化反應(yīng)條件，驗(yàn)證特異性和靈敏度，并應(yīng)用于土壤模擬樣品的直接檢測(cè)，建立針對(duì)土拉弗朗西斯氏菌的LAMP快速檢測(cè)方法。本研究對(duì)于防止野兔熱的暴發(fā)流行，防范公共安全事件均具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 土拉弗朗西斯氏菌、布魯氏菌、鼠疫耶爾森氏菌和蜱DNA由中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所提供；副溶血性弧菌、大腸桿菌（Escherichia coli）O157型、單增李斯特氏菌、沙門(mén)氏桿菌、金黃色葡萄球菌、聚合擬桿菌、脆弱擬桿菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌由北京熱景生物技術(shù)股份有限公司提供。

1.1.2 主要試劑與儀器 BstDNA聚合酶大片段（New England Biolabs）；細(xì)菌純培養(yǎng)物DNA提取試劑盒（北京開(kāi)景基因技術(shù)有限公司）；betaine（Sigmaaldrich）；D30核酸蛋白測(cè)定儀（艾本德中國(guó)有限公司）；XMTD-6000電熱恒溫水浴鍋（北京市長(zhǎng)風(fēng)儀器儀表公司）；DYY-8C型電泳儀（北京市六一儀器廠）；質(zhì)粒提取試劑盒（天根生化科技有限公司，北京）。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)土拉弗朗西斯氏 菌FopA基 因 序 列（GenBank accession no.：HM371345.1），利用軟件PrimerExplorer V5（日本榮研化學(xué)株式會(huì)社）設(shè)計(jì)特異的LAMP引物，引物由北京梓熙生物科技有限公司合成，序列如表1所示。

表1 擴(kuò)增土拉弗朗西斯氏菌FopA基因的LAMP引物序列

1.2.2 DNA模板的制備

1.2.2.1 試劑盒法 按照試劑盒說(shuō)明書(shū)提取細(xì)菌純培養(yǎng)物DNA。

1.2.2.2 煮沸法 吸取細(xì)菌培養(yǎng)液1 mL，沸水浴中煮沸10 min，10 000×g離心3 min，上清液作為擴(kuò)增模板。

1.2.3 LAMP反應(yīng)體系的配制 10×Thermopol buffer（1 μL），1.8 mmol MgSO4，0.24 mmol dNTPs Mix，10 mmol Betaine，1 pmol F3，1 pmol B3，6 pmol FIP，6 pmol BIP，4 pmol LB，128 U/mL Bst DNA Polymerase，H2O補(bǔ)足至10 μL，模板（2 μL），混勻；同時(shí)，采用滅菌水為模板（2 μL）作為陰性對(duì)照，混勻。迅速置于65℃恒溫水浴鍋，反應(yīng)60 min，80℃滅活5 min，終止反應(yīng)。肉眼觀察反應(yīng)體系的濁度，產(chǎn)物于2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析。

1.2.4 LAMP反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的優(yōu)化 （1）反應(yīng)溫度：分別于59℃、61℃、63℃、65℃、67℃、68℃反應(yīng)60 min，確定最佳反應(yīng)溫度。（2）外內(nèi)引物對(duì)比例：選擇外引物與內(nèi)引物比例依次為1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10進(jìn)行擴(kuò)增，確定最佳比例關(guān)系。（3）Mg2+濃度：選擇Mg2+濃度依次為2、2.5、3、3.5和4 mmol/L進(jìn)行擴(kuò)增，確定Mg2+的最佳濃度。（4）甜菜堿濃度：選擇甜菜堿濃度依次為8、9、10、11、12、13、14和15 mmol/L進(jìn)行擴(kuò)增，確定甜菜堿的最佳濃度。（5）dNTPs濃度：選擇dNTPs濃度依次為4、6、10、14、16和18 mmol/L進(jìn)行擴(kuò)增，確定dNTPs的最佳濃度。

1.2.5 特異性實(shí)驗(yàn) 采用建立的LAMP方法分別對(duì)土拉弗朗西斯氏菌、布魯氏菌、鼠疫耶爾森氏菌、副溶血性弧菌、O157型大腸桿菌、單增李斯特氏菌、沙門(mén)氏桿菌、金黃色葡萄球菌、聚合擬桿菌、脆弱擬桿菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌和蜱的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，電泳觀察擴(kuò)增結(jié)果，驗(yàn)證方法的特異性。

1.2.6 靈敏度實(shí)驗(yàn)

1.2.6.1 細(xì)菌純培養(yǎng)物檢測(cè)靈敏度 提取過(guò)夜培養(yǎng)的土拉弗朗西斯氏菌菌液DNA，10倍倍比稀釋至4.9×10-4.9×108pg/mL，分別取2 μL作為反應(yīng)模板，進(jìn)行LAMP擴(kuò)增。

1.2.6.2 克隆質(zhì)粒檢測(cè)靈敏度 提取土拉弗朗西斯氏菌克隆株質(zhì)粒DNA，10倍倍比稀釋至1×10-1×109copies/μL，分別取2 μL作為反應(yīng)模板，進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，同時(shí)與普通PCR方法進(jìn)行比較分析。

1.2.7 污染土壤模擬樣品實(shí)驗(yàn) 采用10倍倍比稀釋的土拉弗朗西斯氏菌克隆菌株懸液污染土壤，4℃過(guò)夜后，經(jīng)煮沸法提取DNA，通過(guò)熒光定量PCR和LAMP對(duì)比檢測(cè)，比較分析該方法的準(zhǔn)確率和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

2 結(jié)果

2.1 LAMP反應(yīng)條件的優(yōu)化

從圖1可以看出，在擴(kuò)增溫度為65℃（圖1-A）、外引物與內(nèi)引物比例為1∶6（圖1-B）、Mg2+濃度為2.5 mmol/L（圖1-C）、甜菜堿濃度為9-10 mmol/L（圖1-D）、dNTPs濃度為10 mmol/L（圖 1-E）時(shí)，土拉弗朗西斯氏菌DNA的擴(kuò)增效果較好，由此確定反應(yīng)體系。

A：反應(yīng)溫度優(yōu)化結(jié)果：M：100 bp marker；1：59℃；2：61℃；3：63℃；4：65℃；5：67℃；6：69℃；7：陰性對(duì)照。B：外內(nèi)引物對(duì)比例優(yōu)化結(jié)果：M：100 bp marker；1∶1∶2；2∶1∶4；3∶1∶6；4∶1∶8；5∶1∶10；6：陰性對(duì)照。C：Mg2+濃度優(yōu)化結(jié)果：M：100 bp marker；1：2 mmol/L；2：2.5 mmol/L；3：3 mmol/L；4：3.5 mmol/L；5：4 mmol/L；6：陰性對(duì)照。D：甜菜堿濃度優(yōu)化：M：100 bp marker；1：8 mmol/L；2：9 mmol/L；3：10 mmol/L；4：11 mmol/L；5：12 mmol/L；6：13 mmol/L；7：14 mmol/L；8：15 mmol/L；9：陰性對(duì)照。E：dNTPs濃度優(yōu)化結(jié)果 M：100 bp marker；1：4 mmol/L；2：6 mmol/L；3：10 mmol/L；4：14 mmol/L；5：16 mmol/L；6：18 mmol/L；7：陰性對(duì)照

2.2 特異性試驗(yàn)

特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖2）顯示，僅土拉弗朗西斯氏菌純培養(yǎng)物DNA出現(xiàn)了LAMP反應(yīng)特有的階梯狀條帶，其他11株非土拉弗朗西斯氏菌DNA和蜱的DNA均未出現(xiàn)階梯狀條帶。

2.3 靈敏度實(shí)驗(yàn)

根據(jù)土拉弗朗西斯氏菌的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)土拉弗朗西斯氏菌純培養(yǎng)物、土拉弗朗西斯氏菌克隆質(zhì)粒進(jìn)行LAMP靈敏度檢測(cè)，同時(shí)對(duì)土拉弗朗西斯氏菌克隆質(zhì)粒進(jìn)行PCR靈敏度檢測(cè)，由圖3可知，LAMP檢測(cè)土拉弗朗西斯氏菌純培養(yǎng)物靈敏度為4.9×102pg/mL（圖3-A）；LAMP檢測(cè)土拉弗朗西斯氏菌克隆質(zhì)?？蛇_(dá)到8 copies/μL（圖3-B），高于PCR檢測(cè)靈敏度103copies/μL（圖3-C）。

圖2 LAMP特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖3 LAMP靈敏度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4 土壤模擬樣品檢測(cè)

圖4顯示，對(duì)土壤模擬樣本LAMP檢測(cè)結(jié)果與預(yù)期完全一致，且與行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)認(rèn)可的熒光定量PCR方法的檢測(cè)結(jié)果相吻合，無(wú)假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果出現(xiàn)，說(shuō)明該方法具有良好的特異性和實(shí)用價(jià)值。

圖4 24份不同稀釋度土壤模擬樣本電泳圖

3 討論

土拉菌致病性強(qiáng)，致死率高，長(zhǎng)期以來(lái)一直被視為危險(xiǎn)的生物武器，與鼠疫、炭疽等被列為A類(lèi)生物恐怖戰(zhàn)劑，其嚴(yán)重的危害性引起了人們的高度關(guān)注，已成為反恐和世界衛(wèi)生安全的重要問(wèn)題之一。

FopA蛋白是的土拉弗朗西斯氏菌外膜蛋白之一，特異性強(qiáng)、保守性好，并具有良好的抗原性?；颊咴诨謴?fù)期，血清中仍然存在抗FopA抗體，由土拉弗朗西斯氏菌FopA基因編碼，其高度保守性使其適用于土拉弗朗西斯氏菌的核酸診斷。因此，本研究選擇土拉弗朗西斯氏菌FopA基因?yàn)榘谢蚪AMP檢測(cè)方法。本研究針對(duì)土拉弗朗西斯氏菌FopA基因設(shè)計(jì)一套LAMP引物進(jìn)行核酸擴(kuò)增，通過(guò)電泳分析法優(yōu)化反應(yīng)條件，并驗(yàn)證其特異性、靈敏度，建立了簡(jiǎn)便、靈敏、快速，可特異性檢測(cè)土拉弗朗西斯氏菌的方法。在研究過(guò)程中，采用優(yōu)化后的LAMP方法和熒光定量PCR技術(shù)分別土拉弗朗西斯氏菌的基因組DNA進(jìn)行核酸擴(kuò)增，結(jié)果顯示明顯的陽(yáng)性擴(kuò)增；而對(duì)鼠疫耶爾森氏菌、布魯氏菌、大腸桿菌等11種標(biāo)準(zhǔn)菌株的基因組DNA和蜱蟲(chóng)DNA進(jìn)行核酸擴(kuò)增，均未出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。靈敏度測(cè)試采用了土拉弗朗西斯氏菌基因組DNA和克隆株質(zhì)粒進(jìn)行同時(shí)確定，從土拉弗朗西斯氏菌活菌中提取的土拉弗朗西斯氏菌基因組DNA保證了靈敏度實(shí)驗(yàn)的可靠性，為了避免活菌細(xì)胞裂解不完全，影響靈敏度檢測(cè)結(jié)果，采用構(gòu)建質(zhì)粒的方式進(jìn)一步精確計(jì)算靈敏度。LAMP檢測(cè)土拉弗朗西斯氏菌克隆質(zhì)粒的靈敏度為10 copies/μL，達(dá)到文獻(xiàn)報(bào)道的應(yīng)用TaqMan熒光定量PCR檢測(cè)土拉弗朗西斯氏菌［14］的靈敏度。此外，LAMP檢測(cè)土拉弗朗西斯氏菌的基因組DNA靈敏度為490 pg/mL。土壤資源是生態(tài)基礎(chǔ)中非常重要的部分，也是各種生物生存發(fā)展的基礎(chǔ)；土壤環(huán)境中存在成千上萬(wàn)種微生物，環(huán)境復(fù)雜，土拉弗朗西斯氏菌的檢測(cè)易受土壤環(huán)境中其他微生物和其他物質(zhì)的干擾。優(yōu)化后的LAMP技術(shù)可直接對(duì)土壤中的土拉弗朗西斯氏菌進(jìn)行檢測(cè)，且檢出限達(dá)44 CFU/g，低于TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR快速檢測(cè)土壤樣本中土拉弗朗西斯氏菌［14］的檢出限440 CFU/g，驗(yàn)證了LAMP技術(shù)檢測(cè)土拉弗朗西斯氏菌的實(shí)用價(jià)值。

LAMP技術(shù)檢測(cè)土拉弗朗西斯氏菌不僅僅有特異性強(qiáng)、靈敏度高的特點(diǎn)，與傳統(tǒng)方法相比，還大大減少了檢測(cè)周期，擴(kuò)增反應(yīng)在15-60 min即可判斷結(jié)果，環(huán)引物的加入進(jìn)一步提高了反應(yīng)速度，縮短了檢測(cè)時(shí)間；反應(yīng)在恒溫條件下進(jìn)行，對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)備無(wú)特殊要求，僅需要恒溫加熱裝置即可。此外，由于LAMP獨(dú)特的核酸擴(kuò)增機(jī)制，其產(chǎn)物是由多重復(fù)靶序列的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)狀DNA和花椰菜狀DNA所組成的混合物，在瓊脂糖凝膠電泳上呈現(xiàn)特有的的階梯狀條帶，結(jié)果易判斷；LAMP技術(shù)的擴(kuò)增效率極高，在反應(yīng)過(guò)程中，合成大量核酸，從dNTPs析出焦磷酸根離子，與反應(yīng)體系中添加的鎂離子結(jié)合，產(chǎn)生副產(chǎn)物焦磷酸鎂白色沉淀，也可直接肉眼觀察或通過(guò)濁度計(jì)檢測(cè)，這是判斷目的基因是否存在最直接的參照方式。

綜上所述，此次研究建立的針對(duì)土拉弗朗西斯氏菌的LAMP檢測(cè)技術(shù)具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、簡(jiǎn)便高效等特點(diǎn)，為土拉弗朗西斯氏菌的快速檢測(cè)提供了新的發(fā)展方向，有望成為常規(guī)的快速檢測(cè)手段，可滿足基層實(shí)驗(yàn)室、應(yīng)急檢測(cè)和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)等方面的使用需求，具有良好的應(yīng)用價(jià)值和發(fā)展前景。但由于LAMP檢測(cè)技術(shù)建立的時(shí)間不長(zhǎng)，依然存在有不足之處：檢測(cè)結(jié)果只有陽(yáng)性與陰性?xún)煞N，只能定性不能定量，一旦產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增，不易鑒別；設(shè)計(jì)土拉弗朗西斯氏菌的LAMP引物時(shí)，采用了5條引物，且在恒溫條件下進(jìn)行擴(kuò)增，引物之間可能形成互補(bǔ)而擴(kuò)增出非特異性的條帶，造成假陽(yáng)性；LAMP擴(kuò)增效率極高，過(guò)于靈敏和產(chǎn)物量大，實(shí)驗(yàn)室一旦遭到擴(kuò)增產(chǎn)物氣溶膠污染，易出現(xiàn)假陽(yáng)性。為了減少污染，確保檢測(cè)結(jié)果的可信度，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，將試劑配制操作、陽(yáng)性樣本加樣操作、水浴鍋反應(yīng)操作分別在不同的封閉實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行；將反應(yīng)混合物加入反應(yīng)管后，用封口膜封閉管口，防止擴(kuò)增產(chǎn)物污染實(shí)驗(yàn)室氣體環(huán)境；試劑和引物進(jìn)行小瓶分裝使用，并于低溫條件下密封保存。這些措施均充分保證了檢測(cè)結(jié)果的可靠性。

4 結(jié)論

針對(duì)土拉弗朗西斯氏菌FopA基因設(shè)計(jì)引物并建立環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，并應(yīng)用于土壤模擬樣本的檢測(cè)，結(jié)果表現(xiàn)出特異性強(qiáng)、靈敏度高、速度快且設(shè)備要求簡(jiǎn)單等特點(diǎn)。