賴博文 劉玢 梁永康

（南昌市食品藥品檢驗所，南昌 330038）

隨著人們生活水平日益提高，當(dāng)下食品消費不僅滿足人們的營養(yǎng)和能量供給，多樣化的食品選擇還能有效提升生活幸福感。高附加值食品如有機(jī)食品、認(rèn)可度高的品牌、有產(chǎn)地保護(hù)標(biāo)簽的食品意味著能賣出更高的價格［1］。同類食品價格懸殊較大，這也讓造假者有機(jī)可乘，掛羊頭賣狗肉，以次充好，冒充原產(chǎn)地食品的報道屢見不鮮，馬肉冒充牛肉、葉綠素銅摻假大豆油冒充橄欖油，再到近期麥盧卡蜂蜜，摻假和貼牌“原產(chǎn)地”的食品充斥著市場，同時食品造假也存著過敏源的隱患，讓消費者利益受到損害。這些食品造假屬于以經(jīng)濟(jì)利益為驅(qū)動的食品欺詐，是目前影響及破壞食品安全秩序的重要因素之一［2］。

目前針對這類食品造假的甄別，已開發(fā)了很多方法，如DNA鑒定、蛋白鑒定、元素鑒定、同位素質(zhì)譜及拉曼光譜等，而這些鑒別方法主要針對已知造假方式的某些靶標(biāo)化合物進(jìn)行檢測，或者只對原料的物種進(jìn)行鑒定，難以有效鑒別當(dāng)今原料的稀釋、替代等多種造假方式，如造假者可以就食品中的特征標(biāo)志物進(jìn)行合成額外添加以應(yīng)對單一化合物鑒別從而達(dá)到牟取暴力的目的，或者在原料中摻入相似原料以達(dá)到造假目的，諸如此類，造假方式的多樣化，為食品造假鑒定帶來了巨大的挑戰(zhàn)。相比較其他農(nóng)殘獸殘等有害物的靶向篩查，食品造假檢測需要對未知的造假模式進(jìn)行監(jiān)督和預(yù)防，近年來，隨著高分辨質(zhì)譜技術(shù)的成熟和普及，在食品中也相應(yīng)開發(fā)了非靶向代謝組學(xué)的鑒定手段，本文就近幾年基于高分辨質(zhì)譜（High resolution mass spectrometry，HRMS）的非靶向代謝組學(xué)（Non-targeted metabolomics，NTM）在食品造假鑒定中的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，旨在對食品檢測中代謝組學(xué)的最新研究進(jìn)展進(jìn)行總結(jié)和歸納。

1 食品造假鑒定的范疇

食品造假自古以來就存在，并且在全球范圍里廣泛存在，隨著各國食品安全立法對食品造假行為的逐步打擊，食品造假事件有所減少，但隨著科學(xué)技術(shù)和化學(xué)工業(yè)的更新變化，食品造假的形式和內(nèi)容趨于越來越復(fù)雜，造假手段的隱蔽性、可變性的不可預(yù)知性均給食品造假鑒定帶來了很大的困難。造假者在施行造假行為時，其造假方式他人很難了解或者掌握，如我國2008年三聚氰胺奶粉事故是由于發(fā)現(xiàn)很多嬰幼兒消費者患上腎結(jié)石，隨后才發(fā)現(xiàn)奶制品中含有三聚氰胺［3］。而造假者對現(xiàn)有法律法規(guī)尚未涉及或者無法涉及的漏洞或者盲點進(jìn)行造假，這種有針對性的造假手段給食品安全監(jiān)管也帶來很大的困難。

目前食品造假主要包括兩個類型［4-5］：一是摻假或替換，即食品中摻入一些造假成分，以次充好和以假亂真，以劣質(zhì)原料、產(chǎn)品成分代替高品質(zhì)原料或產(chǎn)品成分，如在牛奶中摻入三聚氰胺、羊肉中添加鴨肉成分、陳茶葉充新茶葉、變質(zhì)腐敗的牛奶混入鮮奶、蜂蜜中加水等，是最常見的造假方式；二是信息的虛報或欺騙，廠商隱瞞食品原料或產(chǎn)品中的某種質(zhì)量缺陷，或者為提高產(chǎn)品質(zhì)量，添加未知的或未申報過的成分，包括虛報食品、食品成分、食品包裝，或?qū)δ钞a(chǎn)品進(jìn)行欺騙或誤導(dǎo)性的描述，這類造假類型在保健食品中尤為嚴(yán)重［6］。據(jù)以往統(tǒng)計，水產(chǎn)品食品造假案例最多，占比20.6%；其次是肉制品（13.4%）、水果和蔬菜（10.4%）［5］。

2 高分辨質(zhì)譜在代謝組學(xué)中的應(yīng)用

高分辨質(zhì)譜屬于代謝組學(xué)中的一種較為新型的技術(shù)手段，代謝組學(xué)是由英國倫敦大學(xué)帝國學(xué)院的Nicholson［7］教授于1999年首先提出來的概念，是繼基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)之后新興發(fā)展起來的一門學(xué)科，相比較基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)分別從基因、基因調(diào)控和蛋白質(zhì)層面探尋生命活動，代謝組學(xué)可以直接檢測某一時刻生物體內(nèi)的代謝產(chǎn)物，能實時直接反映該生物體所處狀態(tài)，對代謝產(chǎn)物進(jìn)行定性定量分析，分析研究的對象是相對分子量在1 kD以內(nèi)的小分子代謝產(chǎn)物。代謝組學(xué)研究又可以分為靶向代謝組學(xué)和非靶向代謝組學(xué)，靶向代謝組學(xué)主要是測定某個或幾個或一類已知目標(biāo)化合物，非靶向代謝組學(xué)主要包括測定限定條件下的特定生物樣品中所有代謝組分，后者主要原則是盡可能多地定性和相對定量生物體內(nèi)代謝物，最大程度反映總的代謝物信息。目前常應(yīng)用于代謝組學(xué)化學(xué)計量分析儀器主要有色譜質(zhì)譜聯(lián)用和核磁共振（Nuclear magnetic resonance，NMR）兩種，其中核磁共振樣品前處理簡單，不會破壞樣品結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，可進(jìn)行實時檢測，但靈敏度較差，且多種內(nèi)源性代謝物譜峰容易重疊，影響了對代謝物的定性定量分析，目前還是以色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)為代謝組學(xué)主要技術(shù)手段。

受前處理方法和儀器設(shè)備的限制，我國現(xiàn)有的食品檢測標(biāo)準(zhǔn)基本上都是基于靶向代謝組學(xué)技術(shù)的應(yīng)用，針對已知的目標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行定量檢測的方法，已經(jīng)在食品中農(nóng)獸藥殘留檢測、食品中非法添加檢測等領(lǐng)域中取得很好的效果。但靶向代謝組學(xué)在食品造假鑒定時，由于不法分子會對目標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行有針對性的添加，常規(guī)的靶向代謝組學(xué)檢測方法不足以有效抑制食品造假。近年來，隨著樣品前處理技術(shù)的優(yōu)化以及高分辨質(zhì)譜結(jié)合數(shù)據(jù)處理模型的優(yōu)化，基于高分辨質(zhì)譜的非靶向代謝組學(xué)已經(jīng)開始在食品造假檢測中被普遍認(rèn)可和廣泛應(yīng)用。相比較傳統(tǒng)低分辨質(zhì)譜，高分辨質(zhì)譜能達(dá)到小數(shù)點后4位（m/z），分辨率能達(dá)10 000以上，通過精確分子量結(jié)合軟件，可以推導(dǎo)出化合物元素組成，高分辨質(zhì)譜在對于未知化合物定性上有著絕對的優(yōu)勢。

高分辨質(zhì)譜主要有飛行時間質(zhì)譜（Time-of-flight MS，TOF-MS）、傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜（Fourier transform ion cyclotron resonance MS，F(xiàn)TICRMS）、磁質(zhì)譜（Sector-MS），以及近年出現(xiàn)的靜電場軌道阱質(zhì)譜（Orbitrap-MS）。其中Sector-MS運行速度慢，F(xiàn)TICR-MS雖然具有高分辨率、高準(zhǔn)確度和高靈敏度的特點，但是體積龐大、價格昂貴且操作復(fù)雜，目前這兩種高分辨質(zhì)譜在食品檢測領(lǐng)域中并不常用。TOF-MS具有極快的掃描速度和較高的靈敏度，分辨率可達(dá)到15 000以上，質(zhì)量準(zhǔn)確度可達(dá)5 ppm級，能夠獲得樣品的全掃描質(zhì)譜圖和精確質(zhì)量數(shù)，可以通過精確質(zhì)量數(shù)對化合物進(jìn)行定性分析，目前廣泛應(yīng)用于食品中未知物的篩查［8］。TOF-MS包括氣相色譜飛行時間質(zhì)譜（Gas chromatograph time-of-flight MS，GC-TOF-MS）、液相色譜飛行時間質(zhì)譜（Liquid chromatography time-of-flight MS，GC-TOF-MS）、 液相色譜四極桿飛行時間質(zhì)譜（Liquid chromatography quadrupole-time-of-flight MS，LC-qTOF-MS）、 全 二維氣相色譜-飛行時間質(zhì)譜（Two dimensional gas chromatograph time-of-flight MS，GC×GC-TOF-MS）。Orbitrap-MS是于2000年開發(fā)的新型質(zhì)譜，采用了靜電場軌道阱作為離子的旋轉(zhuǎn)振蕩，使離子圍繞中心電極的軌道旋轉(zhuǎn)從而捕獲離子的裝置，是一種結(jié)合靜電場離子阱和快速傅里葉變換技術(shù)的新型質(zhì)譜［9］，由于其簡化了FTICR-MS的運轉(zhuǎn)過程，較大的降低使用成本，迅速得到了商品化的應(yīng)用。Orbitrap-MS分辨率可達(dá)100 000，質(zhì)量準(zhǔn)確度能達(dá)到2-5 ppm，相比較TOF-MS，Orbitrap-MS對食品復(fù)雜基質(zhì)樣品更能節(jié)省樣品前處理和方法優(yōu)化的時間，而TOF-MS主要體現(xiàn)在掃描速度的優(yōu)勢上。

3 非靶向高分辨質(zhì)譜的食品造假鑒定流程

針對已知的造假靶標(biāo)化合物，不法分子摻入量往往較大較易識別，而對于原料品種、原料或者產(chǎn)地的造假，由于食品基質(zhì)復(fù)雜多樣，各種代謝物濃度范圍相差較大對后續(xù)分析帶來不便；另一方面HRMS一次產(chǎn)生大量代謝物數(shù)據(jù)，目前利用UPLC-qTOF-MS運行一次可以實現(xiàn)幾千種化合物的分離。非靶向代謝組學(xué)意味著代謝組學(xué)的“大數(shù)據(jù)時代”來臨，而海量代謝物的定性定量都給非靶向代謝組學(xué)在食品造假的鑒定帶來前所未有的挑戰(zhàn)。

目前對于食品造假的HRMS研究，不僅包括以往常規(guī)的樣品制備、樣品前處理優(yōu)化，還更側(cè)重于后期的數(shù)據(jù)分析。針對HRMS產(chǎn)生的大數(shù)據(jù)，各大質(zhì)譜公司已經(jīng)開發(fā)了相應(yīng)的數(shù)據(jù)處理軟件， 如 Waters公 司 的 MarkerLynx、Agilent公 司的 MassHunter、Thermo Scientific公 司 的 Sieve， 這些軟件能自動對峰圖進(jìn)行峰降噪、峰過濾、峰識別和峰匹配，篩選出來的生物標(biāo)志物還可以通過XCMS［10］、ChemSpider（http ：//www.chemspider.com）、PubChem［11］、SciFinder（https：//scifinder.cas.org）和METLIN［12］等軟件進(jìn)行在線匹配預(yù)測化合物。最后對篩選出來的生物標(biāo)志物的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行驗證并驗證生物標(biāo)志物在造假鑒定中的有效性，圖1概括了基于HRMS的非靶向代謝組學(xué)在食品造假鑒定中的工作流程。

圖1 基于HRMS的非靶向代謝組學(xué)在食品造假鑒定中的工作流程

目前對非靶向高分辨質(zhì)譜產(chǎn)生的大數(shù)據(jù)進(jìn)行生物標(biāo)志物篩查主要有基于非監(jiān)督方法（Unsupervised method）和有監(jiān)督方法（Supervised method）兩種模式。其中非監(jiān)督方法的模式主要有主成分分析（Principal components analysis，PCA）、 非 線 性 映射（Nonlinear mapping，NLM）和聚類分析（Cluster analysis，CA）。而PCA是應(yīng)用最廣泛的非監(jiān)督模式，非監(jiān)督方法的模式主要用于完全未知樣品的原始數(shù)據(jù)處理，可以對原始數(shù)據(jù)的樣本特性進(jìn)行有效降維和聚類，最終將具有相似特征的目標(biāo)化合物篩選出來。Vaclavik等［13］利用PCA方法對摻假15%蘋果汁或者葡萄汁的橙汁的數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類而將摻假果汁識別出來，PCA方法還能對有機(jī)農(nóng)產(chǎn)品進(jìn)行監(jiān)管，Tengstrand等［14］利用UPLC-qTOF-MS的非靶向代謝組學(xué)利用PCA方法進(jìn)行聚類，可以對未知污染物進(jìn)行有效監(jiān)督，從而達(dá)到對有機(jī)農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量的監(jiān)管。而有監(jiān)督方法的模式主要有線性判別分析（Linear discriminant analysis，LDA）、偏最小二乘法-判 別 分 析（Partial least squares discriminant，PLSDA）和正交信號校正技術(shù)偏最小二乘法-判別分析（Orthogonal signal correction-Partial least squares discriminant，OPLS-DA）等。有監(jiān)督方法主要是對已知樣品類型進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，根據(jù)樣品進(jìn)行分型建立數(shù)據(jù)模型，并從中對未知樣品進(jìn)行辨識、歸類和預(yù)測，以此來判定未知樣品類型，可以有效地應(yīng)用在可疑樣品和已知實物樣品間的篩查中。在食品造假數(shù)據(jù)處理中，有監(jiān)督方法往往和無監(jiān)督方法配合使用，如Hrbek等［15］利用PCA和LDA方法對有機(jī)乳制品進(jìn)行確認(rèn)；Cajka等［16］利用PCA和OPLSDA方法對雞肉摻假進(jìn)行鑒定；Hurtado-Fernández［17］用PCA和PLS-DA方法對牛油果的成熟度進(jìn)行聚類分析。以上數(shù)據(jù)分析模型可以根據(jù)具體研究樣品量和數(shù)據(jù)量來進(jìn)行選擇。

4 高分辨質(zhì)譜在食品造假鑒定中的應(yīng)用

4.1 高分辨質(zhì)譜在食品物種（品種）鑒別中的應(yīng)用

食品的品質(zhì)和相關(guān)特征主要取決于其食品原料農(nóng)產(chǎn)品的遺傳背景和環(huán)境因素，不同品種有著不同的特征、品質(zhì)和口味，利用氣相色譜、液相色譜，特別是超高效液相色譜（Ultra performance liquid chromatography，UPLC）和高分辨質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)能有效地鑒別不同品種的代謝差異。Jandri?等［18-20］利用UPLC-qTOF-MS可以有效區(qū)分橙子、西柚、柑橘、鳳梨等不同水果果汁，還能對不同花源的蜂蜜進(jìn)行區(qū)分；Moco等［21］利用LC-TOF-MS發(fā)現(xiàn)不同品種之間有8種柚皮素或柚皮素查爾酮衍生物具有含量差異；MacKenzie等［22］利用 GC-TOF-MS檢測不同酵母菌株發(fā)酵的代謝差異物；Dobson等［23］利用GCTOF-MS發(fā)現(xiàn)可以通過糖、氨基酸和一些微量脂類的差異而區(qū)分不同品種的馬鈴薯；Hrbek等［24］利用UPLC-TOF-MS和實時直接分析離子源耦合Orbitrap-MS（Direct analysis in real time ion source coupled Orbitrap-MS，DART-Orbitrap-MS）發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因大豆之間磷脂酰膽堿和糖含量的代謝差異。

4.2 高分辨質(zhì)譜在食品產(chǎn)地鑒定中的應(yīng)用

除了食品原料的遺傳背景，原料生長的自然生態(tài)環(huán)境、種植方式等條件也對最終的食品特征、品質(zhì)和口味有著很大的影響。傳統(tǒng)的原產(chǎn)地分析方法主要是測定其有機(jī)物、無機(jī)元素、穩(wěn)定同位素質(zhì)譜等，再通過一系列的計量方法建立特征性成分與產(chǎn)地的聯(lián)系，而以上均需要大量的樣本，涉及檢測項目越多其產(chǎn)地鑒定越準(zhǔn)，實際操作鑒定方法繁瑣，而利用高分辨質(zhì)譜，可以簡化鑒定流程，并且可以輕松實現(xiàn)小樣本的鑒定。Mattarucchi和Cajka等［25-26］利用UPLC-qTOF-MS和GC-TOF-MS對Trappist啤酒真?zhèn)芜M(jìn)行驗證；Jin等［27］利用LC-qTOF-MS對姜黃進(jìn)行代謝物分析，可以根據(jù)姜黃素類化合物的含量高低對不同產(chǎn)地的姜黃進(jìn)行聚類；Arbulu等［28］利用LC-qTOF-MS對Graciano葡萄酒進(jìn)行鑒定發(fā)現(xiàn)，一些糖、氨基酸、高碳醇、生物胺、有機(jī)酸和酚類物質(zhì)可以作為其特征代謝物。

4.3 高分辨質(zhì)譜在食品品質(zhì)鑒定中的應(yīng)用

除了對食品原料品種和產(chǎn)地進(jìn)行檢測，高分辨質(zhì)譜還在食品的品質(zhì)鑒定中發(fā)揮了重要作用，可以在食品的加工工藝質(zhì)控和有機(jī)食品認(rèn)證等環(huán)節(jié)進(jìn)行有效監(jiān)管和檢測，可以有效地監(jiān)管食品造假行為。Capanoglu等［29］利用LC-TOF-MS發(fā)現(xiàn)加工后番茄與鮮番茄之間的營養(yǎng)差別；Ruiz-Aracama等利用UPLC-QTOF-MS在有機(jī)養(yǎng)殖和普通養(yǎng)殖的雞肉中發(fā)現(xiàn)N，N’-二阿魏酸丁二胺和異黃酮的含量差異［30］；Hrbek等［31］對不同產(chǎn)地的大蒜進(jìn)行高分辨質(zhì)譜分析，發(fā)現(xiàn)蒜氨酸、磷脂酰膽堿（16∶0/18∶2）、精氨酸、脫氫丙氨酸、磷脂酰乙醇胺（16∶0/22∶6）、L-γ-谷氨酰基-S-烯丙基-L-半胱氨酸和甘磷酸膽堿可作為大蒜的靶標(biāo)化合物。

5 總結(jié)與展望

高分辨質(zhì)譜應(yīng)用于食品監(jiān)管領(lǐng)域有著分辨率高，掃描速度快等優(yōu)勢。高分辨質(zhì)譜可以進(jìn)行精確質(zhì)量測定，同時獲得精確質(zhì)量信息和碰撞破裂后的精確碎片離子質(zhì)量信息，在對食品中可疑未知化合物定性有著無可比擬的優(yōu)勢。而目前高分辨質(zhì)譜面臨的主要問題是，一方面 相較于低分辨質(zhì)譜來說高分辨質(zhì)譜價格昂貴，不能在各個食品監(jiān)管實驗室普及；另一方面，高分辨質(zhì)譜其定量靈敏度不及傳統(tǒng)三重四級桿質(zhì)譜。因此，在利用高分辨質(zhì)譜進(jìn)行食品摻假物的定性分析，最后還將依賴于傳統(tǒng)三重四級桿質(zhì)譜來進(jìn)行方法開發(fā)，以便于行業(yè)內(nèi)應(yīng)用推廣。

隨著高分辨質(zhì)譜的廣泛應(yīng)用，基于高分辨質(zhì)譜的非靶向代謝組學(xué)將作為現(xiàn)有食品監(jiān)管檢測方法的一個有效補充方法，以此方法開發(fā)相應(yīng)的檢測流程，并且有可能以此建立相應(yīng)檢測標(biāo)準(zhǔn)。同時各國政府對食品安全和標(biāo)識監(jiān)管的不斷完善，加上各國對食品造假行為的加大打擊，相信未來食品造假事件會有所減少。而隨著人們生活水平的提高，對食品的需求將越來越多元化，食品的營養(yǎng)需求會越來越細(xì)分，基于HRMS非靶向代謝組學(xué)不僅僅是應(yīng)用在食品造假鑒定檢測中，還會應(yīng)用在食品營養(yǎng)分析、個人營養(yǎng)需求定制等方向。相信在不久的將來，基于高分辨質(zhì)譜的非靶向代謝組學(xué)在食品中運用將越來越廣泛。