張達(dá)秀 賀雙麗 王倩 蒲仕明，2 吳瓊，2

（1. 廣西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，桂林 541006；2. 廣西高校干細(xì)胞與醫(yī)藥生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，桂林 541004）

間充質(zhì)干細(xì)胞由于獲取相對(duì)容易和具有多向分化潛能［1］，已然成為干細(xì)胞治療法的種子細(xì)胞。在2001年首次通過吸脂術(shù)抽取脂肪組織懸液培養(yǎng)出多能干細(xì)胞，引發(fā)了脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞研究熱［2］。脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞分為兩種，白色脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞（white adipose-derived mesenchymal stem cells，WADSCs）和棕色脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞（brown adipose-derived mesenchymal stem cells，BADSCs），白色脂肪細(xì)胞以甘油三酯的形式儲(chǔ)存多余的能量，而棕色脂肪細(xì)胞因?yàn)槠浣馀悸?lián)蛋白的表達(dá)，可以以熱的形式消耗能量，而這種產(chǎn)熱能力可改善肥胖和與肥胖有關(guān)的疾病如胰島素抵抗、2型糖尿病和脂肪肝病［3］。目前，大多數(shù)的研究集中在WADSCs，研究發(fā)現(xiàn)隨著年齡的增長，WADSCs的增殖能力下降，凋亡和衰老細(xì)胞數(shù)增加［4］。也比較了WADSCs和BADSCs之間的成脂能力，發(fā)現(xiàn) WADSCs 的成脂能力強(qiáng)于 BADSCs［5］。而對(duì)于BADSCs研究很少，主要集中在BADSCs以熱的形式消耗能量［6］，其他方面的研究處于空白階段，作為干細(xì)胞治療的首選的種子細(xì)胞，供體的年齡是否對(duì)細(xì)胞有影響是一個(gè)重要的考察點(diǎn)［7］。本實(shí)驗(yàn)利用MTT增殖法、7-ADD-AnnexinV雙染色、β-半乳糖苷酶染色法和成骨、成脂分化，對(duì)青年和老年小鼠原代培養(yǎng)的BADSCs進(jìn)行鑒定，目的在于討論年齡對(duì)BADSCs的生物學(xué)特性的影響，為進(jìn)一步研究和應(yīng)用BADSCs提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)使用C57BL/6近交系小鼠（青年2-3月齡，老年22-24月齡）。

1.1.2 試劑 澳洲胎牛血清、DMEM/F-12（Thermo Fisher Scientific）Anti-Mouse CD29-PE、Anti-Mouse CD105-PE Cyanine7、Anti-Mouse CD44-APC eFluor780、Anti-Mouse CD73-Percp eFlour710（Biolegend）；AnnexinV/PI雙染檢測(cè)試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所）；β-半乳糖苷酶染色試劑盒、吲哚美辛、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、胰島素、抗壞血酸、β-磷酸甘油、地塞米松、油紅O染料、茜素紅染料（Sigma）。

1.2 方法

1.2.1 棕色脂肪組織和白色脂肪組織鑒定 CO2麻醉處死小鼠，取肩甲骨處的棕色脂肪組織和腹部白色脂肪組織進(jìn)行H &E染色。棕色脂肪組織和白色脂肪組織進(jìn)行細(xì)胞RNA提取和cDNA轉(zhuǎn)錄，以及進(jìn)行UCP1和Leptin基因引物實(shí)時(shí)熒光定量PCR 擴(kuò)增，UCP1上游引物：5'-CTGCCAGGACAGTACCCAAG- 3'，UCP1下游引物：5'-TCAGCTGTTCAAAGCACACA-3'，Leptin上游引物：5'-GAGACCCCTGTGTCGGTTC-3’，Leptin下游引物：5'-CTGCGTGTGTGAAATGTCATTG-3'。總反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min；95℃變性2 min，60℃退火15 s；40 個(gè)循環(huán)，繪制熔解曲線，讀取Ct 值。

1.2.2 BADSCs的分離培養(yǎng)和鑒定 CO2麻醉處死小鼠，在無菌條件下取肩胛骨間處取的棕色脂肪組織放在有PBS的皿中，用剪刀剪成1 mm×1 mm×1 mm的小塊，加入I型膠原酶在37℃水浴消化30 min；每10 min吹打一次，過濾除去未消化組織，15 000 r/5 min離心去掉上清，加入培養(yǎng)基培養(yǎng)。待細(xì)胞匯合到90%時(shí)，用胰酶消化下來，進(jìn)行1∶2傳代，傳到第3代時(shí)進(jìn)行鑒定。鑒定方法：第3代細(xì)胞用胰酶消化下來，加入CD29、CD105、CD44和CD73抗體，設(shè)置空白組和單染組，進(jìn)行流式分析。

1.2.3 MTT增殖法 取第3代細(xì)胞消化后計(jì)數(shù)細(xì)胞，將細(xì)胞配成1×104細(xì)胞懸液；取5塊96孔板，將細(xì)胞懸液均勻接種到每一塊96孔板中，每種細(xì)胞設(shè)4個(gè)復(fù)孔，每個(gè)孔接種1 000個(gè)細(xì)胞，即每個(gè)孔加入100 μL細(xì)胞懸液，設(shè)置一個(gè)空白孔，空白組沒有細(xì)胞，只加100 μL培養(yǎng)基。然后把板放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別在24 h、48 h、72 h、96 h、120 h后取出96孔板，加入10 μL MTT溶液后繼續(xù)培養(yǎng)4 h后吸掉液體，后加入100 μL DMSO，放在搖床上10 min，于490 nm吸光度中檢測(cè)OD值。

1.2.4 7-ADD-AnnexinV雙染色 用100 μL的1X結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞，然后加入5 μL AnnexinV在室溫下孵育15 min后，用緩沖液清洗，離心，用200 μL緩沖液懸浮，加入5 μL7-AAD孵育10 min后進(jìn)行流式分析。

1.2.5 β-半乳糖苷酶染色法 第3代細(xì)胞在室溫下固定7 min，之后每孔加1 mL的染色混合物，在37℃的環(huán)境下孵育過夜，直到細(xì)胞被染成藍(lán)色，計(jì)算10個(gè)不同視野下染成藍(lán)色細(xì)胞數(shù)的平均值。

1.2.6 成骨、成脂分化比較 加入成骨分化培養(yǎng)基（200 mmol/L抗壞血酸、10 mmol/L β-磷酸甘油、0.1 μmol/L地塞米松）進(jìn)行成骨分化的誘導(dǎo)10 d后，用多聚甲醛固定30 min，用茜素紅染色10 min，之后加入100 μL 10%氯化十六烷基吡啶，在酶標(biāo)儀中于540 nm吸光度中檢測(cè)OD值。加入成脂分化培養(yǎng)基（10 μmol/L 胰島素、200 μmol/L 吲哚美辛、500 μmol/L 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、10 μmol/L地塞米松）成脂誘導(dǎo)7 d后，多聚甲醛固定30 min用油紅O染色30 min，之后加入100 μL 異丙醇，在酶標(biāo)儀中于540 nm吸光度中檢測(cè)OD值。根據(jù)染色的結(jié)果和OD值比較其分化能力強(qiáng)弱。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用Graphpad prism 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行one-way ANOVA分析，統(tǒng)計(jì)結(jié)果平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）表示，P＜0.05表示統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著差異。

2 結(jié)果

2.1 棕色脂肪組織和白色脂肪組織鑒定

在顯微鏡下觀察棕色和白色脂肪組織的H &E染色切片，如下圖1-A，發(fā)現(xiàn)棕色脂肪組織的脂滴空泡明顯比白色脂肪組織小。棕色和白色脂肪組織的UCP1和Leptin基因的熒光定量檢測(cè)結(jié)果（圖1-B，1-C），發(fā)現(xiàn)在UCP1在棕色脂肪組織中特異性表達(dá)，Leptin在白色脂肪和棕色脂肪中沒有顯著性差異（P＞0.5）。

圖1 棕色脂肪組織和白色脂肪組織H &E染色比較和UCP1和Leptin基因表達(dá)分析

2.2 不同年齡小鼠BADSCs的免疫表型檢測(cè)

對(duì)第3代青年和老年的BADSCs進(jìn)行流式分析檢測(cè)了CD29、CD105和CD44 細(xì)胞表面抗原，結(jié)果（圖2）顯示青年和老年的BADSCs都表現(xiàn)為陽性表達(dá)，青年BADSCs的CD29表達(dá)量為98.1±1.1%、CD105表達(dá)量為61.4±2.9%、CD44表達(dá)量為97.3±1.7%、CD73表達(dá)量為14.6±0.34%，老年BADSCs的CD29表達(dá)量為98.1±1.3%、CD105表達(dá)量為93.5±3.3%、CD44表 達(dá) 量 為 97.8±1.8%、CD73表 達(dá) 量 為13.1±1.5%。

圖2 不同年齡小鼠BADSCs的CD29、CD105、CD44和CD73 細(xì)胞表面抗原表達(dá)量

2.3 不同年齡小鼠BADSCs細(xì)胞增殖比較

分 別 在 24 h、48 h、72 h、96 h、120 h檢 測(cè)的OD值做成曲線圖，如圖3所示，老年小鼠的BADSCs增殖能力與青年小鼠相比沒有顯著性差異（P＞0.5）。

圖3 不同年齡小鼠BADSC的細(xì)胞增殖比較

2.4 不同年齡小鼠BADSCs細(xì)胞凋亡比較

把青年和老年第3代的BADSCs細(xì)胞用胰酶消化下來，標(biāo)志AnnexinV和7-ADD抗體，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果（圖4）顯示，青年的BADSCs早凋比例4.63±0.87%，老年的BADSCs早凋比例9.88±0.81%，有顯著性差異（P＜0.5）。

A：不同年齡小鼠BADSCs凋亡流式圖分析；B：不同年齡小鼠BADSCs早調(diào)比例統(tǒng)計(jì)分析，YB：青年BADSCs，OB：老年BADSCs，* P＜0.05

2.5 不同年齡小鼠BADSCs β-半乳糖苷酶染色比較

青年和老年組小鼠BADSCs的β-半乳糖苷酶染色的結(jié)果如圖5所示，青年組染成藍(lán)色細(xì)胞數(shù)為2.33±0.3，老年組染成藍(lán)色細(xì)胞數(shù)為6.66±1.2，有顯著性差異（P＜0.05）。染色結(jié)果表明老年組小鼠BADSCs細(xì)胞衰老數(shù)比青年組多。

2.6 不同年齡小鼠BADSCs成骨、成脂分化比較

圖5 不同年齡小鼠BADSCs的β-半乳糖苷酶染色比較

青年和老組小鼠BADSCs 成骨、成脂分化染色結(jié)果如圖6所示，青年組成骨分化OD值為1.26±0.046，老年組成骨分化OD值為0.88±0.047，有顯著性差異（P＜0.05）。青年組成脂分化OD值為0.980 8±0.066，老年組成脂分化OD值為0.769±0.035，有顯著性差異（P＜0.05）。染色結(jié)果表明青年組小鼠BADSCs的成骨和成脂分化能力均強(qiáng)于老年組小鼠BADSCs。用青年組成骨分化OD值比上成脂分化OD值為1.28，而老年組的比值為1.14，說明青年組更傾向于成骨分化。

圖6 不同年齡小鼠BADSCs的茜素紅和油紅O染色比較

3 討論

脂肪干細(xì)胞（Adipose-derived stem cells，ADSCs）是一類細(xì)胞屬性上為間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）的成體干細(xì)胞，其分化潛能僅次于胚胎干細(xì)胞。一個(gè)有趣的現(xiàn)象是，雖然MSCs分化為骨、軟骨、肌腱、韌帶等組織細(xì)胞的能力隨年齡增加而減弱，但其脂肪分化的能力卻增強(qiáng)。比較不同組織和不同年齡供體來源的ADSCs發(fā)現(xiàn)，其分化、增殖以及克隆形成能力不僅不受年齡的影響，甚至在老齡供體中有上升趨勢(shì)［8］。但也有報(bào)道指出，在利用自體脂肪干細(xì)胞移植治療時(shí)，老年ADSCs細(xì)胞的潛在分化能力和組織修復(fù)能力減弱，限制了其移植效果［9］，這可能與ADSCs組織來源、分離方法等有關(guān)。

脂肪組織是一種復(fù)雜的內(nèi)分泌器官，包括多種不同的細(xì)胞群，如脂肪細(xì)胞，前脂肪細(xì)胞，間充質(zhì)干細(xì)胞，巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞。在人體內(nèi)，這些細(xì)胞群體不是靜止的，而是在肥胖和衰老過程中發(fā)生改變的。這些細(xì)胞群的變化使炎癥和其他常見的代謝性并發(fā)癥出現(xiàn)，因此脂肪組織細(xì)胞組成有助于調(diào)節(jié)其內(nèi)分泌和調(diào)節(jié)功能。

脂肪組織存在兩種形式：白色脂肪組織和棕色脂肪組織。白色脂肪組織是在哺乳動(dòng)物中的主要脂肪器官，以甘油三酯的形式儲(chǔ)存多余的能量，在健康成人的體重中占10%或更多，是專門儲(chǔ)存多余的能量。然而人類和嚙齒類動(dòng)物有一種額外的脂肪組織，稱為棕色脂肪組織組織，這是專門以熱的形式消耗化學(xué)能。在進(jìn)化上，棕色脂肪組織組織的功能是對(duì)低溫的防御機(jī)制，特別是在嬰兒、小型哺乳動(dòng)物和冬眠的動(dòng)物。已知棕色脂肪組織富含線粒體和特異性表達(dá)高水平的解耦聯(lián)蛋白UCP-1能夠燃燒脂肪消耗能量增強(qiáng)產(chǎn)熱，具有拮抗實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肥胖形成的作用［10-11］。但是，很長時(shí)間以來關(guān)于成年人體不具有功能性棕色脂肪組織的錯(cuò)誤認(rèn)識(shí)，嚴(yán)重地阻礙了棕色脂肪組織在人類肥胖防治中的應(yīng)用。

近年來的研究不僅明確了成年人體存在功能性棕色脂肪組織，而且發(fā)現(xiàn)在某些情況下，白色脂肪組織可褐變、形成誘導(dǎo)性棕色脂肪組織。那么，存在于褐色脂肪組織內(nèi)的干細(xì)胞伴隨著機(jī)體的衰老會(huì)發(fā)生哪些變化？為此，我們對(duì)2月和22月齡小鼠肩甲骨間的BADSCs進(jìn)行原代培養(yǎng)，比較了青年和老年小鼠BADSCs的生物學(xué)特性。

取肩胛骨處棕色脂肪和白色脂肪組織進(jìn)行H&E染色，比較棕色脂肪和白色脂肪的脂滴空泡大小，發(fā)現(xiàn)棕色脂肪細(xì)胞比白色脂肪細(xì)胞小。熒光定量分析發(fā)現(xiàn)棕色脂肪細(xì)胞特異性表達(dá)UCP1。利用CD29、CD44和CD105的表面抗原進(jìn)行鑒定，本實(shí)驗(yàn)中從青年和老年小鼠的肩胛骨間處獲取的BADSCs，在體外培養(yǎng)3代后均為陽性表達(dá)，證明本實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)的確實(shí)是BADSCs。在保持同一傳代次數(shù)的情況下，MTT檢測(cè)法繪制的生長曲線表明，老年小鼠的BADSCs增殖能力與青年小鼠相比沒有顯著性差異（P＞0.5）。利用7-ADD-AnnexinV雙染色和半乳糖苷酶染色法進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)老年小鼠的BADSCs的凋亡和衰老細(xì)胞數(shù)比青年小鼠的多，隨著復(fù)制次數(shù)增多，細(xì)胞染色體兩端的端粒逐漸縮短，細(xì)胞凋亡和衰老的細(xì)胞數(shù)量也變多。加入成骨和成脂分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)青年和老年小鼠的BADSCs向成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞方向分化，發(fā)現(xiàn)不論是成骨分化能力還成脂分化能力，都是青年小鼠的BADSCs分化能力強(qiáng)。用青年組成骨分化OD值與成脂分化OD值比值與老年組相比，青年組比值更大，說明青年組更傾向于成骨分化。結(jié)果顯示，隨著機(jī)體年齡的增加，出現(xiàn)了更多的凋亡和衰老的細(xì)胞。老年組成骨和成脂分化能力與青年組相比減弱，而且更加傾向于脂肪細(xì)胞方向分化。越來越多的研究顯示，成體干細(xì)胞隨年齡的變化可能是組織器官功能衰退乃至機(jī)體衰老的真正內(nèi)因，與衰老相關(guān)疾病的發(fā)生也可能存在密切的聯(lián)系。BADSCs伴隨年齡增長的變化是否與肥胖、炎癥和其他常見的代謝性并發(fā)癥出現(xiàn)有關(guān)還需進(jìn)一步的研究。

4 結(jié)論

研究發(fā)現(xiàn)小鼠BADSCs的衰老細(xì)胞數(shù)和凋亡比例隨著機(jī)體年齡增加而顯著升高，成骨和成脂分化能力也下降，更加傾向于成脂分化。