陳露露 王會 柴志欣 鐘金城 王吉坤 陳智華 姬秋梅信金偉

（1. 西南民族大學(xué) 青藏高原動物遺傳資源保護(hù)與利用教育部重點實驗室，成都 610041；2. 西南民族大學(xué) 青藏高原研究院，成都 610041；3. 西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院省部共建青稞和牦牛種質(zhì)資源與遺傳改良國家重點實驗室，拉薩 850009）

牦牛（Bos grunniens）是偶蹄目、牛科、牛亞科動物，牛屬中的一個獨立物種，體型龐大，肺臟發(fā)達(dá)，氣管較短，是青藏高原特有的大型反芻動物，享有“高原之舟”美譽，是游牧民生活所依賴的重要生產(chǎn)資料。目前，全世界的家牦牛約 1 400萬頭，野牦牛約15 000 頭（具體數(shù)量會不斷上升），其中在中國的數(shù)量和品種是全世界最多的［1-2］。牦牛長時間生活在海拔2 000 m-5 000 m的高寒地帶造就了它耐低溫低氧的特性。因為汗腺不發(fā)達(dá)，所以不宜生活在海拔相對較低，環(huán)境溫度相對較高的地區(qū)。牦牛肉及奶具有很高的營養(yǎng)價值，其肉中蛋白含量高出黃牛的1/3，乳脂率是奶牛的兩倍［3］。

蘋果酸脫氫酶（Malate dehydrogenase，MDH）基因?qū)儆谕っ讣易?，在氧化還原反應(yīng)的催化過程中發(fā)揮著重要功能。在高等生物中分為細(xì)胞質(zhì)蘋果酸脫氫酶（Cytoplasmic malate dehydrogenase，MDHI）和線粒體蘋果酸脫氫酶（Mitochondrial malate dehydrogenase，MDHII），它們均是 2個相同亞基組成的同源二聚體，是NAD＋依賴性脫氫酶，每個亞基都有相應(yīng)的催化功能，是三羧酸循環(huán)中重要的氧化還原酶，在動物體各個組織中廣泛表達(dá)，控制著動物體的能量代謝。近年來，關(guān)于MDH基因參與機體調(diào)節(jié)的研究有很多，如蜜蜂的MDH基因分MDHI、MDHII和MDHIII三個區(qū)帶［4-6］；雞的MDH基因5'側(cè)翼區(qū)235 bp處有一個SNP位點，可作為影響雞的生長性狀的主效基因［7］；張沅等［8］認(rèn)為豬背膘外層脂肪中MDH活性會影響肉用性狀的選育。前人對該基因在牦牛上的研究結(jié)果表明：牦牛心肌MDH/LDH活力比顯著高于水牛和黃牛，但在不同牛種骨骼肌之間無顯著差異，這說明盡管牦牛生活在高海拔的缺氧環(huán)境中，但心肌仍以有氧代謝占明顯優(yōu)勢，牦牛心肌組織中高的MDH/LDH活力比反映了其正常的有氧能量代謝狀況［9］。本研究首次對牦牛MDHI基因進(jìn)行克隆，結(jié)合生物信息學(xué)分析和組織表達(dá)分析，旨為進(jìn)一步研究該基因的遺傳特性、生理機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

于西藏自治區(qū)昌都市類烏齊縣，選取4.5歲健康的類烏齊牦牛3頭，分別采集心臟、肝臟、肺臟、臀肌和臀脂，DEPC沖洗，錫箔紙包裝迅速置于液氮保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄 Trizol法提取RNA，使用紫外分光光度計和瓊脂糖凝膠檢測RNA的濃度和純度，于-80℃保存?zhèn)溆?。根?jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司）說明書，對總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，標(biāo)記后于-20℃保存。

1.2.2 引物設(shè)計及PCR擴增 根據(jù)GenBank中公布的預(yù)測野牦牛MDHImRNA序列（XM005901271.2）， 利 用 Primer Premier5.0 設(shè)計引物擴增牦牛MDHI基因CDS區(qū)，引物序列為 F：5'-GAGTCGGTTCCACGATAGAGG-3'，R：5'-CTTTGGGGCATTTAGTAACATC-3'，由英濰捷基（上海）生物科技有限公司合成。

PCR 反 應(yīng) 體 系 為 25 μL。 其 中 ddH2O 9.5 μL，上下游引物各為 1 μL（10 pmol/μL），cDNA 模版為1 μL（200-600 ng/μL），Taq Green PCR Master Mix 12.50 μL（0.625 U）。PCR擴增條件：95℃預(yù)變性2 min；95℃變性30 s，55.2℃退火30 s，72℃延伸1 min 30 s，33次循環(huán)，72℃終延伸5 min，4℃保存。

1.2.3 目的基因測序 將PCR擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用DNA純化試劑盒（TianGen公司）進(jìn)行純化膠回收，連接到pMD19-T載體（TaKaRa公司）上，16℃過夜連接后轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞（大腸桿菌）中，涂于含有Amp+的LB固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)10-12 h。篩選出陽性克隆在7 mL含Amp+的LB液體培養(yǎng)基中，37℃震蕩培養(yǎng)10-12 h，對菌液進(jìn)行PCR鑒定后（PCR體系與擴增體系相同），利用質(zhì)粒提取盒（TianGen公司）提取質(zhì)粒并送至英濰捷基（上海）生物科技有限公司進(jìn)行測序鑒定。

1.2.4 組織表達(dá)分析 根據(jù)克隆得到的目的片段設(shè)計實時熒光定量特異性引物，序列為F：5'-ATTCTCGTGCTGTTGGA-3'，R ：5'-TCTTTGAAGGCAATCTCC-3'。內(nèi)參（GADPH）引物為F：5'-CCACGAGAAGTATAACAACACC-3'，R ：5'-GTCATAAGTCCCTCCACGAT-3'。

反應(yīng)體系 10 μL ：5 μL SYBR premix Dimer Eraser（2×），上下引物各 0.4 μL，無菌去離子水 3.2 μL，cDNA（稀釋 2-3 倍）1.0 μL。

定量程序：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，39個循環(huán)。

采用2-△△CT法計算目的基因表達(dá)量，GAPDH作為內(nèi)參基因?qū)颖径拷Y(jié)果進(jìn)行處理，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（±s）。選擇One-way ANOVA和t-檢驗進(jìn)行顯著性分析。

1.2.5 生物信息學(xué)在線分析 牦牛MDHI基因克隆序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，所用軟件如表1所示。

表1 在線軟件網(wǎng)址

2 結(jié)果

2.1 牦牛MDHI基因克隆

PCR產(chǎn)物由1%瓊脂糖凝膠電泳分析得到條帶單一、大小與目的條帶相符合的片段，如圖1測序結(jié)果表明克隆到的MDHI基因DNA序列長為1 169 bp。

圖1 牦牛MDHI基因PCR擴增產(chǎn)物

利用NCBI的 ORF Finder 在線程序?qū)寺〉玫降年笈DHI基因序列進(jìn)行開放性閱讀框分析，得到MDHI基因CDS區(qū)序列長為1 005 bp，編碼334 個氨基酸，起始密碼為ATG，終止密碼為TGA（圖 2）。

2.2 MDHI蛋白的理化性質(zhì)預(yù)測

MDHI基因氨基酸序列理化性質(zhì)分析結(jié)果表明：氨基酸總數(shù)為334，其中Leu、Ala和Lys含量最多，分別為9.6%、9.3%和9.3%，不含Pyl和Sec，帶負(fù)電的殘基總數(shù)（Asp + Glu）為43，帶正電的殘基總數(shù)（Arg + Lys）為41，分子式為 C1628H2628N428O487S14，分子量為 36 438.19，理論等電點為6.61，親水性平均值（GRAVY）：-0.033，脂肪指數(shù)為98.98，半衰期為30 h，不穩(wěn)定指數(shù)為19.93，為穩(wěn)定蛋白。

2.3 牦牛MDHI蛋白的親水性/疏水性預(yù)測與分析

利用位于 Expasy 的 ProtScale 在線軟件進(jìn)行疏水性/親水性分析，Window size設(shè)置為9（圖3）。通過對圖3的分析可以得到：ASIP在40位處有最大值2.767，在96位處有最小值-2.933，MDHI蛋白表現(xiàn)為親水性。

2.4 牦牛MDHI基因編碼蛋白跨膜區(qū)與信號肽分析

利用軟件SignalP 4.1在線分析蛋白質(zhì)的信號肽，發(fā)現(xiàn)無信號肽，說明MDHI不是分泌蛋白，如圖4。MDHI基因編碼蛋白跨膜區(qū)如圖4所示，由圖可知，o-＞ i（膜外跨到膜內(nèi)）有兩個區(qū)域，分別是6-22位和34-54位，i-＞o（膜內(nèi)跨到膜外）有兩個區(qū)域，分別是7-25位和35-55位，其中從7位-25位為拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，分?jǐn)?shù)為1 221（大于500）。

圖2 牦牛MDHI基因編碼的蛋白序列

圖3 牦牛MDHI基因的親水性/疏水性區(qū)分析

2.5 牦牛MDHI基因編碼蛋白結(jié)構(gòu)域與蛋白功能位點預(yù)測

使用Interpro在線軟件預(yù)測MDHI基因編碼蛋白結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)該蛋白屬于保守蛋白結(jié)構(gòu)域家族。3-328位氨基酸具有MDH蛋白結(jié)構(gòu)域活性，是檸檬酸循環(huán)中的關(guān)鍵酶之一，促進(jìn)蘋果酸轉(zhuǎn)化為草酰乙酸，并通過丙酮酸的還原羧化來補充草酰乙酸水平，該亞族的成員是定位于細(xì)胞質(zhì)和胞質(zhì)溶膠的真核MDHs，如圖5。

利用NetPhos2.0預(yù)測其磷酸化位點，在牦牛MDHI基因編碼的氨基酸中共發(fā)現(xiàn)有11個Ser磷酸化位點、11個Thr磷酸化位點、4個Tyr磷酸化位點，如圖5。

2.6 牦牛MDHI基因編碼蛋白的高級結(jié)構(gòu)預(yù)測

圖4 牦牛MDHI編碼蛋白的信號肽（A）和跨膜區(qū)（B）分析

蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)和各功能取決于其空間結(jié)構(gòu)，利用SOPMA對MDHI蛋白二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，得到該蛋白主要以α-螺旋，無規(guī)卷曲為主，其中：α-螺旋有152個，占總鏈的45.51%；無規(guī)卷曲有110個，占總鏈的32.93%；延伸鏈有58個，占總鏈的17.37%；β-轉(zhuǎn)角有14個，占總鏈的4.19%（圖6）。利用SWISS-MODEL預(yù)測軟件分析發(fā)現(xiàn)該模型與豬細(xì)胞質(zhì)蘋果酸脫氫酶，α-酮丙二酸和四氫NAD的三元復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)具有98.50%的相似性，三級結(jié)構(gòu)預(yù)測與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果一致（圖6）。

2.7 亞細(xì)胞定位

利用PSORT II Prediction軟件分析牦牛MDHI蛋白亞細(xì)胞定位：該蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的分布最多，為33.3%；在高爾基體和細(xì)胞核內(nèi)分布最少，分別為11.1%，細(xì)胞質(zhì)和線粒體分別為22.2%。

2.8 同源性、系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

利用DNAstar軟件對牦牛MDHI基因與其他物種進(jìn)行多序列同源比較。由表2可知，牦牛MDHI基因在核苷酸水平上及進(jìn)化過程中表現(xiàn)較為保守。其中，牦牛MDHI基因與黑猩猩（NM_001243069.1）、家貓（NM_001009329.1）、獼猴（NM_001320104.1）、普通牛（NM_001034628.3）、人（NM_005917.3） 和 野 豬（NM_213874.1） 的同源性較高，分別是93.5%、94.4%、93.1%、99.2%、93.1%和94.6%，普通牛最高；其次是原雞（NM_001006395.2）和小家鼠（NM_001316675.1），同源性為80.8%和87.6%；同源性較低的是非洲爪蛙（NM_001006693.2）、 果 蠅（NM_001298874.1）和青鱂（NM_001163134.2），同源性分別為78.8%、62.8%和71.2%，其中果蠅同源性最低。

圖5 牦牛MDHI結(jié)構(gòu)域預(yù)測（A）及磷酸化位點（B）分析

圖6 牦牛MDHI基因編碼蛋白的二級（A）和三級（B）結(jié)構(gòu)預(yù)測分析

表2 牦牛與11個物種MDHI基因的序列同源性比對

利用MEGA5.2對牦牛MDHI基因和其他不同物種進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，發(fā)現(xiàn)牦牛和普通牛的親緣性最近；其次為野豬和家貓，與青鱂親緣性最遠(yuǎn)；其中牦牛、普通牛、野豬、家貓、獼猴、黑猩猩和人形成一個分支，而小家鼠、原雞、非洲爪蛙、果蠅和青鱂形成其他分支，如圖7。

2.9 組織表達(dá)分析

圖7 牦牛MDHI基因核苷酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

結(jié)果（圖8）表明：MDHI基因在牦牛臀脂和肺臟組織中表達(dá)水平最高，在肝臟中最低，在臀脂中的表達(dá)水平顯著高于其他組織（P＜0.05），肺臟組織中的表達(dá)水平也顯著高于臀肌、心臟和肝臟（P＜0.05）。

圖8 牦牛MDHI基因的mRNA組織表達(dá)分析

3 討論

青藏高原地域廣闊，物種多樣性豐富，具有寶貴的畜種資源和基因庫，牦牛遺傳資源豐富。中國牦牛遺傳資源是世界上最多的，關(guān)于牦牛的研究也很多，如低氧適應(yīng)性、肉質(zhì)性狀相關(guān)性、生殖性狀相關(guān)性等一系列研究。

MDH具有氧化還原酶活性，作用于供體的CH-OH基團(tuán)，其中NAD或NADP作為受體，CH-OH基團(tuán)充當(dāng)氫或電子供體用于減少NAD 或NADP氧化還原反應(yīng)的催化活性；具有蘋果酸脫氫酶活性，能夠催化丙酮酸或草酰乙酸向蘋果酸發(fā)生可逆轉(zhuǎn)化，并在生理溫度下對生物化學(xué)反應(yīng)進(jìn)行催化，是TCA（三羧酸）循環(huán)和乙醛酸循環(huán)的組成部分，重要的代謝中間體，控制著動物體呼吸代謝等一系列生命活動。近年來，關(guān)于MDH基因能抑制癌細(xì)胞代謝，也可以作為腫瘤中的潛在治療靶標(biāo)［10-12］。GhcMDHI可能參與棉花纖維快速伸長過程，6-芐基腺嘌呤處理對葡萄果實中MDH基因的表達(dá)表現(xiàn)為抑制［13-14］。不同濃度的丁香酚可降低金黃色葡萄球菌MDH酶活性，戈壁異常球菌能夠有效保護(hù) MDH酶活性［15-16］。但該基因在牛羊等家畜上的研究較少，為補充牦?；驇欤虼丝寺×薓DHI基因，并對其進(jìn)行了相關(guān)生物信息學(xué)分析。

本研究成功克隆了牦牛MDHI基因，為進(jìn)一步研究牦牛MDHI基因提供了理論參考。該基因序列全長為1 159 bp，CDS序列長1 056 bp，編碼334個氨基酸，屬于親水性序列，編碼的蛋白質(zhì)沒有信號肽，不屬于分泌蛋白和結(jié)構(gòu)蛋白。該蛋白帶負(fù)電的殘基總數(shù)（Asp + Glu 為43）大于帶正電的殘基總數(shù)（Arg + Lys 為41），故該蛋白帶負(fù)電。MDHI基因編碼的蛋白質(zhì)包含26 個磷酸位點，為以后蛋白磷酸化研究提供了幫助，具有兩個跨膜區(qū)，說明該基因有幫助膜蛋白附著在膜上的功能和信號傳導(dǎo)功能，其他功能還有待研究。同時該蛋白有1 個保守功能結(jié)構(gòu)域，為NADB Rossmann superfamily結(jié)構(gòu)域，通過Rossmann折疊與NADPH結(jié)合。在糖酵解等許多代謝途徑的脫氫酶中均發(fā)現(xiàn)這種結(jié)構(gòu)域，說明該蛋白可能參與動物體內(nèi)的糖代謝途徑。對同源性預(yù)測結(jié)果顯示與系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果基本一致，表明牦牛MDHI基因在長期的進(jìn)化發(fā)育過程中保持高度保守性。高級結(jié)構(gòu)預(yù)測該蛋白二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)主要以無規(guī)卷曲和-螺旋為基礎(chǔ)進(jìn)一步在空間上延伸，其中-螺旋高達(dá)45.51%，作為一種混合類蛋白，推測這種結(jié)構(gòu)影響該蛋白在糖酵解或氧化還原等過程中的信息傳遞。另外，亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)MDHI蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體和線粒體上的表達(dá)最高，分別為33.3%、22.2%和22.2%。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是真核細(xì)胞中重要細(xì)胞器，參與糖類、脂類合成，蛋白合成及折疊與分泌，主要的合成蛋白為跨膜蛋白和分泌蛋白，而MDHI為跨膜蛋白；線粒體是機體的“能量工廠”，是細(xì)胞有氧呼吸的重要場所，因此推測MDHI基因編碼的蛋白質(zhì)參與了細(xì)胞有氧呼吸；細(xì)胞質(zhì)是細(xì)胞質(zhì)膜以內(nèi)，細(xì)胞核以外的部分，由胞質(zhì)溶膠和細(xì)胞器組成，大部分物質(zhì)的中間代謝和一些蛋白修飾都是在胞質(zhì)溶膠中進(jìn)行。因此，該蛋白可能參與糖酵解等代謝途徑。

MDH的活性影響著動物體的代謝及生長。有研究發(fā)現(xiàn)，MDH在血清中的活性在不同性別的豬中有差異，雄性體內(nèi)MDH活性隨著年齡的增長而增長，而雌性則不然［17］，由此推測，牦牛MDHI基因是否也有此差異，有待下一步實驗驗證。NADPH是動物體內(nèi)重要的脂肪合成輔酶，而MDH能夠催化動物體內(nèi)蘋果酸轉(zhuǎn)變?yōu)楸岵a(chǎn)生NADPH，因此MDH在脂肪合成中起到重要作用［18］。同時，MDH基因編碼的氧化還原酶在機體內(nèi)部調(diào)節(jié)及肌肉和脂肪組織的能量代謝中發(fā)揮重要功能［19］，這一觀點在豬［20-21］和雞［22］中得到證實。在本研究中的熒光定量分析可知，MDHI基因在臀脂的表達(dá)量最高，推測該基因能夠控制牦牛的脂肪合成及能量代謝。同時，肉質(zhì)柔韌性和肌肉內(nèi)脂肪含量是牛肉感官品質(zhì)的關(guān)鍵屬性，脂肪形成分化可以通過MDH1的乙?；瘉碚{(diào)節(jié)，并且MDH1的乙酰化是脂肪生成和細(xì)胞內(nèi)能量水平之間的串?dāng)_機制之一［23-24］，如果進(jìn)一步探究該基因在牦牛脂肪沉積方面的功能，將促進(jìn)優(yōu)質(zhì)牦牛品種的培育。牦牛主要生活在高海拔氧含量低的高寒地區(qū)，肺臟作為機體呼吸的重要器官之一，為適應(yīng)高原極端氣候條件而發(fā)生顯著改變，本研究表明，牦牛MDHI基因在肺臟中具有較高的表達(dá)水平，可推測該基因可與牦牛低氧適應(yīng)性具有調(diào)控作用，就此可作進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究克隆了牦牛MDHI基因，并進(jìn)行序列分析，得到該基因CDS區(qū)全長1 005 bp，編碼334個氨基酸，編碼的蛋白為親水性穩(wěn)定蛋白，在進(jìn)化水平上較為保守；對不同組織表達(dá)進(jìn)行分析得到MDHI在臀脂中表達(dá)量最高，在臀肌中表達(dá)量較低，說明該基因參與機體脂肪沉積調(diào)控。