黃勤勤 王慧梅 梁玲 黃欽耿 吳松剛 黃建忠

（福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 福建師范大學(xué)工業(yè)微生物教育部工程研究中心，福州 350117）

L-蘇氨酸（L-Threonine）被認(rèn)為是動(dòng)物體內(nèi)第二或第三限制性氨基酸，是人體和動(dòng)物的必需氨基酸。已被廣泛應(yīng)用于食品、飼料及醫(yī)藥行業(yè)［1-2］。目前，國(guó)內(nèi)外生產(chǎn)L-蘇氨酸的主流方法是微生物直接發(fā)酵法［3-4］。其中，大腸桿菌（Escherichia coli）工程菌是目前生產(chǎn)中最為常用的宿主菌株［5］。但是由于其安全性不高，并且隨著代謝的進(jìn)行，生產(chǎn)過(guò)程中會(huì)逐漸積累一些毒素，故在醫(yī)藥行業(yè)中不能使用大腸桿菌生產(chǎn)蘇氨酸。相對(duì)來(lái)說(shuō)，無(wú)致病性的安全菌株谷氨酸棒狀桿菌同樣作為氨基酸的傳統(tǒng)生產(chǎn)菌株，其優(yōu)勢(shì)就展現(xiàn)出來(lái)了。隨著谷氨酸棒桿菌模式菌株ATCC 13032測(cè)序的完成，氨基酸合成途徑及代謝調(diào)控機(jī)理逐漸清晰，以及谷氨酸棒桿菌遺傳操作體系的建立和完善，谷氨酸棒桿菌正成為氨基酸代謝工程改造的基盤菌株［6］。

L-蘇氨酸的生物合成是以TCA循環(huán)中間代謝物草酰乙酸為前體。底物葡萄糖代謝經(jīng)過(guò)糖酵解途徑、磷酸戊糖途徑、TCA循環(huán)及C3-C4回補(bǔ)途徑等中心代謝途徑，由草酰乙酸經(jīng)天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶催化生成L-天冬氨酸，即進(jìn)入L-蘇氨酸合成途徑。L-天冬氨酸經(jīng)天冬氨酸激酶（AK，編碼基因lysC）和天冬氨酸半醛脫氫酶（ASD，編碼基因asdA）兩步酶催化反應(yīng)后，再經(jīng)過(guò)高絲氨酸脫氫酶生成L-高絲氨酸，經(jīng)高絲氨酸激酶生成L-磷酰-高絲氨酸，最后經(jīng)蘇氨酸合酶形成L-蘇氨酸［7］。AK由LysC基因編碼，同時(shí)受L-蘇氨酸、L-賴氨酸、L-甲硫氨酸的協(xié)同反饋抑制。天冬氨酸激酶（AK，編碼基因lysC）是合成L-蘇氨酸中的關(guān)鍵酶之一，控制天冬氨酸族合成途徑總碳流量。因此，通過(guò)對(duì)一些經(jīng)傳統(tǒng)育種方法選育得到的L-蘇氨酸生產(chǎn)菌進(jìn)行組學(xué)研究分析，發(fā)現(xiàn)AK和ASD是該合成途徑上影響L-蘇氨酸產(chǎn)量的關(guān)鍵酶之一［8］。

圖1 L-蘇氨酸的生物合成途徑

Dong等［9］將谷棒桿菌的lysC基因第279位突變點(diǎn)A突變?yōu)門解除了L-賴氨酸和L-蘇氨酸反饋抑制的能力。其表達(dá)lysC基因并且串聯(lián)表達(dá)hom基因和thrB基因使部分碳流量從L-賴氨酸（50%）轉(zhuǎn)移至L-蘇氨酸，使谷氨酸棒桿菌L-蘇氨酸產(chǎn)量達(dá)到4.85 g/L。徐德雨等［10］發(fā)現(xiàn)在高產(chǎn)菌的天冬氨酸激酶AK中存在 G359D 突變，驗(yàn)證突變后可阻斷賴氨酸引起的別構(gòu)效應(yīng)，從而有效解除賴氨酸與蘇氨酸的協(xié)同抑制。通過(guò)體外天冬氨酸激酶野生型和G359D 突變體酶活檢測(cè)，其突變體在10 mmol/L賴氨酸和蘇氨酸同時(shí)存在時(shí)酶活達(dá)到76.94%±1.61%，而野生型酶活僅4.38%±1.28%。由此可見(jiàn)，AK酶定點(diǎn)突變可解除L-蘇氨酸、L-賴氨酸的協(xié)同抑制，提高酶活，從而使碳流量更多的流向產(chǎn)L-蘇氨酸方向，達(dá)到提高L-蘇氨酸產(chǎn)量目的。

本文以選育獲得的一株甲硫氨酸和異亮氨酸缺陷（Met-/Ile-）及 α-氨基 -β-羥基戊酸抗性（AHVr）的谷氨酸棒狀桿菌T11（Corynebacterium glutamicumT11）為出發(fā)菌株，通過(guò)基因克隆和序列分析，在已有突變的基礎(chǔ)上，采用PCR介導(dǎo)的方式對(duì)lysC基因進(jìn)行定點(diǎn)突變，構(gòu)建L-蘇氨酸高效抗反饋抑制的關(guān)鍵酶基因lysCr-asdA串聯(lián)表達(dá)組件轉(zhuǎn)化出發(fā)菌株T11，篩選獲得過(guò)量積累L-蘇氨酸工程菌株，進(jìn)行搖瓶和30 L全自動(dòng)發(fā)酵罐分析工程菌的產(chǎn)酸能力、細(xì)胞生長(zhǎng)及雜酸的積累情況，為進(jìn)一步的L-蘇氨酸的代謝工程改造奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 谷氨酸棒狀桿菌T11（C.glutamicumT11）本實(shí)驗(yàn)室選育并保藏；大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，購(gòu)自于全式金；穿梭表達(dá)載體pZ8-1由中國(guó)科學(xué)院微生物所李寅研究員贈(zèng)送。

1.1.2 試劑和儀器 限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、DNA Marker、PrimeStar DNA聚合酶和PCR試劑：TaKaRa寶生物公司產(chǎn)品；引物合成、sanPreP 柱式膠回收DNA試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒：生工生物工程（上海）股份有限公司產(chǎn)品；點(diǎn)突變?cè)噭┖蠪ast Mutagenesis System：北京全式金生物技術(shù)有限公司；酵母粉和胰蛋白胨：Bio Basic Inc公司產(chǎn)品；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

PCR儀：ABI產(chǎn)品；電泳儀：DYY-6C北京六一儀器廠；紫外分光光度計(jì)：UV-282PCS，尤尼柯（上海）儀器有限公司；電轉(zhuǎn)儀：Eppendorf 2510，艾本德中國(guó)有限公司；高效液相色譜：島津公司；30L發(fā)酵罐：鎮(zhèn)江東方生物工程設(shè)備有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基 LB 培養(yǎng)基（g/L）：胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10，若為固體培養(yǎng)基，則額外添加2.0%（w/v）的瓊脂粉。

LBG 培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基添加0.5%（w/v）的葡萄糖，若為固體培養(yǎng)基，則額外添加2.0%（w/v）的瓊脂粉。

上述培養(yǎng)基的pH均調(diào)至7.0±0.1大腸桿菌用LB培養(yǎng)基；C. glutamicum用LBG培養(yǎng)基，其中用于C.glutamicum和E. coli的篩選標(biāo)記卡那霉素使用的終濃度分別為 25 μg/mL 和 50 μg/mL。

種子培養(yǎng)基各組成質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為：葡萄糖2.5%，豆粕提取粉2.0%，尿素0.125%，玉米漿2.0%，KH2PO40.1%，MgSO40.05%，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.05%，VB1100 μg/L，VH150 μg/L，20% 的氨水調(diào)pH 6.9±0.1。

發(fā)酵培養(yǎng)基組成質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為：葡萄糖8%，豆粕提取粉2.0%，（NH4）2SO43.5%，玉米漿2.0%，KH2PO40.1%，MgSO40.1%，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.05%，CaCO33.0%，VB1100 mg/L，VH150 mg/L，20%的氨水調(diào)pH 6.9±0.1。

1.2 方法

1.2.1lysC-asdA串聯(lián)基因簇的克隆 根據(jù)C. glutamicumT11菌株的16S rDNA的序列比對(duì)結(jié)果，以谷氨酸棒狀桿菌ATCC13869基因組序列為模板，設(shè)計(jì)lysC-asdA串聯(lián)基因簇的上下游引物CA-F、CA-R。

CA-F：5'-CGGAATTCCG GTGGCCCTGGTCGTACAGAAATATGGC-3'；CA-R ：5'-CGGGATCCCG TTACTTAACCAGCAGCTCAGCG-3'。其中引物CA-F帶有EcoRⅠ酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基，CA-R帶有BamHⅠ酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基（下劃線序列）。

以C. glutamicumT11菌株基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為50 μL：10×Ex buffer 5 μL，引物CA-F、CA-R各2 μL，基因組DNA模板0.5 μL，dNTP 2.5 μL，Ex Taq 酶 1 μL，ddH2O 補(bǔ) 足 至50 μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性 5 min；95℃ 40 s，57℃ 40 s，72℃ 2.5 min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物1%的瓊脂糖凝膠檢測(cè)，膠回收試劑盒純化回收，備用。

1.2.2 pZ8-1-lysC-asdA重組載體的構(gòu)建 采用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和BamHⅠ分別對(duì)串聯(lián)基因片段lysC-asdA和穿梭表達(dá)質(zhì)粒pZ8-1進(jìn)行雙酶切處理，分別回收目的片段，然后用 T4 DNA ligase進(jìn)行連接，連接體系參考TaKaRa ligase kit 說(shuō)明書。連接反應(yīng)結(jié)束后，轉(zhuǎn)化E. coliJM109感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化液涂布含50 μg/mL卡那霉素的LB平板，37℃ 倒置培養(yǎng)過(guò)夜。從平板上挑選單克隆，采用驗(yàn)證引物（F：5'-TTCTGGCAAATATTCTGAAATGAGC-3'和R：5'-TTCGCAACGTTCAAATCCGC-3'）進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，并挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行37℃過(guò)夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，并對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行酶切和測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.3 PCR介導(dǎo)的lysC基因的定點(diǎn)突變 為了將lysC基因的第279位密碼子定點(diǎn)突變，以陽(yáng)性克隆質(zhì)粒pZ8-1-lysC-asdA為模板，使用攜帶突變位點(diǎn)的引物Cr-A-F和Cr-A-R，參考Fast Mutagenesis System說(shuō)明書，進(jìn)行PCR介導(dǎo)的定點(diǎn)突變，擴(kuò)增，挑取抗性平板克隆進(jìn)行酶切驗(yàn)證，并將陽(yáng)性克隆送交上海生工進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

lysC基因PCR介導(dǎo)的定點(diǎn)突變引物設(shè)計(jì)如下：Cr-A-F：5'-CCGATAAGCCAGGCGAGACTGCGAAGG TTTTCCG-3'；Cr-A-R：5'-CAGCCTCGCCTGGCTTATC GGAAATACCCAGAACGG-3'

其中加粗的堿基為引入的突變堿基。提取質(zhì)粒并進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，構(gòu)建的表達(dá)載體命名為pZ8-1-lysCr-asdA，具體的構(gòu)建原理如圖2所示。

1.2.4 產(chǎn)L-蘇氨酸工程菌的構(gòu)建和篩選

1.2.4.1 構(gòu)建 將獲得的陽(yáng)性pZ8-1-lysCr-asdA重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)導(dǎo)入谷氨酸棒狀桿菌T11感受態(tài)細(xì)胞中［11］。谷氨酸棒狀桿菌T11感受態(tài)細(xì)胞按文獻(xiàn)制備［12］，抗性平板篩選及菌落PCR驗(yàn)證，構(gòu)建含有表達(dá)質(zhì)粒pZ8-1-lysCr-asdA的工程菌株。

1.2.4.2 篩選 從抗性平板中挑取菌落大的陽(yáng)性克隆，直接接種至每孔含有1 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的96微孔板初篩，30℃，220 r/min培養(yǎng)48 h，檢測(cè)發(fā)酵液中L-蘇氨酸含量，并對(duì)初篩L-蘇氨酸積累較多的菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵復(fù)篩和遺傳穩(wěn)定性驗(yàn)證。遺傳穩(wěn)定性分析為每24 h斜面?zhèn)鞔淮?，傳?代，每隔一代進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，檢測(cè)工程菌株的L-蘇氨酸產(chǎn)量。最后選取L-蘇氨酸產(chǎn)量較高且遺傳穩(wěn)定的工程菌株進(jìn)行進(jìn)一步的發(fā)酵分析。

1.2.5 L-蘇氨酸工程菌株的搖瓶發(fā)酵分析 所獲得的工程菌T11/pZ8-1-lysCr-asdA經(jīng)搖瓶發(fā)酵后分析其L-蘇氨酸含量、菌體生物量以及其他氨基酸的生成情況。搖瓶發(fā)酵采用一級(jí)發(fā)酵，培養(yǎng)條件為：30℃，220 r/min發(fā)酵60 h，同時(shí)以出發(fā)菌株T11為對(duì)照菌株。氨基酸的含量采用高效液相色譜系統(tǒng)（HPLC）自動(dòng)柱前衍生化法測(cè)定。色譜柱為Venusil-AA柱。采用流動(dòng)相組成為水相（1 L）：7.6 g無(wú)水乙酸鈉，925 mL 高純水，冰醋酸調(diào)pH至6.5；有機(jī)相（1 L）：80% 乙腈。色譜條件：柱溫40℃，流量1.0 mL/min，SPD-M20A檢測(cè)器。

1.2.6 L-蘇氨酸工程菌株的30 L罐補(bǔ)料分批發(fā)酵 根據(jù)搖瓶發(fā)酵特性，結(jié)合已有的發(fā)酵工藝，采用二級(jí)發(fā)酵的方式對(duì)L-蘇氨酸工程菌株T11/pZ8-1-lysCr-asdA進(jìn)行補(bǔ)料分批發(fā)酵，考察高密度發(fā)酵情形下的L-蘇氨酸產(chǎn)率、葡萄糖的利用率及細(xì)胞生長(zhǎng)情況，綜合評(píng)價(jià)菌株的發(fā)酵潛力。

搖瓶種子培養(yǎng)：挑一環(huán)新鮮斜面上的菌體接種至裝有 30 mL LBG培養(yǎng)基的250 mL 三角瓶中，30℃，220 r/min 振蕩培養(yǎng)12 h至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中后期，?OD562nm約為 0.2×100。

種子罐培養(yǎng)：按0.33%的接種量，將搖瓶種子液轉(zhuǎn)接至含有3 L種子培養(yǎng)基的5 L種子罐中，初始攪拌300 r/min，培養(yǎng)溫度30℃，種子罐周期8 h，移種?OD562nm約為0.30×100。

補(bǔ)料發(fā)酵培養(yǎng)：30 L發(fā)酵罐初始裝液量為15 L，移種量 20%，初始葡萄糖濃度約125 g/L，發(fā)酵溶氧維持在25%-35%，初始攪拌轉(zhuǎn)速 300 r/min，發(fā)酵溫度30℃，流加 25%的氨水以控制 pH在6.9-7.0，發(fā)酵期間每隔2 h 取樣檢測(cè)菌體生物量及殘?zhí)?，根?jù)耗糖速率確定補(bǔ)料量；當(dāng)殘?zhí)墙抵?5.0 g/L 以下時(shí)連續(xù)流加700 g/L 的葡萄糖，維持殘?zhí)菨舛仍?.0-10 g/L，發(fā)酵結(jié)束前4 h，停止流加葡萄糖，當(dāng)殘?zhí)腔竞谋M時(shí)，發(fā)酵結(jié)束，整個(gè)發(fā)酵周期約60 h。

2 結(jié)果

2.1 lysC-asdA串聯(lián)基因的克隆

以谷氨酸棒狀桿菌生產(chǎn)菌T11基因組為模板，引物CA-F、CA-R為引物對(duì)擴(kuò)增出一段約2 300 bp條帶，并對(duì)目的產(chǎn)物進(jìn)行膠回收（圖3），其與相似基因組ATCC13869的lysC-asdA的理論大?。? 324 bp）基本一致。

圖3 lysC-asdA基因PCR擴(kuò)增及回收

2.2 pZ8-1-lysC-asdA重組載體的構(gòu)建及l(fā)ysC的定點(diǎn)突變

轉(zhuǎn)化經(jīng)酶切的質(zhì)粒與目的基因，長(zhǎng)出單菌落后隨機(jī)挑取9個(gè)單克隆，用驗(yàn)證引物直接進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，隨機(jī)挑取的8個(gè)單克隆均為陽(yáng)性克隆（圖4-A），篩選菌落PCR陽(yáng)性的單克隆進(jìn)行質(zhì)粒抽提和單切和雙切驗(yàn)證，確認(rèn)質(zhì)粒pZ8-1中插入大小約為2 400 bp的目的片段（圖4-B）。另外，測(cè)序結(jié)果顯示插入的基因片段確為目標(biāo)片段，確認(rèn)pZ8-1-lysC-asdA構(gòu)建成功。

值得注意的是，克隆的lysC-asdA基因較親緣關(guān)系最近（相似性為99%）的ATCC13869存在顯著差異，其lysC基因的ORF區(qū)域有多達(dá)8個(gè)堿基的突變，其中6個(gè)為無(wú)義突變，但該突變?cè)诶碚撋隙寂c密碼子識(shí)別相關(guān)，另外兩個(gè)堿基的突變都導(dǎo)致了氨基酸的突變；asdA基因也有4個(gè)堿基的突變，但都是無(wú)義突變，這4個(gè)堿基的突變都同樣涉及到密碼子優(yōu)化的問(wèn)題。這極有可能和出發(fā)菌株T11本身經(jīng)歷過(guò)多輪次的誘變選育有關(guān)。pZ8-1-lysC-asdA質(zhì)粒載體經(jīng)EcoRⅠ和BamHⅠ酶切后，出現(xiàn)7 000 bp和2 400 bp的兩條帶，與預(yù)期結(jié)果一致。

A. 重組表達(dá)質(zhì)粒pZ8-1-lysC-asdA的菌落PCR驗(yàn)證；B. pZ8-1-lysC-asdA質(zhì)粒的酶切驗(yàn)證；（A：M：200 bp Ladder DNA marke；1-7：重組表達(dá)質(zhì)粒pZ8-1-lysC-asdA菌落PCR驗(yàn)證；8：pZ8-1空質(zhì)粒對(duì)照；9：T11出發(fā)菌株對(duì)照；B：M：λ-Hind Ⅲ digest DNA marker；1：pZ8-1-lysC-asdA質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ單酶切；2：pZ8-1質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ單酶切；3：pZ8-1-lysC-asdA質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切）

為進(jìn)一步提高lysC基因的抗反饋抑制的能力，采用PCR介導(dǎo)的方式對(duì)lysC基因進(jìn)行另一關(guān)鍵位點(diǎn)的定點(diǎn)突變。獲得的陽(yáng)性克隆中提取質(zhì)粒并進(jìn)行測(cè)序分析，結(jié)果顯示，突變后的lysCr-asdA基因與突變前的基因差異在第279位密碼子由GCT突變成ACT，所編碼的氨基酸由丙氨酸變?yōu)樘K氨酸，與定點(diǎn)突變?cè)O(shè)計(jì)目標(biāo)一致，表明表達(dá)載體pZ8-1-lysCrasdA構(gòu)建成功。

2.3 工程菌株獲得及其篩選

將獲得的含有抗反饋抑制突變的串聯(lián)表達(dá)質(zhì)粒 pZ8-1-lysCr-asdA電轉(zhuǎn)化至L-蘇氨酸菌株C.glutamicumT11感受態(tài)細(xì)胞，采用含卡那霉素抗性平板進(jìn)行篩選，隨機(jī)挑取單菌落，驗(yàn)證引物F和R組成的引物對(duì)其進(jìn)行菌落PCR鑒定，結(jié)果顯示在約2 800 bp的特異條帶，與理論預(yù)測(cè)大小一致，說(shuō)明外源質(zhì)粒導(dǎo)入宿主菌株，成功獲得含有表達(dá)載體的工程菌。

挑選了300個(gè)單克隆進(jìn)行96孔板初篩，并從中獲得10株生長(zhǎng)速度較快且L-蘇氨酸含量較高的菌株進(jìn)行搖瓶復(fù)篩和遺傳穩(wěn)定性驗(yàn)證。結(jié)果顯示，選取的10株相對(duì)高產(chǎn)的菌株中，幾株菌株傳至第二代遺傳穩(wěn)定性逐漸降低，在斜面?zhèn)髦恋谌鷷r(shí)，產(chǎn)酸明顯下降，再繼續(xù)傳代，L-蘇氨酸產(chǎn)量下降最高達(dá)到14.4%。相對(duì)而言，其中一株菌株L-蘇氨酸產(chǎn)量最高，而且穩(wěn)定性維持在較高水平，具備進(jìn)行進(jìn)一步發(fā)酵驗(yàn)證和分析的潛力，將該工程菌株菌株命名為T11/pZ8-1-lysCr-asdA。

2.4 工程菌株T11/pZ8-1-lysCr-asdA搖瓶發(fā)酵產(chǎn)L-蘇氨酸能力分析

為了分析工程菌株T11/pZ8-1-lysCr-asdA發(fā)酵合成L-蘇氨酸的能力，將其與菌株T11/pZ8-1和T11/pZ8-1-lysC-asdA及出發(fā)菌株T11在相同條件下進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，考察L-蘇氨酸濃度、主要雜酸情況及菌株生物量（OD562nm），結(jié)果見(jiàn)表1。

從L-蘇氨酸的生物合成和生物量來(lái)說(shuō)，菌株T11/pZ8-1-lysCr-asdA的L-蘇氨酸的濃度和細(xì)胞密度都最高，T11/pZ8-1-lysC-asdA次之，這說(shuō)明串聯(lián)基因簇的表達(dá)對(duì)于L-蘇氨酸的合成與積累作用顯著，而且通過(guò)調(diào)控其他氨基酸的生物合成，一定程度上對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝帶來(lái)了益處；轉(zhuǎn)入空載體pZ8-1/T11菌株無(wú)論是細(xì)胞密度還是L-蘇氨酸濃度都是最低的，這可能與空載體在宿主細(xì)胞內(nèi)消耗了一定的能量，從而影響細(xì)胞繁殖和氨基酸的代謝合成有關(guān)。

表1 T11/ pZ8-1-lysCr-asdA發(fā)酵性能比較

另外，從主要雜酸的生物合成情況來(lái)看，出發(fā)菌T11與對(duì)照菌株T11/pZ8-1的賴氨酸、丙氨酸、和甘氨酸含量接近，而含有串聯(lián)基因簇的工程菌株，其丙氨酸含量顯著降低，但賴氨酸和甘氨酸含量有所提高，說(shuō)明lysC-asdA的串聯(lián)表達(dá)加速了前體物丙酮酸的轉(zhuǎn)化，有效地將碳流量引入了合成蘇氨酸的合成途徑，顯著提高天冬氨酸族合成代謝流，但這其中碳流向不僅包括蘇氨酸的生物合成，還有一部分流向了賴氨酸的生物合成，而甘氨酸作為蘇氨酸的降解途徑之一，其生物合成的增加意味著更多的蘇氨酸在細(xì)胞內(nèi)被降解。

相比較T11/pZ8-1-lysC-asdA與T11/pZ8-1-lysCrasdA菌株，lysC基因的突變對(duì)于L-蘇氨酸的生物合成有積極意義，其進(jìn)一步提高了lysC基因編碼產(chǎn)物抗反饋抑制的能力，增強(qiáng)了L-蘇氨酸生物合成代謝流。而對(duì)于提高 L-蘇氨酸產(chǎn)量，lysCr-asdA的定點(diǎn)突變和串聯(lián)表達(dá)較lysC-asdA串聯(lián)表達(dá)具有更顯著的作用。

2.5 工程菌株T11/pZ8-1-lysCr-asdA 30L罐的補(bǔ)料分批發(fā)酵

為進(jìn)一步分析T11/pZ8-1-lysCr-asdA工程菌株的代謝情況，以出發(fā)菌株T11為對(duì)照，在30 L 全自動(dòng)發(fā)酵罐中進(jìn)行補(bǔ)料分批發(fā)酵，考察菌株的發(fā)酵生產(chǎn)性能。發(fā)酵過(guò)程代謝曲線見(jiàn)圖5，工程菌株T11/pZ8-1-lysCr-asdAL-蘇氨酸發(fā)酵產(chǎn)量達(dá)65.5 g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率達(dá) 39.5%，較出發(fā)菌株分別提高29.5%和33.9%。

發(fā)酵0-16 h，菌株處于適應(yīng)期，細(xì)胞密度均增長(zhǎng)較慢，但細(xì)胞的耗糖速率有差別，工程菌株T11/pZ8-1-lysCr-asdA的耗糖速率明顯要大，說(shuō)明其細(xì)胞更為活躍，代謝更為旺盛；發(fā)酵16 h之后，細(xì)胞均進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，菌株T11/pZ8-1-lysCr-asdA在發(fā)酵24 h開始流加補(bǔ)糖，36 h時(shí)達(dá)到最大菌濃，其最大菌濃時(shí)OD562nm為112.6，補(bǔ)糖時(shí)間和達(dá)到最大菌濃時(shí)間均較對(duì)照菌株提前6 h，最大菌濃也較對(duì)照菌株T11高16.8%；發(fā)酵36 h后，L-蘇氨酸的積累速率明顯加快，兩者均在發(fā)酵56 h時(shí)達(dá)到最大的產(chǎn)酸率，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，L-蘇氨酸的積累和生物量在56 h和60 h之間降低，因此，發(fā)酵在60 h終止。

3 討論

AK是整個(gè)天冬氨酸族氨基酸合成途徑上的第一個(gè)關(guān)鍵酶，由lysC基因編碼，控制合成天冬氨酸族氨基酸的碳流量。ASD是繼AK后另一個(gè)關(guān)鍵限速酶，這兩個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄皆受L-賴氨酸、L-蘇氨酸反饋?zhàn)瓒粽{(diào)控。故對(duì)于構(gòu)建天冬氨酸族氨基酸如L-賴氨酸、L-甲硫氨酸、L-蘇氨酸、L-異亮氨酸高產(chǎn)菌株具有重要意義。Kalinowski等［13-14］發(fā)現(xiàn)lysC基因與asdA基因是同一基因簇的相鄰基因，其中l(wèi)ysC基因編碼蛋白由兩個(gè)亞基α和β相互重疊組成，而當(dāng)β亞基中的一個(gè)堿基發(fā)生改變時(shí)，整個(gè)AK蛋白表現(xiàn)抗反饋特性。本研究以一株Met-、Ile-和蘇氨酸結(jié)構(gòu)類似物抗性的蘇氨酸產(chǎn)生菌為出發(fā)菌株，在獲得已鑒定突變的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對(duì)lysC基因的第279位密碼子進(jìn)行定點(diǎn)突變，核苷酸由GCT突變?yōu)锳CT，所編碼的氨基酸由丙氨酸突變蘇氨酸，氨基酸由疏水性變?yōu)橛H水性，這可能進(jìn)一步改變AK的分子構(gòu)象，可能Ala279位點(diǎn)具有穩(wěn)定配體Lys與AK結(jié)合的作用，從而加強(qiáng)了Lys對(duì)AK的反饋抑制。故將該位點(diǎn)改變打破了其與Lys間的非共價(jià)鍵作用，從而解除賴氨酸對(duì)天冬氨酸激酶的反饋抑制，削弱L-蘇氨酸和L-賴氨酸對(duì)AK酶抑制能力，同時(shí)提升了磷酸-天冬氨酸對(duì)AK的親和能力，從而增強(qiáng)L-蘇氨酸代謝流。這一點(diǎn)，與工程菌株的蘇氨酸生物合成和積累的情況一致，lysC的突變有效的提高了蘇氨酸合成的碳流量，使L-蘇氨酸產(chǎn)量提高。

加速限速反應(yīng)作為菌株選育的常用策略，除了解除終產(chǎn)物的反饋抑制手段之外，關(guān)鍵酶基因的高效表達(dá)則更能從關(guān)鍵酶的表達(dá)量上實(shí)現(xiàn)限速反應(yīng)的加速進(jìn)程。Ishida等［15］通過(guò)構(gòu)建重組質(zhì)粒pDR34，在乳糖發(fā)酵短桿菌同時(shí)串聯(lián)表達(dá)了hom、thrB和thrC基因，發(fā)酵72 h使得L-蘇氨酸產(chǎn)量從17.9 g/L達(dá)到24.8 g/L。Dong等［16］將谷氨酸棒桿菌ATCC 13869 敲除ddh基因和lysE基因使蘇氨酸產(chǎn)量提高28%，賴氨酸的量降低95%，同時(shí)串聯(lián)表達(dá)lysC、hom和thrB基因進(jìn)行72 h搖瓶發(fā)酵驗(yàn)證蘇氨酸含量達(dá)到7.27 g/L。本研究以強(qiáng)啟動(dòng)子tac作為起始元件，在已有菌株特性的基礎(chǔ)上，串聯(lián)表達(dá)抗反饋抑制的關(guān)鍵酶基因，極大的提高了蘇氨酸產(chǎn)量。但在甲硫氨酸和異亮氨酸合成受阻的基礎(chǔ)上，蘇氨酸的另一支路——賴氨酸的合成同樣得到了增強(qiáng)，不僅如此，作為蘇氨酸的分解代謝產(chǎn)物之一的甘氨酸的含量也有所增加，其實(shí)這些都和關(guān)鍵酶基因表達(dá)之后的代謝流增強(qiáng)有關(guān)。這也提示我們?cè)陉P(guān)注蘇氨酸積累的同時(shí)，需要進(jìn)一步系統(tǒng)的考慮其他的支路代謝和氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體系，比如阻斷蘇氨酸競(jìng)爭(zhēng)代謝支路，即抑制或敲除賴氨酸的表達(dá)；降低蘇氨酸胞外降解途徑，即敲除合成甘氨酸相關(guān)酶基因，運(yùn)用代謝流分析的原理與方法對(duì)蘇氨酸代謝途徑進(jìn)行全面分析，為我們進(jìn)一步的改造明確方向。

與搖瓶發(fā)酵不同，30 L罐通過(guò)流加補(bǔ)料的方式保持細(xì)胞的生長(zhǎng)和代謝性能，其目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量往往會(huì)得到大幅度的增長(zhǎng)。值得注意的是，本研究中工程菌株T11/pZ8-1-lysCr-asdA相較出發(fā)菌株T11來(lái)說(shuō)，其較出發(fā)菌株糖耗時(shí)間提前，菌株生長(zhǎng)速度加快，最終體現(xiàn)為菌株發(fā)酵產(chǎn)酸時(shí)間提前，展現(xiàn)了更好的高密度發(fā)酵的適應(yīng)性，較出發(fā)菌株其生長(zhǎng)速率更快，原因可能一是改造后菌株的前體物丙酮酸轉(zhuǎn)化成生長(zhǎng)抑制物如乳酸、乙酸量降低，從而減少了細(xì)胞生長(zhǎng)的傷害，相對(duì)的加速其轉(zhuǎn)化成草酰乙酸方向，從而使碳流量更多的合成蘇氨酸的方向。二是lysCr-asdA基因與含強(qiáng)啟動(dòng)子的pZ8-1載體串聯(lián)表達(dá)不僅使菌株的AK和ASD酶高效表達(dá)，也使碳流量方向途徑中其他的酶活得到促進(jìn)，從而代謝速率加快，而且在流加補(bǔ)糖的過(guò)程中保持較高的L-蘇氨酸的比合成速率，這說(shuō)明外源基因的表達(dá)不僅直接促進(jìn)了蘇氨酸的合成，對(duì)于細(xì)胞生長(zhǎng)和其他所需氨基酸的代謝調(diào)控也要一定的影響。

4 結(jié)論

本研究以一株Met-、Ile-和AHV抗性的蘇氨酸產(chǎn)生菌T11為出發(fā)菌株，在獲得已鑒定突變的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對(duì)lysC基因的第279位密碼子進(jìn)行定點(diǎn)突變同時(shí)串聯(lián)基因簇lysCr-asdA。成功構(gòu)建pZ8-1-lysCr-asdA表達(dá)組件，串聯(lián)表達(dá)抗反饋抑制的關(guān)鍵酶基因，轉(zhuǎn)入出發(fā)菌株T11并通過(guò)96孔板高通量初篩和搖瓶復(fù)篩得到一株高產(chǎn)L-蘇氨酸且遺傳穩(wěn)定工程菌T11/pZ8-1-lysCr-asdA。發(fā)酵結(jié)果顯示其 L-蘇氨酸產(chǎn)量顯著提高，L-賴氨酸、L-甘氨酸含量均比出發(fā)菌株提高，而丙氨酸的含量下降，表明lysC的定點(diǎn)突變及l(fā)ysC、asdA基因的串聯(lián)表達(dá)對(duì)谷氨酸棒桿菌L-蘇氨酸的代謝流有明顯影響。