李思奇，鄧淑華，謝晶舟，文麗靜，蘇煥厚，王麗京，鄭凌云

(廣東藥科大學生命科學與生物制藥學院，廣東 廣州510006)

心肌肥大是許多心血管疾病(如急性心肌梗死、高血壓、先天性心臟病和糖尿病性心肌病)發(fā)生發(fā)展共有的病理變化，是心臟在各種內在或外在病理作用刺激下的適應性結構反應和代償機制[1-2]。其主要特征為心肌細胞體積增大，蛋白質含量增加，心肌肥大標志物表達增加[3]，從而使心肌耗氧增加，或進入心肌冬眠狀態(tài)，心臟收縮功能減弱引起組織重構最終導致心力衰竭[4]。因此有效阻止和逆轉心肌肥大是防止心衰的關鍵。

有研究顯示，隨著飲食結構的改變，果糖和鹽的攝取呈現進行性增加的趨勢[5-6]。果糖的甜度是蔗糖的1.5倍，由于其生產廉價被廣泛應用于蛋糕、飲料等糖類制品中[7-8]。動物研究證實富含果糖的飲食可增加心血管疾病的風險包括高血壓、高血糖、血脂異常[9]。血壓的升高又會增加心臟的容量負荷、壓力負荷從而使心臟出現代償性增生肥大[10]。

而鹽的攝取對心血管的損傷是把雙刃劍，過量會增加患心血管疾病的風險。且長期高鹽飲食可導致心肌重構，主要病理變化為不同程度的心肌肥大和心臟纖維化[11]，且隨攝鹽量的增加，患者心臟重塑越顯著[12]。臨床統(tǒng)計表明低鹽飲食干預能有效控制高血壓患者的動態(tài)血壓[13]，提示低鹽飲食可能通過控制血壓調節(jié)心肌負荷。

研究也表明，高果糖飲食引起的心肌線粒體水腫、心肌肥厚、高血壓、糖脂代謝異常等與果糖本身促進腎小管水鈉重吸收有密切關系[14]。但同時也有研究證實心肌肥大本身是引發(fā)心衰的獨立危險因素，并不依賴血壓的進行性升高[15]。

因此，高果糖引起的心肌肥大是否與促進水鈉潴留有關并不十分清楚，本研究利用低鹽飲食探究鹽在高果糖導致的心肌肥大中的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級Wistar大鼠48只(雄性)，6～8周齡，體質量180～200 g，由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供，生產許可證號：SCXK(粵)2011-0029。

1.1.2 試劑與儀器 TS-12N全自動生物組織脫水機(湖北孝感宏業(yè)醫(yī)用儀器公司)；石蠟切片機(Leica，德國)；石蠟包埋機(湖北孝感亞光醫(yī)用電子技術有限公司)；光學顯微鏡(日本奧林巴斯)；Sirius Red染色試劑盒(Sigma，美國)；HE染色試劑盒(江西南昌雨露有限公司)；果糖(AMRESCO，美國)；APES(北京中杉金橋生物公司)；兔抗大鼠α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA，武漢博士德)；羊抗兔二抗(北京中杉金橋生物公司)；DAB顯色劑(CST，美國)。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的建立 將實驗大鼠隨機分為5組，每組8只：(1)對照組(Con組)，給予標準大鼠配合飼料(含0.5%NaCl,w/w)并飲用蒸餾水8周；(2)高鹽組(HS組)，給予8%高鹽飼料，飲用正常的蒸餾水；(3)高果糖組(HF組)，10%果糖水(w/v)及大鼠配合飼料；(4)高果糖聯合高鹽組(HFHS組)，飲用10%果糖水(w/v)并給予8%高鹽飼料；(5)高果糖聯合低鹽組(HFLS組)，飲用10%果糖水(w/v)并給予0.07%低鹽飼料(w/w)。

1.2.2 大鼠心質量體質量比檢測 對各組大鼠進行稱重后，麻醉小鼠后對其解剖，收集各組大鼠心臟組織稱重，計算后得到數據。

1.2.3 大鼠心臟HE染色 收集各組大鼠心臟組織并將其橫切后固定，脫水，包埋后制備3 μm組織切片，用APES處理過的載破片收集組織切片，烘干。組織切片梯度脫蠟：二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各30 min，無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ各15 min，95%(φ)乙醇10 min，90%乙醇5 min，95%乙醇5 min后，蘇木素染色1～2 min,流水返藍1 h后伊紅染10 s,透明后中性樹膠封片拍照，采用Ipp軟件測量小鼠單個心肌細胞面積。

1.2.4 大鼠心臟Sirius Red染色 取各組大鼠心臟組織石蠟切片，脫蠟后天狼星紅染色液滴染1 h,流水稍加沖洗，去除切面表面染液后蘇木素染核10 min，流水返藍10 min，透明后中性樹膠封片拍照，采用Ipp軟件計算天狼星紅陽性表達率。

1.2.5 大鼠心臟免疫組化染色 取各組大鼠心臟組織石蠟切片，脫蠟后PBS洗凈殘余乙醇，置于枸櫞酸鹽溶液中高壓修復，37 ℃ 3%H2O2-CH3OH孵育30 min，PBS洗后10%BSA封閉1 h，兔抗大鼠α-SMA 1∶100稀釋后4 ℃孵育過夜，次日復溫后洗凈殘余一抗，37 ℃敷二抗2 h，顯微鏡下顯色觀察，出現陽性表達后終止顯色，蘇木素復染返藍20 min，透明后封片拍照，采用Ipp軟件計算α-SMA陽性表達率。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 低鹽飲食對心質量體質量比的影響

由圖1可看出：與Con組(0.003 008±0.000 2086)相比，HS組(0.003 455±0.000 3674)、HF組(0.003 296±0.000 2381)、HFHS組(0.003 615±0.000 5157)心質量體質量比都有顯著升高(P<0.05)，提示高鹽、高果糖都會造成一定程度的心臟重塑，而HFLS(0.002 800±0.000 3674)組較HF組心質量體質量比明顯降低(P<0.01)，提示高果糖合并高鹽加重心臟重塑，低鹽飲食對高果糖引起心臟重塑有保護作用。

0.0050.0040.0030.0020.0010.000心質量/體質量ConHFHSHFHSHFLS***&&

與Con組比較：*P<0.05； 與HF組比較：&&P<0.01。

圖1高鹽、高果糖、高鹽聯合高果糖及低鹽對心質量體質量比的影響

Figure1Effect of high salt,high fructose,high salt combined with high fructose and low salt on the ratio of rat heart and body weight

2.2 高鹽、高果糖、高鹽聯合高果糖及低鹽對單個心肌細胞面積的影響

由圖2可看出：與Con組心肌單個細胞面積(0.189 9±0.079 06)μm2比較，僅高鹽飲食對心肌單個細胞面積影響不大(0.196 6±0.187 3)μm2，但HF組(0.442 3±0.178 0)μm2的心肌細胞明顯增大(P<0.01)，部分細胞間間隙模糊，心肌纖維融合、斷裂呈波浪狀改變，伴有炎性細胞浸潤。HFHS組(0.420 9±0.235 9)μm2心肌細胞面積與對照組相比也有明顯增加，與HF組相比心肌細胞面積增加不明顯，伴有心肌纖維融合、斷裂更加嚴重，炎性細胞浸潤明顯。而HFLS組心肌細胞橫截面積(0.157 1±0.068 51)μm2相對于HF組有明顯減小(P<0.01)，無明顯炎癥細胞浸潤，心肌細胞間間隙清晰，細胞結構有明顯改善，說明低鹽飲食在一定程度上改善了高果糖誘導的心肌肥大。

2.3 高鹽、高果糖、高鹽聯合高果糖及低鹽對心肌間質膠原沉積的影響

由圖3可看出：Con組天狼星紅陽性表達率為(4.104±2.010)%，心肌間質幾乎無膠原纖維分布；HS組天狼星紅陽性表達率(10.94±1.603)%及HF組天狼星紅陽性表達率(8.68±3.407)%相對于Con都有所增加(P<0.05)，但HF組增加趨勢沒有HS組明顯，提示單純高鹽或單純高果糖均可引起明顯的心臟纖維化，單純高鹽在刺激心肌纖維化上作用更強。

與Con比較：**P<0.01； 與HF組比較：&&P<0.01。

圖2高鹽、高果糖、高鹽聯合高果糖及低鹽對單個心肌細胞面積的影響

Figure2Effect of high salt,high fructose,high salt combined with high fructose and low salt on the myocardial cell area

高果糖聯合高鹽后，天狼星紅陽性表達相比HS組及HF組都有明顯增加，說明聯合作用后心肌間質膠原沉積效果疊加。相反，低鹽飲食(3.250±1.434)%能顯著減輕高果糖引起心肌纖維化程度(P<0.01)。

2.4 高鹽、高果糖、高鹽聯合高果糖及低鹽對心肌成纖維細胞增生的影響

由圖4可以看出，HF組α-SMA陽性表達率(0.138 7±0.063 81)%和HS組α-SMA陽性表達率(0.086 43±0.038 78)%相對于對照組(0.019 75±0.033 87)%明顯增加(P<0.01),提示單純高鹽或高果糖皆可促進心肌成纖維細胞增多；HFHS組陽性表達率(0.164 3±0.054 05)%較HF組明顯增多，提示兩者對心臟纖維化的作用機制可能存在差異；而HFLS組陽性表達率(0.031 64±0.052 23)%與對照組相比明顯減少(P<0.01),提示低鹽飲食可有效逆轉高果糖引起的心臟纖維化增生。

與對照組比較：*P<0.05，**P<0.01；與HF組比較：&&P<0.01。

圖3高鹽、高果糖、高鹽聯合高果糖及低鹽對天狼星紅陽性表達的影響

Figure3Effect of highsalt,high fructose,high salt combined with high fructose and low salt on the positive staining areas of Sirius Red

與Con組比較：**P<0.01；與HF組比較：&&P<0.01。

圖4高鹽、高果糖、高鹽聯合高果糖及低鹽對α-SMA陽性表達的影響

Figure4Effect of high salt,high fructose,high salt combined with high fructose and low salt on the positive staining areas of α-SMA

3 討論

研究表明，左心室肥大是加重心力衰竭、腦卒中、心肌缺血及猝死等心血管疾病的危險因素[16]。單純高果糖可刺激離體大鼠心肌細胞肥大[17]，動物實驗發(fā)現高果糖干預小鼠10周時出現心肌肥厚[18]。HF組大鼠心質量體質量比及心臟單個細胞面積明顯增加，與文獻報道相似。因為高果糖飲食能提高近端小管對Na+的通透性，促使Na+的重吸收[19]，導致鈉水潴留、血壓升高、心臟壓力負荷增加。同時前期研究結果證實[20]，醛固酮受體抑制劑螺內酯能通過降低鈉離子重吸收降低腎損傷抑制血壓升高，提示高果糖飲食誘導心肌肥大可能與鈉離子在腎小管的運輸相關。

高鹽攝入可增強脂聯素介導的對腎臟鈉-葡萄糖共轉運蛋白2(SGLT2)的抑制作用，從而增加尿鈉及尿糖排泄，這一作用在血糖控制不佳時明顯降低[21]，提示鹽攝入在血糖異常情況下參與對水鈉代謝的調節(jié)。研究證實，高鹽飲食可引起心肌肥大[22]，本研究中HF組心肌細胞部分呈現面積增大，統(tǒng)計結果與Con組差別不顯著，可能是高鹽攝入時間較短，所引起的大鼠心肌細胞肥大的程度較輕。同期在小鼠上的研究顯示4周的8%高鹽飲食確實可導致顯著的心肌肥大，與文獻報道相符[22]。HFHS組心肌細胞面積明顯大于Con組與HS組，提示高果糖引起的心肌肥大不僅是因為其促進水鈉潴留作用，還與其他因素相關。

心肌肥大作為心臟的結構性適應，與非心肌細胞(如成纖維細胞、平滑肌細胞、內皮細胞等)以及細胞外基質(主要是膠原纖維)的共同改變有關[23]。心肌膠質纖維骨架是心肌毛細血管的保護支架，同時保證心肌收縮、舒張立體結構功能，其異常主要表現為細胞外基質膠原沉積增多，排列紊亂,Ⅰ型膠原及Ⅲ型膠原比例失調[24]。

天狼星紅染色結果顯示，單純高鹽或高果糖飲食均可明顯增加心臟膠原沉積，高鹽對其影響更明顯，高果糖組在低鹽飲食后明顯改善心肌細胞表型，提示高鹽可能通過破壞心肌膠質纖維骨架，影響心肌細胞正常收縮舒張功能，低鹽飲食則可通過清除細胞外基質膠原沉積而改善心臟纖維化。

心臟中成纖維細胞活化能夠調節(jié)心肌細胞的肥大[25]。本研究顯示，HF組心臟α-SMA陽性染色相對于Con組明顯增加，提示高果糖可誘導心臟成纖維細胞異常增殖。進一步分析，高鹽聯合高果糖飲食后，心臟成纖維細胞進一步增殖，低鹽飲食可逆轉這一現象。有研究顯示心臟肥厚并不都伴隨著心肌纖維化，系統(tǒng)性高血壓患者雖然右側心肌細胞無肥大，但右室卻有膠原沉積。提示心肌肥大并非膠原沉積的必然條件[26]。本研究中單純高鹽誘導后，HS組相對于Con組細胞外基質沉積明顯增加，且伴有α-SMA表達的成纖維細胞異常增殖，而心肌細胞單個面積與Con相比沒有明顯增加。大多數實驗性高血壓動物，在心肌肥大早期就伴隨心肌纖維化[27]。筆者前期研究[20]表明，與對照組相比，高果糖和單純高鹽都可引起大鼠血壓升高，但兩組間血壓值無明顯差異。

本研究結果證實，高鹽引起的心肌損傷主要以心肌纖維化為主，高果糖則引起的心臟損傷主要以心肌肥大為主，同時伴有成纖維細胞增殖和細胞外基質沉積，這可能與果糖促進水鈉的重吸收有一定關系，但也同時表明高果糖本身對心肌細胞有致肥大效應且不完全依賴血壓的進行性升高。低鹽飲食可能通過調控成纖維細胞增殖和活性減少細胞外基質沉積及心肌細胞間膠質纖維骨架形成而改善高果糖引起的心肌肥大伴纖維化病理損傷。此外，低鹽飲食還可能直接通過干預高果糖本身對心肌細胞的作用而抑制心肌細胞肥大,但其具體分子機制需進一步體外實驗驗證。