徐瑋，梁文意，郭彩娟，黃億健，李育平，貝偉劍，郭姣

( 廣東藥科大學(xué)中醫(yī)藥研究院 /廣東省代謝病中西醫(yī)結(jié)合研究中心，廣東 廣州 510006)

血腦屏障(blood brain barrier，BBB)完整性破壞是多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)展的根源[5-6]。內(nèi)皮屏障功能異常導(dǎo)致組織水腫和功能障礙，這個過程涉及炎癥、缺血再灌注損傷、糖尿病、動脈粥樣硬化等。在疾病條件下，腦組織釋放的一系列內(nèi)源性炎癥介質(zhì)，包括組胺、緩激肽、血小板活化因子、生長因子、糖基化產(chǎn)物、細(xì)胞因子、活性氧，都有可能增加微血管通透性[7-8]。腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞是BBB形成的基礎(chǔ)，其封閉特性可以部分歸因于相鄰內(nèi)皮細(xì)胞之間連續(xù)的緊密連接(tight junctions，TJs)[9]。氧化應(yīng)激失常是BBB破壞的誘因，當(dāng)機(jī)體活性氧成分與抗氧化系統(tǒng)之間平衡失調(diào)，氧化應(yīng)激反應(yīng)將引起的一系列適應(yīng)性的反應(yīng)[10-11]。Nrf2/HO-1通路廣泛參與神經(jīng)系統(tǒng)等組織器官的抗氧化應(yīng)激損傷[12-13]。本研究將探討白果內(nèi)酯是否通過Nrf2/HO-1信號通路保護(hù)H2O2誘導(dǎo)的氧化損傷引起B(yǎng)BB通透性增加。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑 白果內(nèi)酯 (Bilobalide，1108650-201507，中國食品藥品檢定研究院提供)；依達(dá)拉奉(3-甲基-1-苯基-5-吡唑啉酮，48QIH-BE，東京化成工業(yè)株式會社)；特級南美胎牛血清(S711-001S，Lonsera品牌)；DMEM高糖培養(yǎng)基(C11960500BT)、DMEM低糖培養(yǎng)基(C11885500BT)、0.25% 胰酶(25200056)，pH7.4磷酸鹽緩沖液(PBS，8118127)均由Thermo Fisher Scientific公司提供；細(xì)胞培養(yǎng)抗生素(15140-122，北京索萊寶科技有限公司)；CCK-8(40203ES60，上海翊圣生物技術(shù)有限公司)；DMSO(W387520)、H2O2(31642)、Na-F(SLBL5470V)由Sigma-Aldrich公司提供；乳酸脫氫酶(LDH)活性檢測試劑盒(A020-2)、一氧化氮(NO)含量檢測試劑盒(A013-2)、還原型谷胱甘肽(GSH)含量檢測試劑盒(A006-2)由南京建成生物工程研究所提供；RIPA裂解液(P0013B)、BCA蛋白定量試劑盒(P0010S)、總抗氧化能力檢測試劑盒(S0116)由碧云天生物技術(shù)公司提供。

1.1.2 主要儀器及實(shí)驗(yàn)耗材 Eon微孔板分光光度計(jì)(BioTek)；Mithras LB-940熒光酶標(biāo)儀(Berthold Technologies)；SW-CJ-1FD超凈工作臺(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；DK-8D電熱恒溫水槽(上海一恒科技有限公司)；8000直熱氣套式CO2培養(yǎng)箱(Thermo scientific)；CKX41倒置相差顯微鏡(日本OLYMPUS)；MERS00002電阻儀(Millipore)；小型垂直蛋白電泳儀、小型Trans-Blot轉(zhuǎn)印槽(美國伯樂)；0.4 μm孔徑Tranwell膜、細(xì)胞培養(yǎng)皿均由Corning公司提供；PVDF膜(ISEQ00010，Millipore)。

1.1.3 細(xì)胞株 永生化人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞株(human cerebral microvascular endothelial cell line，hCMEC/d3)購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫；永生化人腦星形膠質(zhì)細(xì)胞株(human normal glial cell line，HEB)購自廣州吉尼歐生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) hCMEC/d3培養(yǎng)使用高糖DMEM，HEB培養(yǎng)使用低糖DMEM，培養(yǎng)基均需另加入10%(φ)胎牛血清，1%雙抗。細(xì)胞置于5%(φ)CO2，37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。倒置顯微鏡觀察細(xì)胞，細(xì)胞接種2 h可見細(xì)胞完全貼壁，細(xì)胞形態(tài)呈光亮的圓球形。接種8 h后，細(xì)胞延展生長，hCMEC/d3細(xì)胞形態(tài)呈梭形，HEB細(xì)胞形態(tài)呈星形，折光性強(qiáng)。

1.2.2 體外BBB模型建立[14-15]HEB細(xì)胞培養(yǎng)狀態(tài)佳，且細(xì)胞生長密度達(dá)90%時(shí)，移去舊培養(yǎng)基，PBS潤洗2次，用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，離心后將細(xì)胞重懸，細(xì)胞稀釋成6×104個/mL。移取500 μL細(xì)胞懸液，滴在transwell培養(yǎng)室反面，輕柔吹打至細(xì)胞懸液完全均勻鋪蓋在膜上，并將transwell培養(yǎng)室倒置放于無菌的培養(yǎng)皿上，培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h，等待細(xì)胞貼壁。細(xì)胞貼壁后在培養(yǎng)板中加入1 mL培養(yǎng)基，將transwell培養(yǎng)室放回于細(xì)胞孔中。2 d更換1次培養(yǎng)基。待下室的HEB細(xì)胞生長融合至70%時(shí)，按照上述消化細(xì)胞方法將hCMEC/d3細(xì)胞重懸并用培養(yǎng)基稀釋至1.5×105個/mL。移取1 000 μL細(xì)胞懸液，加在transwell上室，并用劃“8”字的手法將細(xì)胞搖晃均勻。將細(xì)胞板放入5% CO2，37 ℃氣套式細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2 d更換1次培養(yǎng)基。

1.2.3 CCK-8 法檢測細(xì)胞活性 取生長狀態(tài)良好的hCMEC/d3細(xì)胞以2×105個/mL接種到96孔板，培養(yǎng)24 h后，運(yùn)用不同濃度白果內(nèi)酯(0.2、1、5、25、125、625 μmol/L)和依達(dá)拉奉(10 μmol/L)分別刺激細(xì)胞24 h，考察藥物對hCMEC/d3細(xì)胞毒性的影響。再用H2O2誘導(dǎo)氧化損傷2 h，考察其對hCMEC/d3細(xì)胞增殖活力的影響。正常組、給藥組和空白孔加入CCK-8試劑，繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中反應(yīng)2 h。酶標(biāo)儀450 nm波長處測定吸光度(A)值。通過公式計(jì)算細(xì)胞增殖活力，細(xì)胞活力=[A(含藥孔)-A(空白孔)]/[A(無藥物孔)-A(空白孔)]×100%。

1.2.4 BBB模型NO、GSH、LDH及總抗氧化能力測定 BBB模型建立成功后，模型分為6組：空白對照組、H2O2模型組(500 μmol/L)、白果內(nèi)酯低中高劑量組(0.2、1、5 μmol/L)；依達(dá)拉奉(10 μmol/L)陽性組。給予不同濃度白果內(nèi)酯及依達(dá)拉奉預(yù)處理體外BBB模型24 h，利用H2O2(500 μmol/L)誘導(dǎo)2 h模擬氧化應(yīng)激損傷。收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液用于LDH活性測定，收集細(xì)胞裂解液用于NO含量、GSH含量及總抗氧化能力測定，細(xì)胞裂解液樣品制備方法如下：用預(yù)冷PBS潤洗transwell孔上層的hCMEC/d3細(xì)胞2次，每個transwell孔加入120 μL RIPA裂解液，4 ℃裂解20 min，細(xì)胞刮刀將細(xì)胞刮下，收集裂解液。4 ℃下12 000 r/min離心20 min，取上清。后續(xù)實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按試劑盒說明書方法進(jìn)行。

“白＋黑”的工作模式讓他和同事們出師大捷—11月1日當(dāng)天就查處了天通苑某超市擅自改動散裝食品有效期的案件，還連夜端掉某山區(qū)內(nèi)一個無證加工醬鴨的黑窩點(diǎn)。鄭全意帶著隊(duì)員們次日凌晨三點(diǎn)趕在回城區(qū)的路上，“拼命三郎”的“美譽(yù)”已被大家叫響了。

1.2.5 跨內(nèi)皮細(xì)胞電阻值(TEER)的測定 體外BBB模型采用跨內(nèi)皮細(xì)胞電阻儀(Millicell ERS)進(jìn)行TEER測量，測電筆金屬頭部分使用前先用75%(φ)乙醇浸泡15 min，再用PBS沖洗3次。電阻測定時(shí)長電極垂直于tranwell板的下室，短電極垂直于tranwell板的上室。模型建立過程中每天監(jiān)測TEER值，測量值應(yīng)減去無細(xì)胞的transwell培養(yǎng)室的電阻值(Ω·cm2)。測定TEER結(jié)果為TEERhCMEC/d3=(TEERhCMEC/d3+filter- TEERfilter)×S(膜面積)，單位：Ω·cm2。每個transwell培養(yǎng)室測量3次，并且每個實(shí)驗(yàn)組設(shè)置3個復(fù)孔，在相同的培養(yǎng)條件以獲得平均TEER和標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.2.6 Na-F通透性的測定 體外BBB模型按照“1.2.4”分組給藥24 h后在tranwell板上室加入0.1 mL含有1 mg/mL的Na-F及500 μmol/L H2O2的高糖培養(yǎng)基，2 h后從下室中吸取200 μL溶液，用多功能酶標(biāo)儀測定其熒光A值，Ex(γ)=(485±10)nm；Em(γ)=(530±10)nm。通過稀釋Na-F濃度為0.004、0.02、0.1、0.5、1 mg/L，制定Na-F標(biāo)準(zhǔn)曲線，將各組測定的A值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各組溶液中透過BBB模型的Na-F量。

1.2.7 蛋白免疫印跡 藥物處理后，按照“1.2.4”的方法收集細(xì)胞裂解液，并按BCA蛋白定量試劑盒方案進(jìn)行蛋白定量，最終將蛋白濃度統(tǒng)一到相同濃度。按照蛋白∶5×SDS蛋白示蹤緩沖液=4∶1混合均勻，85 ℃煮沸10 min，-20 ℃保存。取 20 mg 總蛋白用于上樣。10%～15%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，運(yùn)用“三明治夾心”濕法轉(zhuǎn)膜，隨后脫脂奶粉封閉1 h，TBST洗膜后分別加入Nrf2、HO-1、claudin-5、occludin、VE-Cadherin和GAPDH的兔單克隆抗體4 ℃下孵育過夜；TBST洗滌后加入抗兔二抗，室溫孵育2 h；采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法成像，并運(yùn)用Lane 1D凝膠成像分析軟件進(jìn)行灰度分析，目標(biāo)條帶灰度值與GAPDH內(nèi)參灰度值相比，表示相關(guān)蛋白的相對表達(dá)值。

2 結(jié)果

2.1 體外BBB模型成功建立

文獻(xiàn)報(bào)道細(xì)胞電阻大于300 Ω·cm2，代表體外BBB模型成功建立[15]。通過每天監(jiān)測TEER值，發(fā)現(xiàn)體外BBB在第6天電阻值可達(dá)到300～500 Ω·cm2，第6～9天TEER值處于一個穩(wěn)定狀態(tài)，第9天才開始明顯下降。說明在此研究中體外BBB模型已成功建立。

2.2 白果內(nèi)酯對hCMEC/d3 細(xì)胞活力的影響

各濃度白果內(nèi)酯給藥處理24 h，如圖1所示，給藥組細(xì)胞活力與正常組比較，1 μmol/L白果內(nèi)酯較正常組細(xì)胞活力增加10%(P<0.05)，5 μmol/L白果內(nèi)酯較正常組細(xì)胞活力增加30%(P<0.01)。25、125 μmol/L白果內(nèi)酯對細(xì)胞活力無顯著性影響，625 μmol/L白果內(nèi)酯能引起hCMEC/d3細(xì)胞的活力降低21%(P<0.05)，說明有一定毒性影響。

150100500細(xì)胞活力/%1234567****

1.正常組； 2～7.依次為白果內(nèi)酯給藥濃度0.2、1、5、25、125、625 μmol/L。與正常組比較：*P<0.05，**P<0.01。

圖1白果內(nèi)酯對hCMEC/d3細(xì)胞活力的影響

Figure1Effects of bilobalide on hCMEC/d3 cell viability

2.3 白果內(nèi)酯對H2O2損傷hCMEC/d3細(xì)胞增殖活力的影響

如圖2所示，模型組用H2O2干預(yù)血管內(nèi)皮細(xì)胞2 h，細(xì)胞增殖活性顯著下降 40%(P<0.05)，而預(yù)先用白果內(nèi)酯中劑量(1 μmol/L)和白果內(nèi)酯高劑量(5 μmol/L)給藥，能顯著緩解H2O2引發(fā)的細(xì)胞活力下降，并呈濃度依賴性(P<0.05)，細(xì)胞活力與正常組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。陽性對照藥依達(dá)拉奉組與模型組相比，細(xì)胞活力顯著增加(P<0.05)。

2.4 不同濃度白果內(nèi)酯對H2O2損傷體外BBB相關(guān)氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響

如圖3所示，與正常組比較，模型組NO及GSH含量水平顯著降低(P<0.05,P<0.01)，LDH活性水平顯著升高(P<0.01)。與模型組比較，白果內(nèi)酯中劑量(1 μmol/L)和白果內(nèi)酯高劑量(5 μmol/L)可顯著提高NO含量(P<0.05，P<0.01)，提高GSH含量(P<0.05，P<0.01)及總抗氧化能力(P<0.05，P<0.01)；顯著降低LDH活性(P<0.01)，并呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系。依達(dá)拉奉陽性組與模型組相比，NO含量、GSH含量、總抗氧化能力顯著增加(P<0.01)，LDH活性顯著降低(P<0.01)。

*###1234561.51.00.50.0細(xì)胞活力/%

1.正常組； 2.模型組； 3.白果內(nèi)酯低劑量組； 4.白果內(nèi)酯中劑量組； 5.白果內(nèi)酯高劑量組； 6.依達(dá)拉奉組；與正常組比較：*P< 0.05； 與模型組比較：#P<0.05。

圖2白果內(nèi)酯對H2O2損傷hCMEC/d3細(xì)胞活力的影響

Figure2Effect of bilobalide on hCMEC/d3 cell viability injured by H2O2

0.50.40.30.20.10.0108642030020010003210123456NO含量/(μmol?g-1)GSH含量/(μmol?g-1)LDH活性/(U?g-1)總抗氧化能力/(mmol?g-1)####*######****############**#ABCD

1.正常組； 2.模型組; 3.白果內(nèi)酯低劑量組; 4.白果內(nèi)酯中劑量組； 5.白果內(nèi)酯高劑量組； 6.依達(dá)拉奉組；與正常組比較：**P<0.01； 與模型組比較：#P<0.05，##P<0.01。

圖3白果內(nèi)酯對H2O2損傷BBB模型氧化應(yīng)激損傷相關(guān)指標(biāo)的影響

Figure3Effect of bilobalide on the oxidative stress injury related indicators of the BBB model injured by H2O2

2.5 白果內(nèi)酯抵抗氧化應(yīng)激損傷對體外BBB通透性的影響

通過測定TEER值和Na-F的透過量可以評價(jià)體外BBB的通透性[16]。電阻值測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)(圖 4)，低、中、高劑量的白果內(nèi)酯及依達(dá)拉奉預(yù)處理體外BBB，H2O2干預(yù)2 h后，模型組細(xì)胞電阻值顯著降低(P<0.01)，白果內(nèi)酯組及依達(dá)拉奉組與正常組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。Na-F透過濃度結(jié)果反映，與正常組比較，氧化損傷模型組Na-F透過含量顯著增加(P<0.01)。與模型組比較，依達(dá)拉奉組Na-F的透過量顯著降低(P<0.01)，白果內(nèi)酯中劑量和高劑量亦可顯著降低Na-F的透過量(P<0.05，P<0.01)，并呈劑量依賴性。

AB########****####12345640030020010006420Na-F透過濃度/(mg?mL-1)跨內(nèi)皮細(xì)胞電阻值/(Ω?cm2)

1.正常組； 2.模型組; 3.依達(dá)拉奉組； 4.白果內(nèi)酯低劑量組; 5.白果內(nèi)酯中劑量組; 6.白果內(nèi)酯高劑量組；與正常組比較：**P<0.01；與模型組比較：#P<0.05，##P<0.01。

圖4白果內(nèi)酯對氧化應(yīng)激損傷體外BBB通透性的影響

Figure4Effect of bilobalide on blood-brain barrier permeabi-lity injured by oxidative stressinvitro

2.6 白果內(nèi)酯對氧化應(yīng)激損傷內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接蛋白的影響

為考察給予氧化損傷是否影響緊密連接蛋白的表達(dá)，白果內(nèi)酯預(yù)處理能否起到保護(hù)BBB緊密連接的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明(圖5)，與正常組相比，H2O2干預(yù)BBB 2 h，內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接相關(guān)蛋白claudin-5、occludin、VE-Cadherin的表達(dá)量均顯著性降低(P<0.05，P<0.01)。而預(yù)先給予白果內(nèi)酯或依達(dá)拉奉干預(yù)24 h，再給予氧化損傷，與模型組相比，白果內(nèi)酯給藥組claudin-5、occludin、VE-Caherin蛋白表達(dá)量均高于模型組(P<0.05，P<0.01)，依達(dá)拉奉對Occludin和VE-Caherin蛋白表達(dá)也顯著性增加(P<0.01)。

###########***#####**123456Claudin-5VE-CadherinGAPDHOccludinClaudin-5OccludinVE-Cadherin2.01.51.00.50.0相對蛋白表達(dá)量2.01.51.00.50.0相對蛋白表達(dá)量2.01.51.00.50.0相對蛋白表達(dá)量123456

1.正常組; 2.模型組; 3.依達(dá)拉奉組； 4.白果內(nèi)酯低劑量組; 5.白果內(nèi)酯中劑量組; 6.白果內(nèi)酯高劑量組；與正常組比較：*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較：#P<0.05，##P<0.01。

圖5白果內(nèi)酯對氧化應(yīng)激損傷內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接蛋白的影響

Figure5Effect of bilobalide on tight junction proteins of endothelial cells injured by oxidative stress

2.7 白果內(nèi)酯對H2O2誘導(dǎo)的體外BBB Nrf2/HO-1通路的影響

HO-1是細(xì)胞內(nèi)的抗氧化酶，其表達(dá)受上游轉(zhuǎn)錄因子Nrf2的調(diào)節(jié)[26]。為驗(yàn)證白果內(nèi)酯是否通過影響Nrf2/HO-1信號通路發(fā)揮其抗氧化作用，通過Western blot檢測H2O2模型組及白果內(nèi)酯給藥組對體外BBB Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(圖6)，H2O2干預(yù)體外BBB顯著降低Nrf2、HO-1蛋白的表達(dá)(P<0.05)，而白果內(nèi)酯預(yù)處理，Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)與模型組相比明顯升高(P<0.01)，并高于正常組水平。依達(dá)拉奉對Nrf2、HO-1蛋白的表達(dá)與模型組相比無顯著影響(P>0.05)。

#############**123456HO-1GAPDHNrf2Nrf2HO-12.01.51.00.50.0相對蛋白表達(dá)量2.01.51.00.50.0相對蛋白表達(dá)量123456

1.正常組; 2.模型組; 3.依達(dá)拉奉組； 4.白果內(nèi)酯低劑量組; 5.白果內(nèi)酯中劑量組; 6.白果內(nèi)酯高劑量組； 與正常組比較：*P<0.05； 與模型組比較：#P<0.05，##P<0.01。

圖6白果內(nèi)酯對H2O2誘導(dǎo)的體外BBB Nrf2/HO-1通路的影響

Figure6Effect of bilobalide on H2O2-induced Nrf2/HO-1 pathway in blood-brain barrierinvitro

3 討論

活性氧(ROS)和其他自由基/氧化劑引起的氧化應(yīng)激在動脈粥樣硬化、糖尿病、缺血性中風(fēng)及相關(guān)中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用[17-18]。當(dāng)機(jī)體受到氧化損傷時(shí)，體內(nèi)可產(chǎn)生各種抗氧化分子及酶用于清除體內(nèi)產(chǎn)生的ROS，保護(hù)機(jī)體免受ROS的損傷[19]。GSH常被稱為“抗氧化之母”，是機(jī)體內(nèi)關(guān)鍵的非酶性抗氧化物，GSH含量是衡量機(jī)體抗氧化能力的重要生物標(biāo)志物。LDH是細(xì)胞損傷標(biāo)志物[18]。已有研究證明，依達(dá)拉奉通過清除細(xì)胞內(nèi)ROS，拮抗H2O2下調(diào)細(xì)胞Nrf2/HO-1表達(dá)，從而抑制H2O2導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷作用[20]。

hCMEC/d3細(xì)胞是永生化的人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞系，其具備人腦內(nèi)皮細(xì)胞的大部分形態(tài)和功能特征[21]。星形膠質(zhì)細(xì)胞被證明是體內(nèi)內(nèi)皮細(xì)胞滲透性的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，它可以幫助調(diào)節(jié)培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞更具有BBB結(jié)構(gòu)特性[21]。因此體外BBB的構(gòu)建可廣泛用于藥物對BBB通透性的評價(jià)。在體外BBB模型中，TEER降低和Na-F透過濃度的增加與BBB通透性的增加有關(guān)[22]。

本實(shí)驗(yàn)中，H2O2能引起B(yǎng)BB模型血管內(nèi)皮細(xì)胞的NO、GSH水平和Nrf2/HO-1表達(dá)顯著下降，說明細(xì)胞已發(fā)生氧化應(yīng)激，消耗了大量的抗氧化物質(zhì)，并導(dǎo)致細(xì)胞膜損傷，LDH從細(xì)胞內(nèi)漏出，胞外LDH水平顯著升高，細(xì)胞活力下降，并且此時(shí)BBB模型的TEER下降，熒光素納透過增加，說明H2O2能引起B(yǎng)BB氧化應(yīng)激損傷，并增加BBB模型通透性。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，陽性藥依達(dá)拉奉和白果內(nèi)酯預(yù)處理都可以提高氧化應(yīng)激時(shí)的總抗氧化能力，提高內(nèi)皮細(xì)胞的NO、GSH水平，減少LDH漏出，明顯提高細(xì)胞活力，并且可以維持細(xì)胞正常的電阻值及較低的Na-F的透過。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，H2O2干預(yù)BBB模型使緊密連接蛋白claudin-5、occludin及VE-Cadherin表達(dá)量下調(diào)，而給予白果預(yù)處理可逆轉(zhuǎn)H2O2干預(yù)BBB模型引起的緊密連接蛋白claudin-5、occludin及VE-Cadherin表達(dá)量下調(diào)，解除H2O2干預(yù)對緊密連接蛋白的影響，說明白果內(nèi)酯可通過抗氧化起到了保護(hù)BBB的作用。

Nrf2/HO-1 通路廣泛參與神經(jīng)系統(tǒng)等組織器官的抗氧化應(yīng)激損傷，是機(jī)體最重要的內(nèi)源性保護(hù)體系之一[23-24]。核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)是一種基本的亮氨酸拉鏈氧化還原敏感轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)節(jié)有害應(yīng)激狀態(tài)下細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)，相關(guān)文獻(xiàn)已證明Nrf2可在各種中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)疾病中提供神經(jīng)保護(hù)作用[25]。在正常條件下，Nrf2通過其抑制劑Kelch樣ECH相關(guān)蛋白1(Keap1)錨定于細(xì)胞質(zhì)中。在氧化應(yīng)激條件下，Nrf2從Keap1解離，轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核并激活多種抗氧化酶，例如谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、血紅素加氧酶-1(HO-1)、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)等[26]。血紅素氧合酶(HO)具有2種亞型：誘導(dǎo)型(HO-1)和組成型(HO-2)。HO-1是相關(guān)疾病的保護(hù)性基因，包括I/R損傷、阿爾茨海默病、高血壓病、動脈粥樣硬化和糖尿病；而組成型HO-2的遺傳缺失會導(dǎo)致缺血性腦損傷加劇[27]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，白果內(nèi)酯預(yù)處理能上調(diào)Nrf2及HO-1蛋白的表達(dá)，緩解甚至抵消H2O2對BBB氧化損傷模型的損傷。

綜上表明，白果內(nèi)酯可通過抗氧化作用改善氧化應(yīng)激所致BBB通透性的破壞，其作用機(jī)制可能是通過Nrf2/HO-1信號通路調(diào)節(jié)氧化還原狀態(tài)，逆轉(zhuǎn)H2O2氧化應(yīng)激所致的緊密連接蛋白水平下調(diào)，維持正常BBB通透性。