孫靜，趙暉

上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，上海200233

乳腺癌的發(fā)病率和病死率分別居女性惡性腫瘤的第1、2位[1]。全球每年約139萬乳腺癌新發(fā)病例，病死約46萬，其中中國乳腺癌的新發(fā)例數(shù)和病死例數(shù)分別占全世界的12.2%和9.6%[2]。遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移可嚴(yán)重影響乳腺癌患者的生活質(zhì)量[3]，是導(dǎo)致乳腺癌患者病死的主要原因。晚期乳腺癌患者最常見的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移為骨轉(zhuǎn)移，發(fā)生率約70%[4]，其次為肝、肺、腦等其他部位轉(zhuǎn)移。Notch信號(hào)通路在腫瘤細(xì)胞的增殖、分化和凋亡中具有重要作用，可促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生發(fā)展。本文探討Notch信號(hào)通路在乳腺癌發(fā)生發(fā)展及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制，為研發(fā)以Notch信號(hào)通路為靶點(diǎn)的新抗腫瘤藥物提供理論依據(jù)。

1 Notch信號(hào)通路概述

Notch基因可編碼一類高度保守的細(xì)胞表面受體，由Notch受體、Notch配體及細(xì)胞內(nèi)效應(yīng)器分子3部分組成。Notch基因可調(diào)控海膽和人等多種生物細(xì)胞的發(fā)育。Notch基因最早于果蠅中發(fā)現(xiàn)，因其功能的部分缺失在果蠅翅膀表型的部分缺失中發(fā)揮作用而命名[5]。Notch在果蠅中有1種受體（Notch）和2種配體（Delta和Serrate），在哺乳動(dòng)物中，有4種受體（Notch1～4）和5種Notch配體（Delta-like1、Delta-like3、Delta-like4、Jagged1和 Jagged2）[5-6]。Notch信號(hào)通路的5種配體均具有保守的N-末端結(jié)構(gòu)和表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）樣重復(fù)序列。與Delta-like配體不同，Jagged配體含有富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域[7]。

Notch受體是由細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜區(qū)和細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域3部分組成的前體蛋白，4種Notch受體中均含有保守序列。在高爾基體內(nèi)，Notch前體蛋白在S1位點(diǎn)被弗林蛋白酶（furin）樣轉(zhuǎn)化酶切割，隨后作為異二聚體表達(dá)于細(xì)胞膜上。異二聚體的1個(gè)亞基中含有大部分的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，另1個(gè)亞基包含細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的剩余部分、跨膜結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，這兩個(gè)亞基以非共價(jià)鍵的形式連接形成完整的I型受體[8]。細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)將Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞核[7]，與受體類似，Notch配體也是I型跨膜蛋白，其細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域含有多種EGF樣重復(fù)序列和3個(gè)半胱氨酸蛋白酶Notch/Lin-12（LN）重復(fù)序列。EGF樣重復(fù)序列可參與Notch配體的結(jié)合過程，因此，Notch受體胞外區(qū)是Notch配體結(jié)合并激活Notch受體的部位。Notch受體胞內(nèi)區(qū)（Notch intracellular domain，NICD）含有RAM結(jié)構(gòu)域、6個(gè)錨蛋白（ankyrin，ANK）重復(fù)序列和氨基酸序列PEST的反式激活結(jié)構(gòu)域等。NICD是Notch受體的活性形式，RAM結(jié)構(gòu)域是c啟動(dòng)子結(jié)合因子1/重組信號(hào)結(jié)合蛋白-Jκ（recombination signal binding protein for immunoglobulin kappa J region，RBPJκ）的主要結(jié)合部位；ANK可介導(dǎo)Notch受體與配體等的相互作用，在Notch信號(hào)通路中發(fā)揮重要作用，是激活Notch信號(hào)通路的增強(qiáng)因子；PEST結(jié)構(gòu)域則與Notch受體的降解有關(guān)。

兩個(gè)相鄰細(xì)胞間的配體與受體結(jié)合可激活Notch信號(hào)通路，這種相互作用可誘導(dǎo)Notch受體發(fā)生構(gòu)象變化，暴露胞外結(jié)構(gòu)域中的切割位點(diǎn)S2，經(jīng)金屬蛋白酶切割后，Notch受體在切割位點(diǎn)S3處經(jīng)膜內(nèi)蛋白酶水解后釋放NICD，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中從而激活Notch靶基因。抑制γ-分泌酶的功能可以阻斷Notch受體的最終切割，阻斷Notch信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)。在NICD缺失的情況下，Notch靶基因的轉(zhuǎn)錄被RBPJκ介導(dǎo)的阻遏物復(fù)合體抑制；而NICD存在并進(jìn)入細(xì)胞核時(shí)，阻遏物復(fù)合體被破壞，與RBPJκ結(jié)合并將其轉(zhuǎn)化為轉(zhuǎn)錄激活因子，然后NICD招募共激活因子，如mastermind樣（mastermind-like，MAML）蛋白和組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶p300/CBP，促進(jìn)Notch靶基因的轉(zhuǎn)錄[9]。

2 Notch信號(hào)通路與乳腺癌發(fā)生發(fā)展及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的關(guān)系

2.1 乳腺癌干細(xì)胞理論

目前，已有3種乳腺癌干細(xì)胞起源理論[10]：①不適當(dāng)?shù)恼{(diào)控或突變將休眠的正常干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為腫瘤干細(xì)胞；②“錯(cuò)位體干細(xì)胞”理論；③從普通祖細(xì)胞分化而來。乳腺癌干細(xì)胞可通過CD44+/CD24-表型進(jìn)行篩選，細(xì)胞表面糖蛋白CD44是乳腺癌細(xì)胞黏附、遷移和侵襲的原因之一，可通過與骨橋蛋白的相互作用促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[11]；研究顯示，另一種細(xì)胞表面糖蛋白CD24在腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移中也可發(fā)揮一定作用[12]。乳腺癌干細(xì)胞在乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用，可通過增強(qiáng)膜轉(zhuǎn)運(yùn)、調(diào)控DNA修復(fù)及活性氧（reactive oxygen species，ROS）清除系統(tǒng)、解除細(xì)胞毒性藥物的毒性、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移并導(dǎo)致治療耐受[13]。

Notch信號(hào)通路在乳腺癌干細(xì)胞形成中發(fā)揮關(guān)鍵作用。研究表明，Notch信號(hào)通路可參與正常干細(xì)胞的自我更新和分化過程，并促進(jìn)乳腺癌干細(xì)胞表型的形成[14]。Notch基因在乳腺癌起始細(xì)胞群中表達(dá)上調(diào)。Dontu等[15]研究發(fā)現(xiàn)，采用DSL（Delta-Serrate-LAG2）激活Notch信號(hào)通路可增加多能干細(xì)胞的數(shù)量，相反，使用Notch4阻斷劑或分泌酶抑制劑（gamma-secretase inhibitor，GSI）阻斷 Notch信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，可抑制繼發(fā)性乳腺癌的發(fā)生發(fā)展[16]。Farnie等[17]通過檢測(cè)NICD和Notch4的表達(dá)水平，探討Notch信號(hào)通路在乳腺導(dǎo)管原位癌干細(xì)胞中的作用，結(jié)果顯示，阻斷Notch信號(hào)通路可減少乳腺導(dǎo)管原位癌干細(xì)胞的形成。Harrison等[18]研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌干細(xì)胞的自我更新受Notch信號(hào)通路的調(diào)節(jié)，敲除Notch4比敲除Notch1對(duì)乳腺癌干細(xì)胞的抑制作用更明顯。

2.2 Notch信號(hào)通路與乳腺癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移

Notch信號(hào)通路可影響多能祖細(xì)胞增殖、分化和凋亡等多個(gè)過程。Notch基因位點(diǎn)突變引起的細(xì)胞干性等表型改變，表明Notch信號(hào)通路的作用具有多樣性。作為Notch的主要配體之一，Jagged1是腫瘤進(jìn)展的重要驅(qū)動(dòng)因素，包括骨轉(zhuǎn)移等。在乳腺癌中，Jagged1和Notch1表達(dá)上調(diào)與預(yù)后不良明顯相關(guān)，成骨細(xì)胞過表達(dá)Jagged1基因可促進(jìn)乳腺癌患者發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。Zheng等[19]研發(fā)針對(duì)Jagged1基因的人單克隆抗體15D11，可以抑制乳腺癌細(xì)胞膜Jagged1基因的表達(dá)，從而阻斷其對(duì)乳腺癌的轉(zhuǎn)移促進(jìn)作用。小鼠模型中，15D11可減少乳腺癌的骨轉(zhuǎn)移，并增加轉(zhuǎn)移灶對(duì)化療的敏感性。與Bednarz-Knoll等[20]的研究結(jié)果一致，Jagged1基因在高侵襲性的乳腺癌中表達(dá)水平較高，并可能參與乳腺癌細(xì)胞的遷移過程，導(dǎo)致骨轉(zhuǎn)移乳腺癌患者對(duì)靶向治療產(chǎn)生耐藥性。

2.3 Notch信號(hào)通路與腫瘤血管生成

Notch信號(hào)通路參與腫瘤血管形成已被臨床廣泛認(rèn)可。研究表明，Notch信號(hào)通路異常與多種血管疾病相關(guān)[21]。常染色體顯性遺傳性腦動(dòng)脈病合并皮質(zhì)下梗死和白質(zhì)腦病是由Notch3基因突變所致的腦動(dòng)脈周圍血管平滑肌細(xì)胞破壞引起的腦小血管疾病，表明Notch3基因可調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞的作用和功能[22]。Notch3在人乳腺腫瘤的新生血管中表達(dá)水平較高，表明其在血管生成與維持中可發(fā)揮一定作用。原位雜交和定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）發(fā)現(xiàn)，Delta樣典型缺口配體4（delta-like canonical Notch ligand 4，DLL4）在正常乳腺組織中不表達(dá)，但在乳腺癌的脈管系統(tǒng)中表達(dá)水平較高，且在腫瘤組織中，DLL4mRNA的表達(dá)水平與血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）呈正相關(guān)[23]。Mailhos等[24]進(jìn)行的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，將敲除DLL4的人乳腺癌MCF7細(xì)胞系種植于小鼠皮下，結(jié)果顯示，DLL4mRNA在瘤體脈管系統(tǒng)內(nèi)表達(dá)水平較高。Zeng等[25]研究發(fā)現(xiàn)，Jagged1的表達(dá)水平與腫瘤中的血管密度相關(guān)。雌激素可上調(diào)人乳腺癌MCF7細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中Jagged1和Notch1的表達(dá)，促進(jìn)血管網(wǎng)絡(luò)形成[26]。Notch信號(hào)通路在乳腺癌血管生成中發(fā)揮重要作用，Jagged1和DLL4是影響腫瘤細(xì)胞和相鄰細(xì)胞相互作用并參與血管形成的關(guān)鍵配體，Jagged1可參與腫瘤細(xì)胞的生長、增殖、轉(zhuǎn)移等多個(gè)過程，促進(jìn)腫瘤干細(xì)胞的形成和治療耐受；DLL4參與腫瘤血管生成的主要過程。

3 Notch信號(hào)通路與乳腺癌的治療

一般情況下，Notch信號(hào)通路異?？善鹬掳┳饔?，因此，阻斷Notch信號(hào)通路的表達(dá)可能成為腫瘤治療的新方向。多種分子可阻斷Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的不同位點(diǎn)，如Notch受體和配體可以被單克隆抗體或RNA干擾（RNA interference，RNAi）介導(dǎo)的沉默基因抑制[27]。研究顯示，Notch配體介導(dǎo)的Notch受體激活可被可溶性配體、受體誘餌、參與糖基化或受體切割酶的抑制劑阻斷[28]。Notch信號(hào)通路下游的信號(hào)分子RBPJκ、MAML、HES和HEY是阻斷Notch信號(hào)通路的靶點(diǎn)，還可以通過上調(diào)Notch拮抗劑（如Numb、Deltex等）的表達(dá)阻斷Notch信號(hào)通路的表達(dá)。

γ-分泌酶小分子抑制劑是阻斷Notch信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)的最佳因子。GSI可抑制腫瘤發(fā)生和血管生成，目前，已經(jīng)研制出多種類似的GSI，可能成為Notch信號(hào)通路新的治療靶點(diǎn)。研究顯示，抑制γ-分泌酶的表達(dá)可抑制NICD向細(xì)胞核的釋放[29]。其他γ-分泌酶抑制劑，如SAHM1和TR4，可通過抑制RBPJκ/NICD/MAML轉(zhuǎn)錄激活因子復(fù)合物的形成來抑制Notch受體的表達(dá)，且SAHM1和TR4均是抗體，耐受性良好[30]。Li等[31]的研究結(jié)果顯示，腫瘤細(xì)胞表達(dá)的DLL4可激活宿主基質(zhì)/內(nèi)皮細(xì)胞中的Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，促進(jìn)血管的生成，并改善腫瘤血管的功能。表達(dá)DLL4的腫瘤細(xì)胞對(duì)接受貝伐珠單抗治療的抗VEGF治療有反應(yīng)，為研制新的阻斷DLL4/Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的抗血管生成藥物提供了合理的基礎(chǔ)，聯(lián)合阻斷DLL4和VEGF，可以改善抗血管生成治療的效果。目前，研究顯示，長期使用Notch抑制劑與腫瘤的發(fā)生相關(guān)，單獨(dú)使用Notch抑制劑不能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[32]。而Notch抑制劑與現(xiàn)有療法的聯(lián)合治療可使耐藥的雌激素受體（estrogen receptor，ER）陽性和人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）陽性乳腺癌患者重新對(duì)抗雌激素和抗HER2治療敏感，從而得到更理想的效果[33-34]。

4 小結(jié)與展望

Notch信號(hào)通路與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，該信號(hào)通路可調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等多種生理過程，Notch配體與受體間異常的相互作用也可誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生，同時(shí)調(diào)控腫瘤血管生成，為腫瘤的形成、維持、發(fā)展和轉(zhuǎn)移提供條件。Notch1～4與DLL4蛋白間的相互作用，可促進(jìn)乳腺癌的發(fā)展與轉(zhuǎn)移。Notch信號(hào)通路在調(diào)控細(xì)胞生長和腫瘤形成過程中具有高度的保守性，因此，可能成為抗腫瘤治療的潛在靶點(diǎn)。未來的臨床研究應(yīng)重點(diǎn)探索參與不同類型乳腺癌發(fā)生發(fā)展和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的Notch家族成員及相應(yīng)的作用機(jī)制。進(jìn)一步研制選擇性針對(duì)參與不同類型乳腺癌的Notch信號(hào)分子的抗腫瘤藥物，識(shí)別最有可能受益于Notch抑制劑的患者，從而為乳腺癌的治療提供參考，目前，研究結(jié)果顯示，抑制Notch信號(hào)通路的單克隆抗體具有潛在的治療價(jià)值，其與現(xiàn)有療法相結(jié)合的創(chuàng)新療法可能改善耐藥的問題，為乳腺癌治療提供新方向。