吳麗娜，解金輝，安仕萍，李雙玉

(天津市血液中心，天津300110)

Rh血型系統(tǒng)是國(guó)際輸血協(xié)會(huì)(ISBT)確認(rèn)的紅細(xì)胞血型系統(tǒng)中最復(fù)雜、最具多態(tài)性的血型系統(tǒng)，其至少由45個(gè)獨(dú)立的抗原組成，常見(jiàn)的抗原包括D、C、c、E、e 5種抗原，其中D抗原免疫性最強(qiáng)。根據(jù)紅細(xì)胞D抗原的有無(wú)，可分為紅細(xì)胞RhD陽(yáng)性血型和RhD陰性血型。D抗原由1號(hào)染色體上的RHD基因編碼，該基因含有10個(gè)外顯子?；蛉笔?、基因交換、堿基變異等均可導(dǎo)致RHD等位基因的形成。研究[1]顯示，RHD等位基因的出現(xiàn)可導(dǎo)致D抗原數(shù)量表達(dá)下調(diào)或部分D表位缺失，RhD表型出現(xiàn)變化，稱為RhD變異型。迄今已發(fā)現(xiàn)超過(guò)270種RhD變異型[2]，包括部分D表型、弱D表型以及DEL表型[3]。臨床一般采用鹽水介質(zhì)法鑒定Rh血型，但該方法不能準(zhǔn)確區(qū)分RhD變異型。在鹽水介質(zhì)中加入抗-D單克隆抗體后紅細(xì)胞反應(yīng)為無(wú)凝集或弱凝集(≤2+)，加入抗球蛋白(AHG)后發(fā)生凝集，稱之為血清學(xué)弱D表型(SWDP)[4～6]。研究[7]顯示，SWDP與紅細(xì)胞膜上或者膜內(nèi)D抗原中的一種或者多種氨基酸的替換有關(guān)，導(dǎo)致了紅細(xì)胞表面D抗原表達(dá)減少。本研究收集了20例份血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果表現(xiàn)為SWDP的標(biāo)本進(jìn)行RHD等位基因分型，分析SWDP標(biāo)本的基因型及各變異型的分布情況?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 SWDP抗凝血液標(biāo)本及試劑 選取2016～2018年天津市血液中心保存的SWDP抗凝血液標(biāo)本20例份，均經(jīng)鹽水介質(zhì)法、間接抗球蛋白法鑒定為SWDP。RHD等位基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自天津市秀鵬生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司。

1.2 RHD基因型檢測(cè) 在已加入25 μL蛋白酶K的離心管中加入1 mL的SWDP抗凝血液標(biāo)本，振蕩混勻10 s，加入250 μL細(xì)胞裂解液，70 ℃裂解10 min，加入250 μL無(wú)水乙醇溶解DNA，將液體轉(zhuǎn)移至新的收集管，使用Buffer洗脫提取DNA。以DNA為模板，進(jìn)行序列特異性引物-聚合酶鏈反應(yīng)(SSP-PCR)擴(kuò)增。引物序列如下：?jiǎn)?dòng)子+第1外顯子上游引物為5′-CTAGAGCCAAACCCACATCTCCTT-3′，下游引物為5′-AGAAGATGGGGGAATCTTTTTCCT-3′；第2外顯子上游引物為5′-ATTAGCCGGGCACGGTGGCA-3′，下游引物為5′-AAAGGATGCAGGAGGAATGTAGGC-3′；第3外顯子上游引物為5′-GTGCCACTTGACTTGGGACT-3′，下游引物為5′-AGGTCCCTCCTCCAGCAC-3′；第4外顯子上游引物為5′-TGGCAAGAACCTGGACCTTGACTTT-3′，下游引物為5′-TCCTGAACCTGCTCTGTGAAGTGC-3′；第5外顯子上游引物為5′-TACCTTTGAATTAAGCACTTCACAG-3′，下游引物為5′-TTATTGGCTACTTGGTGCC-3′；第6外顯子上游引物為5′-CAAAAACCCATTCTTCCCG-3′，下游引物為5′-ACCCAGCAAGCTGAAGTTGTAGCC-3′；第7外顯子上游引物為5′-TCTCAGCTCACTGCAACCTC-3′，下游引物為5′-GCTTGAAATAGAAGGGAAATGGGAGG-3′；第8外顯子上游引物為5′-CCAGGTTGTTAAGCATTGCTGTACC-3′，下游引物為5′-CACCCGCATGTCAGACTATTTGGC-3′；第9外顯子上游引物為5′-CCAGGTTGTTAAGCATTGCTGTACC-3′，下游引物為5′-CACCCGCATGTCAGACTATTTGGC-3′；第10外顯子上游引物為5′-CAAGAGATCAAGCCAAAATCAGT-3′，下游引物為5′-AGCTTACTGGATGACCACCA-3′。建立10 μL反應(yīng)體系：樣本DNA為1 μL，dNTP-Buffer工作液9 μL。PCR反應(yīng)條件：96 ℃ 2 min，96 ℃ 20 s、68 ℃ 60 s(5個(gè)循環(huán))，96 ℃ 20 s、65 ℃ 50 s、72 ℃ 45 s(10個(gè)循環(huán))，96 ℃ 20 s、62 ℃ 50 s、72 ℃ 25 s(5個(gè)循環(huán))，72 ℃ 5 min，4℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，使用凝膠圖像分析系統(tǒng)觀察結(jié)果。

1.3 RHD基因測(cè)序 如采用SSP-PCR法不能確定基因型，則將擴(kuò)增產(chǎn)物送至天津市秀鵬生物技術(shù)有限公司，采用DNA序列分析技術(shù)(SBT)進(jìn)行基因測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與GenBank標(biāo)準(zhǔn)RHD基因序列(BN000065)進(jìn)行比較，確定其基因型。

2 結(jié)果

2.1 RHD基因型檢測(cè)結(jié)果 20例份SWDP抗凝血液標(biāo)本中，19例份經(jīng)RHD基因型檢測(cè)可以確定其基因型，其中弱D15型RHD等位基因12例份、部分D型RHD等位基因6例份[DⅥ Ⅲ型5例份、DVA(Hus)型1例份]、DEL型RHD等位基因1例份(1 227 G>A)；1例份經(jīng)SSP-PCR檢測(cè)未能確定基因型。

2.2 RHD基因測(cè)序結(jié)果 未能確定基因型的1例份標(biāo)本，其RHD基因第8外顯子的1 100號(hào)堿基發(fā)生T>A的純合突變，見(jiàn)圖1。該突變導(dǎo)致D抗原的第367位氨基酸由異亮氨酸突變?yōu)樘於彼?，該突變點(diǎn)在紅細(xì)胞血型抗原突變數(shù)據(jù)庫(kù)中未找到對(duì)應(yīng)的等位基因，為新發(fā)現(xiàn)RHD等位基因，其血清學(xué)意義暫不明確。

圖1 1例份SWDP抗凝血液標(biāo)本RHD基因第8外顯子部分測(cè)序結(jié)果

3 討論

2014年，美國(guó)麻醉醫(yī)師學(xué)會(huì)輸血醫(yī)學(xué)資源委員會(huì)對(duì)3 100家實(shí)驗(yàn)室關(guān)于SWDP結(jié)果的檢測(cè)方法與報(bào)告策略進(jìn)行了調(diào)查，結(jié)果顯示，約47%的實(shí)驗(yàn)室將SWDP結(jié)果報(bào)告為“RhD陽(yáng)性”，11%的實(shí)驗(yàn)室報(bào)告為“RhD陰性”，30%的實(shí)驗(yàn)室報(bào)告為“弱D”[8]。他們通過(guò)這項(xiàng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，當(dāng)SWDP出現(xiàn)的時(shí)候，美國(guó)缺乏統(tǒng)一的RhD分型評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)，這直接導(dǎo)致了實(shí)驗(yàn)報(bào)告不一致。

研究[5]顯示，SWDP的分布因人種和民族而不同。在歐洲和美國(guó)，SWDP是最常見(jiàn)的RhD變異型，SWDP相關(guān)的RHD等位基因與同種免疫的關(guān)系也多見(jiàn)于對(duì)歐洲白人的研究，其中弱D1、2、3型最為多見(jiàn)[7，9，10]，且這3種類(lèi)型的受血者均無(wú)產(chǎn)生同種抗-D風(fēng)險(xiǎn)，可按RhD陽(yáng)性對(duì)待[11，12]。與歐美國(guó)家不同的是，在SWDP相關(guān)的RHD等位基因中，弱D15型在中國(guó)人中最為常見(jiàn)。本研究的20例份SWDP抗凝血液標(biāo)本中，共檢測(cè)出弱D15型RHD等位基因12例份，占60%。本研究樣本數(shù)雖不足以有效地統(tǒng)計(jì)分析中國(guó)人群中弱D表型RHD等位基因的分布頻率，但足以發(fā)現(xiàn)歐洲人群和中國(guó)人群弱D表型的分子機(jī)理存在較大差異。

研究[7]顯示，部分D表型與紅細(xì)胞表面D蛋白氨基酸的替換有關(guān)，導(dǎo)致紅細(xì)胞缺乏某些D抗原表位。部分D表型的人輸注RhD陽(yáng)性血液時(shí)產(chǎn)生抗-D的比例尚未得知，但是已有被誤認(rèn)為RhD陽(yáng)性其實(shí)可能為部分D型的人產(chǎn)生抗-D抗體的報(bào)道[13]，而這些產(chǎn)生抗-D抗體的人是弱D表型還是部分D表型并沒(méi)有被區(qū)分。DⅥ型是歐洲人中最常見(jiàn)的部分D表型的基因型之一[14]。研究[15]發(fā)現(xiàn)，目前確認(rèn)的DⅥ表型都是RHD和RHCE基因轉(zhuǎn)換引起，并非RHD外顯子的缺失，與本研究結(jié)果一致。如果將DⅥ型血液當(dāng)做RhD陰性血液輸注給RhD陰性人群，則有可能導(dǎo)致溶血性輸血反應(yīng)的發(fā)生。研究[16]顯示，攜帶部分D基因的女性患者產(chǎn)生抗-D抗體以后發(fā)生了非常嚴(yán)重的溶血性輸血反應(yīng)。目前美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局規(guī)定現(xiàn)行的單克隆IgM抗-D試劑需有效避免DⅥ型的檢出。本研究檢出部分D型6例份，其中DⅥ Ⅲ型5例份、DVA(Hus)型1例份，占比較高。

DEL表型通常情況下在血清學(xué)實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)為RhD陰性，只有進(jìn)行吸收放散實(shí)驗(yàn)才能夠檢出[17]。DEL表型在白人和黑人中罕見(jiàn)[18]，但在中國(guó)RhD陰性漢族人群中常見(jiàn)，約占30%[19]。中國(guó)漢族人群中DEL等位基因主要是RHD 1 227 G>A。一些研究[20,21]認(rèn)為，DEL表型的受血者由于紅細(xì)胞表面的D抗原數(shù)目較少，輸注DEL表型的血液不會(huì)引起同種免疫的發(fā)生。然而，已有許多的報(bào)道[22]證實(shí)，RhD陰性志愿者輸注DEL表型的血液后會(huì)產(chǎn)生同種免疫，通常認(rèn)為這種免疫為二次免疫，即輸注DEL表型的血液導(dǎo)致已存在抗-D抗體的病人抗-D抗體效價(jià)增高。本研究檢出DEL型RHD等位基因1例份，為RHD 1 227 G>A等位基因，與報(bào)道的較常見(jiàn)的DEL等位基因型一致。

本研究中，1例份SWDP抗凝血液標(biāo)本經(jīng)SSP-PCR檢測(cè)未能確定其基因型，進(jìn)行基因測(cè)序進(jìn)一步確定其基因型。經(jīng)基因測(cè)序發(fā)現(xiàn)，RHD基因的第8外顯子的1 100號(hào)堿基發(fā)生T>A的純合突變，導(dǎo)致D抗原的第367位氨基酸由異亮氨酸突變?yōu)樘於彼幔鞍踪|(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，導(dǎo)致D抗原在與抗-D單克隆血清反應(yīng)時(shí)為陰性反應(yīng)，間接抗球蛋白實(shí)驗(yàn)為陽(yáng)性反應(yīng)，其血清學(xué)反應(yīng)結(jié)果與部分D表型較為相似。此點(diǎn)突變是否導(dǎo)致了D抗原的數(shù)量或者抗原決定簇的改變需要進(jìn)一步研究，從而探討其是否能夠引起同種免疫，接下來(lái)我們將對(duì)該新基因攜帶者進(jìn)行家系調(diào)查，檢測(cè)其是否能夠穩(wěn)定遺傳。

綜上所述，本研究20例份SWDP抗凝血液標(biāo)本中弱D15型和DⅥ型RHD等位基因較多。本研究新發(fā)現(xiàn)1例RHD等位基因。RHD基因型的檢測(cè)及其能否導(dǎo)致同種免疫的發(fā)生,已成為近年來(lái)國(guó)際免疫血液學(xué)領(lǐng)域中研究熱點(diǎn)之一[23]。西方國(guó)家已經(jīng)開(kāi)始對(duì)RHD基因分型進(jìn)行研究調(diào)查，我國(guó)SWDP的分布與西方不同，應(yīng)大力開(kāi)展RHD基因分型和相關(guān)研究，探明SWDP發(fā)生率及其基因型分布，條件成熟時(shí)建立符合我國(guó)國(guó)情的RHD的基因分型處理指南。