張 樂

(承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院胸外科,承德067000)

非小細胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)占肺癌發(fā)生的85%[1,2]，發(fā)病率和死亡率逐年增加，給患者家庭和社會帶來了沉重的負擔。盡管伴隨著小分子靶向治療藥物的問世，耐藥現(xiàn)象的出現(xiàn)[3,4]，NSCLC患者的五年生存率未得到明顯的提高，因此對NSCLC發(fā)生發(fā)展機制的探索迫在眉睫。既往研究表明[5,6]，有些抑癌基因因自身CpG島甲基化而被沉默進而誘發(fā)腫瘤的發(fā)生，因此對于該抑癌基因甲基化的測定對腫瘤的臨床診療尤為關(guān)鍵。人類Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子3(Human Runt relationed transcription factor 3，RUNX3)是近年來被確定的一個抑癌基因[7]。新近研究報道稱[7-10]，RUNX3基因啟動子在肺癌、結(jié)直腸腺癌、胃癌及乳腺癌等組織中甲基化水平明顯增加，進而導致RUNX3基因沉默而失去活性，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中扮演者重要的角色。本研究擬采用巢氏甲基化特異性PCR(nMSP)法檢測RUNX3啟動子甲基化情況；鏈霉菌素-生物素過氧化物酶(S-P)染色法檢測腫瘤侵襲相關(guān)基因E-Cad、MMP-7和TIMP-1蛋白表達并計數(shù)，并回顧性分析RUNX3啟動子甲基化狀態(tài)與臨床病理特征、腫瘤侵襲相關(guān)基因表達的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1臨床資料 以我院2017年1月至2018年1月期間收治入院的65例非小細胞肺癌患為研究對象，采集病理組織樣本和臨床資料。其中，男性患者44例，女性患者21例，年齡41～75歲，平均年齡58.2歲。所有組織標本均以病理學診斷為金標準，其中鱗癌26例，腺癌39例，均未進行放化療。臨床分期結(jié)果顯示，Ⅰ期6例，Ⅱ期7例，Ⅲ期23例，Ⅳ期29例。所有實驗均在我院倫理委員會審核后進行。

1.1.2試劑及引物 DNA純化試劑盒購于美國Promrga公司，EZ DNA甲基化試劑盒(EZ DNA methylation-gold kitTM)購于美國Zymo Research 生物科技公司，CpG甲基化酶購于美國NEB公司，2×Tag PCR MasterMix 購買于北京天根生化科技公司，RUNX3用于nMSP的引物由Invitrogen公司合成，3對引物序列如表1所示。兔抗人E-Cad、MMP-7和TIMP-1蛋白單克隆抗體，S-P免疫組織化學染色試劑盒均購買于美國SantaCruz生物科技公司。

1.2方法

1.2.1組織總DNA提取和nMSP 將組織標本未解凍時迅速用眼科剪剪碎，然后研磨碎，按照DNA純化試劑盒說明提取組織DNA。由于普通MSP提取甲醛固定石蠟包埋后的腫瘤組織的DNA量太少，因此采用nMSP方法以擴增出清晰的目的基因條帶。nMSP操作步驟嚴格按照試劑盒說明書要求執(zhí)行。

表1nMSP引物序列

Tab.1SequenceofnMSPprimer

PrimerSequenceFragment size(bp)Peripheral primers5′-ATTTTTTAGAATTAAGTGG-3′2335′-AACCCTAAACTATAACACTAAA-3′M primer5′-GCGTCGTATAGTTAATCGGC-3′1235′-CTCCTCCGCGAAATAACG-3′U primer5′-GTGTTGTATAGTTAATTGGT-3′1235′-CTCCTCCACAAAATAACA-3′

1.2.2S-P染色法 S-P染色主要步驟如下：①切片經(jīng)二甲苯脫去包裹的蠟并進行梯度乙醇水化；②3%雙氧水常溫封閉15 min；③ddH2O沖洗，磷酸緩沖液(PBS，pH 7.2～7.4)振動洗滌3次，每次5 min；④滴加0.5%胰蛋白酶消化20 min，并用PBS振動洗滌3次，每次5 min；⑤滴加孵育用胎牛血清，室溫封閉30 min，緩慢引出封閉液，勿洗，滴加相應的兔抗人E-Cad、MMP-7和TIMP-1蛋白單克隆抗體，4℃過夜后并用PBS振動洗滌3次，每次5 min；⑥滴加通用型生物素標記的羊抗兔IgG，室溫孵育30 min后PBS振動洗滌3次，每次5 min；⑦DAB顯色2～5 min，蒸餾水沖洗后蘇木素復染1 min；⑧自來水充分沖洗，蒸餾水一過性洗滌，梯度酒精常規(guī)脫水后二甲苯透明；⑨中性樹膠封片，并以PBS作為一抗設(shè)置為陰性對照組。

1.2.3細胞計數(shù) 在相同拍照條件下使用光鏡攝片，觀察免疫組織化學染色結(jié)果。采用Image J軟件對陽性細胞進行計數(shù)。陽性細胞數(shù)<10%記為陰性(-)，10～25%為弱陽性(+)，26～50為中度陽性(++)，≥51為強陽性(+++)。

1.3統(tǒng)計學分析 采用SPSS16.0主程序進行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料以%表示，采用χ2檢驗，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1NSCLC組織RUNX3基因啟動子區(qū)甲基化與臨床病理特征的關(guān)系 65例NSCLC患者中有27例NSCLC組織RUNX3基因啟動子區(qū)CpG島出現(xiàn)異常的過度甲基化，檢出率為41.54%。并且NSCLC組織RUNX3基因啟動子區(qū)CpG島異常甲基化與病理類型有關(guān)，腺癌(81.48%)高于鱗癌(18.52%，P=0.003)；且與臨床分期也有關(guān)(P=0.03)，主要分布于Ⅲ期(55.56%)和Ⅳ期(33.33%)。其余臨床病例特征差異均未見統(tǒng)計學意義(P>0.05，見表2)。RUNX3啟動子甲基化狀態(tài)電泳圖如圖1所示。

2.2RUNX3基因啟動子區(qū)甲基化與E-Cad蛋白表達的關(guān)系 E-Cad蛋白的陽性表達率為56.92%(見表3)。RUNX3基因啟動子區(qū)甲基化組E-Cad蛋白的陽性表達率為39.47%，RUNX3基因啟動子區(qū)未甲基化組E-Cad蛋白的陽性表達率為81.48%，差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表4)。

2.3RUNX3基因啟動子區(qū)甲基化與MMP7蛋白表達的關(guān)系 MMP7蛋白的陽性表達率為46.15%(見表5)。RUNX3基因啟動子區(qū)甲基化組MMP7蛋白的陽性表達率為55.26%，RUNX3基因啟動子區(qū)未甲基化組MMP7蛋白的陽性表達率為33.33%，差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表6)。

表2RUNX3基因啟動子甲基化狀態(tài)與NSCLC患者臨床病理特征的關(guān)系

Tab.2RelationshipbetweenmethylationstatusofRUNX3geneandclinic-pathologicalfeaturesinNSCLCpatients

Clinical pathol-ogical featuresPromoter methylation status of RUNX3Methylated(27)Unmethylated(38)χ2PGenderMan18260.0220.882Woman912Age<6010110.4720.492≥601727Smoking statesYes21290.0190.890No69Pathological typeSquamous cell carcinoma5218.8800.003Adenocarcinoma2217Clinic stageⅠ248.9350.030Ⅱ16Ⅲ158Ⅳ920

圖1 RUNX3啟動子甲基化狀態(tài)電泳圖

2.4RUNX3基因啟動子區(qū)甲基化與TIMP1蛋白表達的關(guān)系 TIMP1蛋白的陽性表達率為52.31%(見表7)。RUNX3基因啟動子區(qū)甲基化組TIMP1蛋白的陽性表達率為34.21%，RUNX3基因啟動子區(qū)為甲基化組TIMP1蛋白的陽性表達率為77.78%，差異具有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表8)。

表3E-Cad蛋白在NSCLC組織中的表達情況

Tab.3ExpressionlevelofE-CadproteinintissueofNSCLC

nE-Cad protein expression-++++++PositivenPositive rate(%)NSCLC65281113133756.92

表4RUNX3基因啟動子甲基化狀態(tài)與E-Cad蛋白表達的關(guān)系

Tab.4RelationshipbetweenmethylationstatusofRUNX3genepromoterandexpressionofE-Cad

Groups nE-Cad protein(+)Positive rate(%)RUNX3 promotor(+)271539.47RUNX3 promotor(-)382281.481)

Note：1)P<0.05，vs RUNX3 promoter(+) group.

表5MMP7蛋白在NSCLC組織中的表達情況

Tab.5TheexpressionlevelofMMP7proteinintissueofNSCLC

nMMP7 protein expression-++++++positivenPositive rate(%)NSCLC6535511143046.15

表6RUNX3基因啟動子甲基化狀態(tài)與MMP7蛋白表達的關(guān)系

Tab.6RelationshipbetweenmethylationstatusofRUNX3genepromoterandexpressionofMMP7

GroupsnMMP7 protein(+)Positive rate(%)RUNX3 protein(+)272155.26RUNX3 protein(-)38933.331)

Note：1)P<0.05，vs RUNX3 protein(+) group.

表7TIMP1蛋白在NSCLC組織中的表達情況

Tab.7ExpressionlevelofTIMP1proteinintissueofNSCLC

nTIMP1 protein expression-++++++PositivenPositive rate(%)NSCLC6531810163452.31

表8RUNX3基因啟動子甲基化狀態(tài)與TIMP1蛋白表達的關(guān)系

Tab.8RelationshipbetweenmethylationstatusofRUNX3genepromoterandexpressionofTIMP1

Groups nTIMP1 protein(+)Positive rate(%)RUNX3 protein(+)271334.21RUNX3 protein(-)382177.781)

Note：1)P<0.05，vs RUNX3 protein(+) group.

3 討論

浸潤和轉(zhuǎn)移是腫瘤細胞重要的生物學特征及行為，也是引起腫瘤高死亡率的主要原因[11]。本研究主要分析了65例NSCLC組織中抑癌基因RUNX3啟動子CpG島區(qū)域甲基化狀態(tài)與患者臨床病理特征的關(guān)系，并在此基礎(chǔ)上，通過免疫組織化學染色進一步分析了RUNX3啟動子CpG島區(qū)域甲基化與腫瘤侵襲相關(guān)基因E-Cad、MMP-7和TIMP-1蛋白表達之間的關(guān)系。研究結(jié)果表明，NSCLC組織RUNX3基因啟動子區(qū)CpG島異常甲基化與病理類型有關(guān)，且腺癌(81.48%)高于鱗癌(18.52%，P=0.003)，這與臨床上NSCLC中腺癌患者多于鱗癌患者的分布比例較為一致，與之前的報道結(jié)果相似[12]；并且NSCLC組織RUNX3基因啟動子區(qū)CpG島異常甲基化與臨床分期也有關(guān)(P=0.03)，而且主要分布于Ⅲ期(55.56%)和Ⅳ期(33.33%)，這與以往的報道結(jié)果較為相符[13]。

既往研究表明，腫瘤細胞可以脫離原發(fā)灶，黏附于細胞外基質(zhì)，通過降解基質(zhì)實現(xiàn)他處侵襲和轉(zhuǎn)移[14,15]。因此，細胞間黏附作用的破壞有利于腫瘤細胞實現(xiàn)侵襲和轉(zhuǎn)移。研究結(jié)果顯示，上皮鈣黏附(E-Cad)蛋白的陽性表達率為56.92%(見表3)。RUNX3基因啟動子區(qū)甲基化組E-Cad蛋白的陽性表達率為39.47%，RUNX3基因啟動子區(qū)未甲基化組E-Cad蛋白的陽性表達率為81.48%，差異具有顯著統(tǒng)計學意義，提示RUNX3基因啟動子區(qū)甲基化后，抑癌基因RUNX3沉默，E-Cad的表達也會降低，因此RUNX3基因可能促進E-Cad的表達，增強腫瘤細胞與細胞的黏附性，從而防止腫瘤細胞從癌巢擴散。

亦有研究表明，基質(zhì)金屬蛋白酶7(MMP7)是其家族最小的分子，可以降解細胞外間質(zhì)，為腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移提供合適的路徑[16,17]。新近研究表明，MMP7在多種腫瘤細胞中過度表達。我們的研究結(jié)果顯示，MMP7蛋白的陽性表達率為46.15%(見表5)。RUNX3基因啟動子區(qū)甲基化組MMP7蛋白的陽性表達率為55.26%，RUNX3基因啟動子區(qū)未甲基化組MMP7蛋白的陽性表達率為33.33%，差異有顯著統(tǒng)計學意義。提示MMP7與腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，這與既往報道較為一致[18,19]。

TIMP1基因表達的蛋白是一種MMPs的天然抑制劑，已有報道稱，給予TIMP1蛋白可以顯著減少腫瘤高表達的MMPs對細胞外基質(zhì)的降解[20，21]。因此，TIMP1也成為腫瘤治療的熱點分子。本研究結(jié)果顯示NSCLC組織中TIMP1蛋白的陽性表達率為52.31%(見表7)。RUNX3基因啟動子區(qū)甲基化組TIMP1蛋白的陽性表達率為34.21%，RUNX3基因啟動子區(qū)為甲基化組TIMP1蛋白的陽性表達率為77.78%，差異有顯著統(tǒng)計學意義。進一步說明RUNX3基因啟動子區(qū)甲基化可以抑制TIMP1蛋白的表達，進而促進腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。

綜上所述，在NSCLC組織中，首先RUNX3基因啟動子區(qū)甲基化在鱗癌的發(fā)生率高于腺癌，并且集中與臨床分期中的Ⅲ、Ⅳ期。其次，RUNX3基因啟動子區(qū)甲基化可以抑制E-Cad的表達，降低腫瘤細胞與細胞的黏附性，從而促進腫瘤細胞從癌巢擴散；并且，MMP7的表達會進一步加速腫瘤細胞外基質(zhì)的降解，TIMP1表達降低，MMP7亦會表達增加，更加促進了腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。因此，臨床上監(jiān)測RUNX3基因啟動子區(qū)甲基化的程度有望為NSCLC患者的診療帶來福音。