吳 成，王春曉*，王曉丹，周鴻翔，黃永光，邱樹毅*

（貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025）

中國(guó)酒類產(chǎn)品種類豐富，包括白酒、米酒、黃酒、啤酒及葡萄酒等，均具有悠久的釀造歷史，各具獨(dú)特的風(fēng)味。其中，茅臺(tái)酒、紹興黃酒及煙臺(tái)張?jiān)Ｆ咸丫频犬a(chǎn)品更是以其獨(dú)特的風(fēng)味聞名于世。據(jù)報(bào)道，2009年，中國(guó)白酒年消費(fèi)量已超過40億 t[1]，深受國(guó)內(nèi)外消費(fèi)者的喜愛。中國(guó)酒類產(chǎn)品的獨(dú)特風(fēng)味與其釀造過程中微生物的消長(zhǎng)演替相關(guān)，細(xì)菌、酵母菌、霉菌等微生物在其生產(chǎn)及風(fēng)味形成過程中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。釀酒原料、釀造工藝、地理位置及氣候條件等因素會(huì)影響釀酒微生物群落結(jié)構(gòu)，因此，釀酒微生物多樣性與中國(guó)各酒類產(chǎn)品的風(fēng)味特征息息相關(guān)[2]。

自1904年日本學(xué)者齊藤研究中國(guó)紹興酒中釀酒微生物的多樣性至今已有100多年的歷史[3]。起初對(duì)釀酒微生物多樣性的研究主要依賴于傳統(tǒng)的技術(shù)手段，得到的研究結(jié)果具有一定的局限性?，F(xiàn)代分子生物技術(shù)的發(fā)展促進(jìn)了越來(lái)越多不依賴于培養(yǎng)的技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用。對(duì)葡萄酒釀造過程中微生物多樣性的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，原位雜交技術(shù)[4]、實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time?quantitative?polymerase chain reaction，qPCR）[5]、基因芯片技術(shù)[6]、變性凝膠梯度電泳技術(shù)[7-8]及高通量測(cè)序技術(shù)[9]等不依賴于培養(yǎng)的技術(shù)，的確有助于對(duì)處于存活但不可培養(yǎng)狀態(tài)的菌群或細(xì)胞濃度較低菌群的檢測(cè)、鑒定及定量分析[10-11]。近年來(lái)，由于高通量測(cè)序技術(shù)具有測(cè)序時(shí)間短、測(cè)序通量高的優(yōu)勢(shì)，國(guó)內(nèi)外研究者將該技術(shù)應(yīng)用于釀酒微生物多樣性的研究中，促進(jìn)了研究者對(duì)于釀酒微生物多樣性的認(rèn)識(shí)。本文在介紹高通量測(cè)序技術(shù)的基礎(chǔ)上，分析其在釀酒微生物多樣性研究中的應(yīng)用情況，旨在為中國(guó)酒類產(chǎn)品的發(fā)酵機(jī)理、質(zhì)量與風(fēng)味控制等相關(guān)領(lǐng)域的深入研究提供理論指導(dǎo)。

1 高通量測(cè)序技術(shù)簡(jiǎn)介

高通量測(cè)序又稱下一代測(cè)序、大規(guī)模測(cè)序等，由第一代測(cè)序技術(shù)即Maxam-Gilbert和Sanger測(cè)序發(fā)展而來(lái)[12]。與第一代測(cè)序技術(shù)相比，高通量測(cè)序技術(shù)可以在較短的時(shí)間內(nèi)對(duì)數(shù)以千計(jì)甚至百萬(wàn)計(jì)的序列進(jìn)行檢測(cè)分析。因此，高通量測(cè)序技術(shù)不僅有利于復(fù)雜微生物群落多樣性的快速分析，而且可以檢測(cè)到低存在率的微生物以及存活但不可培養(yǎng)的微生物，從而提供更為全面的微生物群落信息。

近年來(lái)，結(jié)合本課題組采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)酒樣（如白酒釀造過程中的大曲、葡萄酒釀造過程中的發(fā)酵液等）中微生物群落多樣性進(jìn)行的研究可知，高通量測(cè)序技術(shù)流程一般包括采樣、提取及純化核酸序列、構(gòu)建文庫(kù)、測(cè)序、原始序列信息比對(duì)注釋、數(shù)據(jù)分析等步驟（圖1）[10,12-15]。整個(gè)技術(shù)流程中，關(guān)于高通量測(cè)序平臺(tái)的選擇和數(shù)據(jù)分析方法的使用兩方面的報(bào)道較少，而其對(duì)微生物多樣性的研究十分重要，因此本文在技術(shù)部分將著重介紹這兩方面的內(nèi)容。

圖1 高通量測(cè)序技術(shù)流程圖（針對(duì)釀酒微生物多樣性研究）[10,12-15]Fig.1 Flow chart of high-throughput sequencing technology applied to analyze the diversity of microbial communities involved in the fermentation of alcoholic beverages[10,12-15]

1.1 高通量測(cè)序平臺(tái)

目前可采用的高通量測(cè)序平臺(tái)主要包括Roche 454焦磷酸測(cè)序平臺(tái)、Illumina測(cè)序平臺(tái)、SOLiD測(cè)序平臺(tái)、Ion Torrent測(cè)序平臺(tái)和PacBio SMRT測(cè)序平臺(tái)（第三代測(cè)序平臺(tái)）。這五大主要測(cè)序平臺(tái)在測(cè)序原理、測(cè)序試劑、序列讀取長(zhǎng)度、測(cè)序數(shù)量等方面都存在差異（表1）[9,16-20]。由于釀酒微生物特定核酸片段序列長(zhǎng)度一般在1 000 bp以內(nèi)，因此在微生物多樣性研究中較常采用的為Roche 454和Illumina測(cè)序平臺(tái)。

1.2 高通量測(cè)序技術(shù)常用的數(shù)據(jù)分析方法

高通量測(cè)序平臺(tái)輸出的是原始序列數(shù)據(jù)reads，研究者一般將其分類鑒定為可操控分類單元（operational taxonomic units，OTUs）后再進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。OTUs的獲取主要通過與已建立的基因數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)以獲得分類學(xué)注釋。但是，數(shù)據(jù)庫(kù)中未儲(chǔ)備信息的菌種無(wú)法得到分類鑒定。目前，常用的基因數(shù)據(jù)庫(kù)有GenBank[21]、RDP[22]、SILVA[15]、Greengenes[23]和UNITE[24]等。近年來(lái)研究者廣泛使用Mothur[25]和QIIME[26]進(jìn)行分類學(xué)注釋及后續(xù)統(tǒng)計(jì)分析。在后續(xù)的分析中，常用的多元統(tǒng)計(jì)學(xué)方法有聚類分析、判別分析、排序分析、相關(guān)性分析和差異性分析等[27]。采取合適的數(shù)據(jù)分析策略可以準(zhǔn)確反映釀酒微生物群落的多態(tài)性，溯源酒類產(chǎn)品的風(fēng)味物質(zhì)，把握釀酒微生物與環(huán)境因子的相互作用以及調(diào)控其中的健康因子和有害物種等[28]。在釀酒微生物多樣性分析研究中常用的數(shù)據(jù)分析方法包括主成分分析（principal component analysis，PCA）、典型相關(guān)分析（canonical correlation analysis，CCA）及相對(duì)豐度熱圖。

表1 5 種高通量測(cè)序平臺(tái)的測(cè)序原理、讀取序列長(zhǎng)度和優(yōu)缺點(diǎn)[9,16-20]Table1 Principle, sequencing length, merits and drawbacks of fi ve different high-throughput sequencing platforms[9,16-20]

1.2.1 PCA

PCA是多元統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法的一種。主要是通過對(duì)大量的樣本原始數(shù)據(jù)進(jìn)行降維處理，從而分析樣本之間差異性，并且可以對(duì)不同樣本進(jìn)行歸類分析。PCA可使用SPSS、CANOCO等軟件進(jìn)行分析，其分析結(jié)果一般可通過得分圖和載荷圖體現(xiàn)。前者可以反映出各樣本之間的差異性，而后者則可以反映出導(dǎo)致樣本間產(chǎn)生差異性的具體原因[29-32]。PCA將測(cè)序數(shù)據(jù)反映在坐標(biāo)軸行與行、行與列及列與列之間，直接反映其獲得的主成分得分及變量得分，可為其他分析提供基礎(chǔ)。但是，PCA中各樣本間關(guān)系僅通過散點(diǎn)間距衡量，結(jié)果判斷帶有較強(qiáng)的主觀性。本課題組采用高通量測(cè)序方法對(duì)3 種醬香型白酒中細(xì)菌微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，采用PCA可以區(qū)分出3 種醬香型白酒大曲，并指出了產(chǎn)生差異的原因[33]。

1.2.2 CCA

CCA是利用綜合變量之間的相關(guān)關(guān)系來(lái)反映兩組指標(biāo)間整體相關(guān)性的多元統(tǒng)計(jì)分析方法。其基本原理是：基于從總體上需要把握兩組指標(biāo)之間的相關(guān)關(guān)系，分別從兩組變量中提取有代表性的兩個(gè)綜合變量U1和V1（分別為兩個(gè)變量組中各變量的線性組合），利用這兩個(gè)綜合變量之間的相關(guān)關(guān)系來(lái)反映兩組指標(biāo)之間的整體相關(guān)性。CCA可以通過CANOCO軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析。借由CCA能夠反映出釀酒微生物與環(huán)境因子之間的響應(yīng)關(guān)系[34-35]。該方法不僅可以通過雙標(biāo)圖反映物種與樣本、樣本與環(huán)境、物種與環(huán)境之間的關(guān)系，而且還可以直接通過三標(biāo)圖反映這三者之間的關(guān)系，降低干擾因素產(chǎn)生的方差。但是，CCA僅表明了其三者之間的一種趨勢(shì)關(guān)系，結(jié)果判定主觀性較強(qiáng)。Zheng Xiaowei等[34]運(yùn)用CCA闡述了汾酒大曲中微生物多樣性與環(huán)境因子（酸度、水分含量及溫度等）之間的關(guān)系，其分析結(jié)果有助于控制汾酒釀造過程。

1.2.3 相對(duì)豐度熱圖

相對(duì)豐度熱圖可以反映樣品之間的相似性以及群落結(jié)構(gòu)的相似性[36]。在相對(duì)豐度熱圖中，每一個(gè)色塊代表一個(gè)樣品的物種分類學(xué)信息（相對(duì)豐度）。一般而言，樣品橫向排列，物種分類學(xué)信息縱向排列。相對(duì)豐度熱圖可以采用R軟件（http://www.r-projict.org/）或HemI軟件（http://hemi.biocuckoo.org/down.php）進(jìn)行繪制。除此之外，不同測(cè)序公司也會(huì)基于高通量測(cè)序所得的原始序列數(shù)據(jù)，為研究者免費(fèi)提供某些數(shù)據(jù)分析服務(wù)，其中也包括相對(duì)豐度熱圖。相對(duì)豐度熱圖不僅能夠?qū)ξ锓N進(jìn)行聚類分析，并且注釋有詳細(xì)的物種豐度信息，研究者借此即可直觀地對(duì)樣本中的物種進(jìn)行分析。Tang Jing等[36]采用相對(duì)豐度熱圖反映出了兩種醬香型白酒大曲中細(xì)菌群落多樣性的異同，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步分析了其與醬香型白酒風(fēng)味物質(zhì)間的關(guān)系。

2 高通量測(cè)序技術(shù)在釀酒微生物多樣性研究中的應(yīng)用現(xiàn)狀

近年來(lái)，高通量測(cè)序技術(shù)在酒類產(chǎn)品釀酒微生物多樣性的研究中得到了越來(lái)越多的關(guān)注和應(yīng)用，涵蓋了白酒、葡萄酒和其他酒類（表2）。其應(yīng)用主要集中在對(duì)釀酒微生物進(jìn)行分類鑒定、監(jiān)測(cè)發(fā)酵過程中釀酒微生物群落動(dòng)態(tài)變化、追溯酒類風(fēng)味物質(zhì)以及辨別酒類產(chǎn)品是否摻假等方面[2]。

2.1 高通量測(cè)序技術(shù)在白酒微生物多樣性研究中的應(yīng)用

在白酒領(lǐng)域，高通量測(cè)序技術(shù)多用于研究酒曲中釀酒微生物的多樣性，對(duì)于窖泥和酒醅也有相關(guān)報(bào)道。高通量測(cè)序技術(shù)在白酒領(lǐng)域主要集中于對(duì)細(xì)菌多樣性的分析，酒樣主要為醬香、清香、濃香3 種香型。本課題組主要針對(duì)醬香型白酒大曲中微生物多樣性進(jìn)行研究，采用Roche 454焦磷酸測(cè)序平臺(tái)對(duì)3 種醬香型白酒大曲中細(xì)菌菌群進(jìn)行了測(cè)序，發(fā)現(xiàn)在3 種醬香型大曲中共檢測(cè)到35 種細(xì)菌科，并且首次在醬香型大曲中報(bào)道了芽孢乳桿菌科、鏈霉菌科、假單胞菌科、多孢放線菌科及柄桿菌科等細(xì)菌。同時(shí)，通過采用PCA作圖，進(jìn)一步分析出3 種醬香型大曲差異性的原因[33]。運(yùn)用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)醬香型白酒不同發(fā)酵輪次酒中微生物多樣性的研究也有報(bào)道[37-38]。本課題組采用高通量測(cè)序技術(shù)比較了不同輪次酒醅中的細(xì)菌與真菌群落結(jié)構(gòu)的異同：發(fā)現(xiàn)醬香型白酒發(fā)酵過程3 輪次酒醅中細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌屬為乳桿菌屬和芽孢桿菌屬，真菌優(yōu)勢(shì)菌屬為嗜熱真菌屬和嗜熱子囊菌屬；而發(fā)酵7 輪次酒醅中細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌屬為鹽單胞菌屬，真菌優(yōu)勢(shì)菌屬為隱球菌屬[37]。此外，Zhang Xiuhong等[13]采用Roche 454 GS FLX測(cè)序平臺(tái)，對(duì)清香型白酒不同大曲中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究，結(jié)果表明清香型白酒不同大曲中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)有較大差異。Zheng Qi等[39]采用Illumina測(cè)序平臺(tái)探究了濃香型白酒不同年份窖池中窖泥微生物群落多樣性及其與風(fēng)味成分間的關(guān)系。

2.2 高通量測(cè)序技術(shù)在葡萄酒微生物多樣性研究中的應(yīng)用

在葡萄酒領(lǐng)域，高通量測(cè)序多用于研究發(fā)酵過程中微生物的多樣性及動(dòng)態(tài)變化，對(duì)葡萄表面的微生物多樣性也有相關(guān)報(bào)道。Portillo等[40]采用Ion Torrent PGM測(cè)序平臺(tái)對(duì)西班牙Priorat地區(qū)不同葡萄園中歌海娜和佳麗釀葡萄表皮上細(xì)菌群落多樣性進(jìn)行了研究，并研究其與地理環(huán)境間的關(guān)系。結(jié)果表明厚壁菌門（Firmicutes）、變形桿菌門（Proteobacteria）和放線菌門（Actinobacteria）為主要的優(yōu)勢(shì)菌，且地理環(huán)境分布對(duì)發(fā)酵過程中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)影響明顯。Wang Chunxiao等[10]采用傳統(tǒng)的分離鑒定技術(shù)、高通量測(cè)序技術(shù)、變性梯度凝膠電泳技術(shù)和qPCR技術(shù)等不依賴于培養(yǎng)的技術(shù)，對(duì)產(chǎn)自西班牙Priorat地區(qū)3 個(gè)葡萄園中的歌海娜和佳麗釀葡萄發(fā)酵過程中的酵母菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了相關(guān)研究。結(jié)果表明，與其他方法相比，高通量測(cè)序技術(shù)雖無(wú)法進(jìn)行定量檢測(cè)，但可檢測(cè)到絕大多數(shù)的非釀酒酵母菌屬。

2.3 高通量測(cè)序技術(shù)在其他酒類微生物多樣性研究中的應(yīng)用

高通量測(cè)序技術(shù)還被應(yīng)用于黃酒、米酒、安第斯吉開酒（chicha）等其余酒類領(lǐng)域中，已成功揭示了其各自發(fā)酵液或酒曲中的微生物多樣性。Xie Guangfa等[41]采用Illumina?HiSeq?2000測(cè)序平臺(tái)從門、屬分類學(xué)水平對(duì)不同發(fā)酵時(shí)間段紹興黃酒釀酒微生物多樣性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明發(fā)酵初期和后期其微生物群落結(jié)構(gòu)截然不同，優(yōu)勢(shì)微生物的種類和數(shù)量發(fā)生明顯變化。Mendoza等[21]采用Roche 454 GS Junior測(cè)序平臺(tái)從安第斯吉開酒發(fā)酵過程中檢測(cè)出超過100 種酵母菌，其中超過一半的酵母菌歸屬于絲狀真菌屬。

可見，雖然高通量測(cè)序技術(shù)被應(yīng)用于不同的研究領(lǐng)域和樣本，但目前針對(duì)釀酒微生物多樣性分析相關(guān)研究所使用的測(cè)序目標(biāo)片段、方法和平臺(tái)具有相似性。而且，對(duì)于相同的釀酒微生物，采取不同的測(cè)序目標(biāo)片段或方法都會(huì)影響測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確度及精確度[10,42-44]。一般對(duì)于原核微生物常選用的測(cè)序片段為16S rDNA V1～V9各變異區(qū)片段，而對(duì)于真核微生物而言，常選取的測(cè)序片段為18S rDNA、26S rDNA D1/D2區(qū)和內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）等。數(shù)據(jù)庫(kù)的選用也會(huì)影響微生物鑒定的準(zhǔn)確性，本課題組利用RDP、SILVA和GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)葡萄酒中的真核微生物鑒定分析的對(duì)比結(jié)果表明，GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)更適用于真核微生物尤其是酵母菌的鑒定：其可以實(shí)現(xiàn)種水平上的鑒定；并且具備較高的菌種鑒定置信度，利于準(zhǔn)確的種水平上菌株的鑒定[10]。目前，原核微生物的相關(guān)研究中主要選用的數(shù)據(jù)庫(kù)為RDP和SILVA，但是尚鮮有相關(guān)報(bào)道對(duì)這兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，本課題組擬在后期工作中開展相關(guān)研究。

2.4 不同酒類發(fā)酵過程中的微生物組成差異

聚焦至不同酒類的發(fā)酵過程，高通量測(cè)序的結(jié)果表明了更明顯的微生物組成差異。目前，采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)醬香型白酒微生物多樣性的研究主要集中于揭示其細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)方面，測(cè)序發(fā)現(xiàn)主要的微生物為芽孢桿菌（Bacillaceae）和乳酸菌屬（Lactobacillus）等。而對(duì)醬香型白酒中真核微生物群落結(jié)構(gòu)也有相關(guān)報(bào)道，發(fā)現(xiàn)了嗜熱真菌屬（Thermomyces）、熱子囊菌屬（Thermascus）、隱球酵母屬（Cryptococcus）、青霉菌屬（Penicillium）等[14,33,36-38]。在濃香型白酒發(fā)酵過程中，發(fā)現(xiàn)厚壁菌屬（Firmicutes）、放線菌屬（Actinobacteria）、醋酸桿菌屬（Acetobacter）、乳酸菌屬（Lactobacillus）、甲烷桿菌屬（Methanobacterium）等為主要的微生物[12,39,45-47]。在清香型白酒發(fā)酵過程中報(bào)道的主要微生物為厚壁菌屬（Firmicutes）和放線菌屬（Actinabacteria）[13,48]。不同白酒中微生物群落結(jié)構(gòu)的差異是賦予白酒不同香型特征的重要原因。葡萄酒本土風(fēng)味的形成與其在發(fā)酵過程中相關(guān)酵母菌屬的消長(zhǎng)演替密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)葡萄酒發(fā)酵過程中主要的酵母菌屬包括釀酒酵母屬（Saccharomyces）、有孢漢遜酵母屬（Hansenispora）、漢生酵母屬（Hansenula）、畢赤酵母屬（Pichia）、假絲酵母屬（Candida）等。而乳桿菌屬（Lactobacillus）是葡萄酒發(fā)酵過程中主要的細(xì)菌微生物[10,49-53]。米酒作為中國(guó)傳統(tǒng)的發(fā)酵食品之一，通過對(duì)其微生物多樣性的研究發(fā)現(xiàn)，米酒中主要的微生物為芽孢桿菌屬（Bacillaceae）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、乳球菌屬（Lactococcus）、高溫放線菌屬（Thermoactinomyces）等[54-55]。高通量測(cè)序技術(shù)揭示，不同酒類的微生物組成差異主要表現(xiàn)在兩個(gè)方面：1）主要微生物菌屬（種）的種類和比例差異；2）小類微生物菌屬（種）及未知菌屬（種）的種類和比例差異。如具有復(fù)雜工藝的醬香型白酒釀造過程中發(fā)現(xiàn)了很多小類微生物菌屬和未知菌屬，雖然它們?cè)谖⑸锶郝浣Y(jié)構(gòu)中所占比例較小，通過其他技術(shù)未必能分離出來(lái)，但其構(gòu)成了醬香型白酒獨(dú)特微生物組成特征不可忽視的一面。微生物的組成差異受到多種因素的影響，首先是酒類工藝過程，其次是同種酒類工藝在不同地區(qū)的釀造過程中發(fā)現(xiàn)的微生物組成差異，體現(xiàn)了微生物分布的地域性。

表2 高通量測(cè)序技術(shù)在釀酒微生物多樣性研究中的應(yīng)用情況Table2 Recent applications of high-throughout sequencing technology to analyze the diversity of microbial communities involved in the fermentation of alcoholic beverages

續(xù)表2

3 結(jié) 語(yǔ)

從高通量測(cè)序技術(shù)誕生之日起，由于其具有測(cè)序方法簡(jiǎn)單、通量高、測(cè)序速度快和準(zhǔn)確度較高等特點(diǎn)，在醫(yī)學(xué)、食品、環(huán)境等研究領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注。隨著高通量測(cè)序技術(shù)和測(cè)序平臺(tái)的不斷發(fā)展，該技術(shù)的精確度不斷提高而成本逐漸降低，并且測(cè)序目標(biāo)序列讀取長(zhǎng)度也得到提高。因此，目前高通量測(cè)序技術(shù)已被國(guó)內(nèi)外研究者作為研究釀酒微生物多樣性的重要手段。研究者提取不同酒樣中釀酒微生物核酸后，可通過高通量測(cè)序技術(shù)直接進(jìn)行測(cè)序分析。雖然測(cè)序過程簡(jiǎn)單，但其獲取的測(cè)序數(shù)據(jù)信息量極為龐大，如何快速?gòu)闹蟹治龀鲇行У男畔⒊蔀橄拗蒲芯空卟捎么朔椒ǚ治鲠劸莆⑸锒鄻有缘氖滓蛩亍Ｈ缜拔乃?，?shù)據(jù)分析方法如PCA、CCA等的使用，有助于對(duì)釀酒微生物多樣性的分析，在此基礎(chǔ)上可進(jìn)一步建立起微生物多樣性與功能代謝產(chǎn)物之間的關(guān)聯(lián)[39]。

除此之外，高通量測(cè)序技術(shù)在應(yīng)用中還面臨著測(cè)序文庫(kù)的建立等方面的挑戰(zhàn)。在分析釀酒微生物多樣性時(shí)，測(cè)序文庫(kù)的建立及測(cè)序方法需依賴PCR技術(shù)。而在PCR過程中，若出現(xiàn)引物退火溫度不適宜、模板DNA代表性不強(qiáng)等情況，則會(huì)在一定程度上引入系統(tǒng)偏差和隨機(jī)性，從而導(dǎo)致樣本中核酸分子含量與真實(shí)含量存在偏差。因此，依賴于PCR技術(shù)的高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)樣本中目標(biāo)微生物定量分析的準(zhǔn)確度有待提升[59]。建議結(jié)合使用其他不依賴于培養(yǎng)的技術(shù)實(shí)現(xiàn)目標(biāo)微生物的準(zhǔn)確鑒定和定量分析，如qPCR技術(shù)通過建立微生物濃度與PCR循環(huán)次數(shù)之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以準(zhǔn)確進(jìn)行菌群濃度的定量分析[60]。高通量測(cè)序技術(shù)若在建立測(cè)序文庫(kù)時(shí)成功引入類似標(biāo)準(zhǔn)曲線，則將可以初步實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確的定量分析。

近年來(lái)，第三代測(cè)序[61]技術(shù)逐漸發(fā)展，如DNA納米球測(cè)序、Heliscope單分子測(cè)序、納米孔測(cè)序、隧道電流DNA測(cè)序、質(zhì)譜測(cè)序及基于顯微鏡測(cè)序技術(shù)等[59]。就SMRT測(cè)序技術(shù)而言，其在DNA聚合酶合成DNA分子的同時(shí)進(jìn)行測(cè)序，克服了PCR帶來(lái)的不確定性和偏差。與以Roche 454焦磷酸測(cè)序?yàn)榇淼牡诙鷾y(cè)序技術(shù)相比，第三代測(cè)序技術(shù)在測(cè)序速度和序列長(zhǎng)度上得到了大幅度的提升，SMRT測(cè)序技術(shù)每秒可測(cè)750 個(gè)堿基，序列長(zhǎng)度最長(zhǎng)可達(dá)1萬(wàn) 個(gè)堿基[19]。并且第三代測(cè)序平臺(tái)PacBio（P4/C2）已在PacBio（XL/C2）平臺(tái)的基礎(chǔ)上大幅度提高了精確度[20]。盡管其價(jià)格昂貴，目前第三代測(cè)序技術(shù)已開始用于釀酒微生物多樣性方面的分析[20]。相信隨著高通量測(cè)序技術(shù)的不斷完善，釀酒微生物的多樣性將得到更深入、更準(zhǔn)確、更全面的分析與研究。