呂景淑，賈莉莉，喻文立

（1.天津醫(yī)科大學(xué)一中心臨床學(xué)院麻醉科，天津300192；2.天津市第一中心醫(yī)院麻醉科，天津300192）

肝移植是終末期肝病患兒的唯一治療手段。隨著手術(shù)技術(shù)和術(shù)后管理的進(jìn)步，兒童肝移植患者術(shù)后5年生存率高達(dá)80%以上[1]。2012年以后，每年嬰幼兒患者為主的膽道閉鎖在我國兒童肝移植中的占比達(dá)到75%以上[2]。然而，大多數(shù)患兒都會(huì)發(fā)生術(shù)后神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥[3]，發(fā)生率在9%～48%之間，且明顯高于成人。肝缺血再灌注是肝移植術(shù)中必不可少的步驟，研究證明，該過程可造成多個(gè)遠(yuǎn)隔臟器如：心、肺、腎、腦、腸等的損傷[4]。異丙酚是臨床上常用的麻醉藥，大量實(shí)驗(yàn)證明，它可通過抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化[5]，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的凋亡[6-7]，減輕炎癥反應(yīng)[8]等多種途徑發(fā)揮腦保護(hù)作用。線粒體自噬是選擇性自噬的一種，對(duì)于維持細(xì)胞內(nèi)和組織內(nèi)的穩(wěn)態(tài)具有重要的作用。關(guān)于異丙酚對(duì)肝缺血再灌注后幼鼠海馬神經(jīng)元線粒體自噬的影響研究甚少，本研究就此進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 2周齡C57BL/6雄雌不分的小鼠，體質(zhì)量約6～8 g（華阜康生物科技股份有限公司提供），飼養(yǎng)在干凈、恒溫恒濕的環(huán)境中，自由攝取食物和水。隨機(jī)分為4組：假手術(shù)組(S組)，肝缺血再灌注組（IR組），異丙酚組（P組），異丙酚+自噬抑制劑3-MA組（3-MA組）。

1.2 動(dòng)物模型的構(gòu)建 參照文獻(xiàn)[9]建立小鼠70%肝熱缺血再灌注模型。術(shù)前采用50 μg/g的戊巴比妥腹腔內(nèi)注射麻醉，麻醉后將小鼠固定在手術(shù)臺(tái)上，沿腹白線縱行切口入腹，暴露手術(shù)視野，應(yīng)用棉簽將肝門附近腸管等臟器輕輕推至左髂區(qū)，游離第一肝門。用血管夾夾閉肝左、中葉脈管（門脈、動(dòng)脈與膽道）的共干，此時(shí)缺血肝葉變白，淤血肝葉顏色加深，70%的肝臟熱缺血模型造模成功。將腹腔內(nèi)臟器歸位，臨時(shí)合攏腹腔，用無菌紗布遮蓋腹壁切口，缺血1 h后松開血管夾，隨后關(guān)腹縫合切口。S組僅開腹、游離第一肝門以及1 h后關(guān)腹等操作，無血管夾閉，P造模前30 min腹腔注射異丙酚（20 mg/kg,阿斯利康，美國），3-MA組造模前30 min腹腔注射異丙酚 20mg/kg和5μL溶于PBS的3MA（100 nmol/μL），S和IR組在開腹前30 min腹腔內(nèi)注射等量乳化劑。該模型動(dòng)物死亡率約為10%，4只老鼠多死于造模初期，死亡原因主要包括麻醉意外致死（2只），手術(shù)過程粗暴導(dǎo)致流血過多（1只），血管夾閉過深（1只），每死亡1只即刻重新造模補(bǔ)齊該組的數(shù)目。

1.3 標(biāo)本采集與制作 再灌注后6 h，各組小鼠摘眼球取血標(biāo)本，3 500 r/min離心15 min，取血清，保存于-80℃以待檢測ELISA。剝離完整腦組織，一份用多聚甲醛固定保存，以備后期的石蠟切片?？焖俜蛛x腦組織中的海馬組織，用刀片切取海馬CA1區(qū)1 mm×1 mm×1 mm組織塊保存在2.5%戊二醛固定液置于4℃冰箱，以備觀察透射電鏡。將海馬組織保存于-80℃冰箱，用于后期檢測Westernblot。

1.4 ELISA法測腦損傷標(biāo)志物及炎癥因子 參照南京建成生物有限公司的試劑盒說明書，采用雙抗體夾心法，經(jīng)包被、加樣、加酶標(biāo)抗體、加底物顯色、終止反應(yīng)等步驟，最后計(jì)算出各組NSE、S100β、IL-6、TNF-α的濃度。

1.5 透射電鏡法觀察自噬小體和線粒體形態(tài) 取出2.5%戊二醛固定液固定后的海馬組織標(biāo)本，PBS沖洗3次，1%四氧化鋨固定液固定1 h，PBS清洗3次，在丙酮和雙蒸水按比例配制50%、70%、80%、90%、100%（V/V）的濃度梯度進(jìn)行脫水，進(jìn)行包埋滲透，制成超薄切片60 nm，用1%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色，在透射電子顯微鏡下觀察每個(gè)標(biāo)本海馬神經(jīng)元內(nèi)自噬小體和線粒體的形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.6 Western blot法測 LC3Ⅱ、Nix、Caspase-3 蛋白的表達(dá)情況 取冰凍海馬組織，進(jìn)行稱重，研磨，以質(zhì)量：體積=1∶10的比例加入蛋白裂解液、蛋白酶抑制劑及磷酸化酶抑制劑。腦組織勻漿放冰上裂解，每隔10 min震蕩1次，30 min后，4℃13 000 r/min離心20 min，取上清，BCA法進(jìn)行蛋白定量。配制12%聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，蛋白上樣量為50 μg，隨后轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜），室溫下5%脫脂牛奶封閉1h，TBST洗3次，每次10min，隨后加入 1：1 000 一抗 LC3Ⅱ、Nix、Caspase-3（均購于美國CST公司），置于4℃冰箱孵育過夜。TBST清洗3次，每次10 min；加入1：2 000 HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗（購于北京中杉金橋公司），于室溫下?lián)u床孵育1h，TBST清洗3次，每次10 min；加入顯色液避光顯影曝光，系統(tǒng)照相記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。采用ImageJ圖像分析軟件測定蛋白條帶的灰度值，以LC3Ⅱ、Nix、Caspase-3 分別與內(nèi)參 β-actin（1∶1 000，購于美國CST公司）灰度值的比值反應(yīng)目的蛋白的表達(dá)水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析處理。正態(tài)分布計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析。GraphPadPrism 6制造圖表分析，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組腦損傷標(biāo)志物及炎癥因子的表達(dá)水平 與S 組相比，IR 組、P 組、3-MA 組 NSE、S100β、IL-6、TNF-α均有所增加，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與IR組相比，P組的各項(xiàng)指標(biāo)下降，3-MA組各項(xiàng)指標(biāo)上升，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表 1）。

表 1 血清 NSE、S100β、IL-6、TNF-α 濃度的比較（n=10，±s）Tab 1 concentrations of NSE,S100β,IL-6 and TNF-α（n=10，±s）

表 1 血清 NSE、S100β、IL-6、TNF-α 濃度的比較（n=10，±s）Tab 1 concentrations of NSE,S100β,IL-6 and TNF-α（n=10，±s）

與 S組比較，aP＜0.05；與 IR 組比較，bP＜0.05

組別NSE/（ng/mL）S100β/（mg/mL）IL-6/（pg/mL）TNF-α/（pg/mL）S 組 14.21±0.76 1.34±0.06 36.7±2.9 42.5±4.3 IR 組 30.14±1.71a 2.06±0.13a 119.7±6.2a 105.7±6.1a P 組 23.94±2.14ab 1.73±0.08ab 78.2±3.1ab 70.5±5.9ab 3-MA 組 38.66±0.87ab 2.38±0.07ab 131.7±5.2ab 113.7±8.6ab

2.2 各組自噬體及線粒體結(jié)構(gòu) 透射電鏡可觀察到自噬小體和線粒體超微結(jié)構(gòu)，兩組結(jié)果綜合提示：與S組相比，IR組、P組、3-MA組線粒體數(shù)量均有所下降，且線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)紊亂，線粒體腫脹增加，自噬小體增多;與IR組相比，P組線粒體數(shù)量增多，線粒體結(jié)構(gòu)較完整，自噬小體數(shù)量增多，3-MA組，線粒體數(shù)量和質(zhì)量均下降，且自噬小體數(shù)量減少（圖 1）。

圖1 各組電鏡結(jié)果的比較（×5 000）Fig 1 Results of TEM in each group(×5 000)

2.3 各組LC3Ⅱ、Nix、Caspase-3蛋白的表達(dá)情況與 S組相比，IR 組、P組、3-MA 組的 LC3Ⅱ、Nix、Caspase-3蛋白表達(dá)水平上升，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），與 IR 組相比，P組的 LC3Ⅱ、Nix蛋白表達(dá)水平上升，但Caspase-3蛋白表達(dá)水平下降，3-MA組的 LC3Ⅱ、Nix蛋白表達(dá)水平下降，但Caspase-3蛋白表達(dá)水平上升，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（圖 2）。

圖2 各組LC3Ⅱ、Nix、Caspase-3蛋白的表達(dá)情況Fig 2 expressionsofLC3Ⅱ,NixandCaspase-3proteinsineachgroup

3 討論

3.1 線粒體自噬在肝缺血再灌注之腦損傷中的作用 自噬是細(xì)胞通過溶酶體降解蛋白和受損細(xì)胞器的過程，選擇性清除線粒體即為線粒體自噬。線粒體自噬是細(xì)胞實(shí)現(xiàn)線粒體質(zhì)量控制的主要途徑，對(duì)維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。Nix是定位于線粒體外膜的類BNIP3蛋白，參與了線粒體自噬的Parkin非依賴途徑。有文獻(xiàn)報(bào)道，其氨基酸序列中含有WXXL基序。Nix能通過該基序與 LC3及LC3同源物CABA受體相關(guān)蛋白結(jié)合，誘導(dǎo)線粒體自噬發(fā)生從而降解清除多余的線粒體。Zhang等證明了在低氧的情況下，可以通過BNIP3依賴的方式誘導(dǎo)激活線粒體自噬[10]。Wu等研究發(fā)現(xiàn)在缺氧狀態(tài)下，Nix可激活線粒體自噬[11]。有研究表明，Sirt1可通過恢復(fù)線粒體自噬水平減輕肝缺血再灌注損傷[12-13]。然而，SONG等實(shí)驗(yàn)研究顯示FOXO3a可通過抑制肝細(xì)胞線粒體自噬和抑制細(xì)胞凋亡減輕小鼠肝缺血再灌注損傷[14]。

在本實(shí)驗(yàn)中，相對(duì)于S組，IR組的透射電鏡結(jié)果顯示自噬小體數(shù)量增加，且線粒體腫脹明顯，線粒體自噬相關(guān)蛋白Nix、LC3Ⅱ表達(dá)量增高，凋亡蛋白Caspase-3表達(dá)量增多，腦損傷標(biāo)志物NSE、S100β和炎癥因子IL-6、TNF-α水平也明顯增加，然而加入自噬抑制劑3-MA后，線粒體自噬水平明顯降低，但電鏡結(jié)果顯示損傷的線粒體數(shù)量反而增加，凋亡蛋白Caspase-3及腦損傷標(biāo)志物NSE、S100β和炎癥因子IL-6、TNF-α水平進(jìn)一步增加。以上結(jié)果說明，肝缺血再灌注后，線粒體自噬可能起到保護(hù)作用，通過及時(shí)清除受損的線粒體，以抑制其釋放氧化自由基，從而控制氧化應(yīng)激損傷，抑制該過程則會(huì)引起炎癥反應(yīng)加劇，凋亡增加。

3.2 異丙酚對(duì)肝缺血再灌注后小鼠海馬神經(jīng)元線粒體自噬的影響 異丙酚是臨床常用的靜脈麻醉藥，現(xiàn)已有多項(xiàng)研究證明異丙酚可對(duì)自噬產(chǎn)生影響。Kim 等[15]、Chang 等[16]、Li等[17]、Yoon 等[18-19]均證實(shí)了異丙酚誘導(dǎo)自噬的產(chǎn)生，減輕氧化應(yīng)激損傷。然而，Cui等[20]、Li等[21]、Chen 等[22]、Yang 等[23]研究卻發(fā)現(xiàn)異丙酚可抑制自噬從而發(fā)揮保護(hù)或加重?fù)p傷的作用。

本實(shí)驗(yàn)研究中，與IR組相比，P組，透射電鏡結(jié)果顯示自噬小體數(shù)量增加，且線粒體結(jié)構(gòu)破壞減少，線粒體自噬相關(guān)蛋白Nix、LC3Ⅱ表達(dá)量增高，而凋亡蛋白Caspase-3表達(dá)量卻下降，腦損傷標(biāo)志物NSE、S100β和炎癥因子IL-6、TNF-α水平也明顯降低，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，線粒體自噬本身在肝缺血再灌注后起一定的保護(hù)作用，然而，IR組自噬流或許受到了一定的抑制，異丙酚可恢復(fù)肝缺血再灌注線粒體自噬流的抑制作用，或者，異丙酚可進(jìn)一步激活線粒體自噬，從而起到保護(hù)作用。

3.3 本實(shí)驗(yàn)的不足及臨床應(yīng)用建議 本實(shí)驗(yàn)研究僅僅從腦損傷標(biāo)志物和凋亡蛋白水平研究其對(duì)大腦的影響，顯然不足以對(duì)其腦保護(hù)作用下結(jié)論，并且本實(shí)驗(yàn)為短期實(shí)驗(yàn)，未研究其長期的影響結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)樣本數(shù)量偏小，結(jié)論需大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床實(shí)驗(yàn)加以證實(shí)。關(guān)于異丙酚誘導(dǎo)線粒體自噬的機(jī)制及其上下游的影響因素未進(jìn)行探討。今后應(yīng)繼續(xù)探索其具體信號(hào)通路，積極尋找在肝缺血再灌注中的腦保護(hù)措施。