趙莉邐，劉曉丹，PUREVDORJ Narangerel，王 然，李 蕾，孫續(xù)國

（天津醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗學(xué)院臨床檢驗和血液教研室，天津300203）

轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白（transthyretin，TTR),是肝臟分泌的一種具有轉(zhuǎn)運甲狀腺素、視黃醇的功能性蛋白，是在老年性系統(tǒng)性淀粉樣變（senile systemic amyloidosis，SSA)[1]及家族型多發(fā)性神經(jīng)性損害（familial amyloidotic polyneuropathy，F(xiàn)AP)[2-3]等疾病淀粉樣變的前蛋白。通過分析SSA患者發(fā)生TTR相關(guān)淀粉樣變沉積組織特點[4]，發(fā)現(xiàn)淀粉樣變主要沉積于心臟組織[5-6]、中樞神經(jīng)[7]、血管壁等，但是這些組織細胞非均表達、分泌TTR蛋白[8-9]。大量研究表明SSA患者組織器官沉積的淀粉樣變的前蛋白成分為TTR蛋白[10-12]，由于TTR為機體內(nèi)存在的一

種生理蛋白，形成淀粉樣變后可以沉積于人體的組織器官導(dǎo)致器官損害及功能障礙。探究淀粉樣變相關(guān)蛋白的代謝修飾可能有助于解析SSA淀粉樣變形成的分子機制。前期本組利用基質(zhì)飛行質(zhì)譜技術(shù)（MALDI-TOF-MS）建立直接分析血液中TTR蛋白修飾的方法[13-14]，并且最近有報道ProteomeLab PF-2D技術(shù)分析蛋白等電點的變化[15-16]，利用兩項結(jié)合可以分析SSA患者TTR蛋白的化學(xué)修飾類型，輔助解析SSA患者形成淀粉樣變的分子機制。

1 材料與方法

1.1 患者標(biāo)本收集 收集30位健康的志愿者以及經(jīng)臨床影像和病理診斷為SSA的患者的血清。

1.2 血清總蛋白、白蛋白、TRR定量 根據(jù)操作指導(dǎo)，應(yīng)用TOSHBA-120RF全自動生化分析儀測定人血清總蛋白和白蛋白含量，用UniCelDxI 800來檢測血清TTR。

1.3 蛋白分離 首先，根據(jù)操作說明將高效聚焦層析柱用于蛋白質(zhì)分離。緩沖液以0.2 mL/min的流速平衡130 min，之后手動將樣本用注射器推入層析柱內(nèi)。在第一相中，蛋白與強陰離子交換劑交換，并從pH 8.5到4.0范圍內(nèi)進行連續(xù)洗脫。40～45 min后，pH開始下降。以間隔0.2個單位的pH值在48孔深孔板中收集蛋白。應(yīng)用高效反相梯度分離蛋白，并在第二相將其分離。

1.4 免疫印跡法檢測TRR 將從層析柱中收集得到的蛋白溶解在2.0 μL溶液中，然后轉(zhuǎn)至硝酸纖維素薄膜上，并用兔抗人TTR抗體孵育1 h。應(yīng)用抗兔第二抗體孵育結(jié)合后檢測結(jié)果。

1.5 檢測硫磺素（ThT）標(biāo)記的淀粉樣纖維熒光強度 取5 μL血清，向其中加入200 μL 50 mmolThT緩沖液（pH 8.5,sigma），37°C孵育1 h后檢測。

1.6 利用 UPLC-Q-TOF/MS（Waters，America） 分析TTR蛋白的化學(xué)修飾[17]WatersACQUITYUPLC分系統(tǒng)，蛋白分離柱為BEH C18（2.1×100 mm，1.7 μm），利用 0.1%methanoic acid acetonitrile（solvent A）和0.1%methanoic acid（solvent B）試劑按照儀器操作說明仔細操作。質(zhì)譜用儀器內(nèi)標(biāo)分子為：Leucineenk ephalin（LE），C28H37N5O7 TyrGlyGlyPheLeu（M+H）+M/Z 556.2771，（M-H）-M/Z 554.2615.[Glu1]-Fib rinopetideB（GluFib），C66H95N19O26GluGlyValAs nAspAs nGluGluGlyPhePheSerAlaArg，（M+H）+M/Z 1570.6774，（M+2H）2+M/Z 785.8426，（M-H）-M/Z 1568.6618ESI。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 13.0軟件分析數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)用±s表示。兩組間均數(shù)比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床收集SSA患者的基礎(chǔ)資料 依據(jù)SSA臨床診治指南，收集SSA患者30例，同時收集年齡與性別相匹配的健康體檢志愿者30名。發(fā)現(xiàn)SSA患者與健康志愿者在3項指標(biāo)中無顯著性差異（P＞0.05）。結(jié)果見表1。

表1 患者的臨床特征Tab 1 Clinical characteristics of patients

2.2 利用PF-2D系統(tǒng)分析SSA及志愿者人群血清各個pI區(qū)域的蛋白豐度 利用PF-2D分析系統(tǒng)，分選各個等電點的蛋白質(zhì)，兩項電解質(zhì)的pH分別為pH4.0及pH8.0。利用波長208 nm直接檢測蛋白的相對強度，以每0.2pH為一個樣品采集點，采集各個pI點的蛋白質(zhì)。SSA患者結(jié)果在pH8.1～pH8.0、pH 6.42范圍、pH 5.69范圍及pH 4.49范圍內(nèi)存在高蛋白豐度（圖 1a，b，c，d）。同樣分析方法分析健康志愿者，結(jié)果在 pH 8.1～pH 8.0，pH 6.51 范圍、pH6.18 范圍及 pH 4.49 范圍發(fā)現(xiàn)高豐度蛋白（圖 1a，b，c，d）。

2.3 進一步分析SSA及志愿者TTR蛋白的pI為分析各個pH值范圍內(nèi)可存在TTR蛋白，利用點免疫印跡的方法鑒定TTR的存在，結(jié)果在pH6.8-pH5.8范圍及pH 4.0-pH 4.5范圍發(fā)現(xiàn)高豐度TTR蛋白（圖 1）。

圖1使用ProteomeLab PF-2D系統(tǒng)對SAA患者和健康志愿者血清蛋白進行色譜分析Fig 1 Chromatographic analysis of serum proteins of SAA patients and healthy volunteers using ProteomeLab PF-2D

2.4 利用ThT測定各個部分收集液中淀粉樣變的強度 利用ThT熒光試劑為一種可以檢測淀粉樣變成分含量的一種特異性試劑，可以分析被檢測部分淀粉樣變成分的濃度，結(jié)果見表2，SSA患者pH6.40~pH6.60范圍內(nèi)，淀粉樣變成分顯著高于對照組。

表2 血清淀粉樣蛋白在每段pH范圍形成的熒光強度Tab 2 The fluorescence intensity of serum amyloid formation in each pH fraction

2.5 利用MALDI-TOT-MS分析TTR蛋白的化學(xué)修飾 對上述各個部分的TTR均進行質(zhì)譜分析，TTR蛋白發(fā)生的修飾類型結(jié)果見表3及圖2。對于利用質(zhì)譜技術(shù)解析TTR蛋白發(fā)生化學(xué)修飾類型及發(fā)生位點，其標(biāo)記結(jié)果見圖3。

表3 血清TTR在每段pH范圍中的修飾Tab 3 The serum TTR modification in each pH fraction

圖2 SSA患者和健康志愿者的TTR修飾鑒定Fig 2 Identification of the TTR modification in those collected fraction in SSA patients and Healthy volunteers

圖3 TTR氨基酸位點修飾組化學(xué)結(jié)構(gòu)總結(jié)Fig 3 Summarizing chemical structure of the modified group in TTR amino acid sites

3 討論

TTR蛋白的野生型(w-TTR)及發(fā)生基因突變的突變型（m-TTR）均可發(fā)生淀粉樣變沉積，突變型TTR形成淀粉樣變沉積發(fā)生于FAP患者，并且在雜合子FAP患者中約50%沉積的淀粉樣變?yōu)閣-TTR，說明野生型TTR也能夠形成淀粉樣變沉積[10]。

最近有學(xué)者利用PF-2D系統(tǒng)分選蛋白，而淀粉樣變蛋白研究的難點是在分析過程中不能改變相關(guān)蛋白分子結(jié)構(gòu)，根據(jù)我們掌握的文獻，利用PF-2D分析淀粉樣變蛋白尚未見報道[18-19]，本論文依據(jù)蛋白pI的分選系統(tǒng)收集SSA患者及健康志愿者血清，確實發(fā)現(xiàn)在 pH 8.1～pH 8.0范圍、pH 6.8～pH 5.8范圍以及pH 4.0～pH 4.6范圍存在高豐度蛋白，這些蛋白是否存在TTR蛋白有待于進一步鑒定。

為進一步鑒定TTR蛋白存在的范圍，采用抗人TTR抗體，點免疫印跡的方法鑒定TTR蛋白存在的部分，結(jié)果在pH8.0～pH8.1范圍，SSA患者與志愿者人群均存在大量TTR蛋白。在pH 6.8～pH 5.8范圍及pH 4.0～pH 4.6范圍中，SSA患者與健康志愿者存在高豐度的pI發(fā)生改變，SSA患者在pH6.42范圍明顯增高，并且化學(xué)修飾類型發(fā)生改變，定量分析淀粉樣變沉積成分定量也發(fā)現(xiàn)明顯高于健康志愿者。SSA患者TTR與健康志愿者的TTR蛋白為w-TTR，即兩組TTR蛋白質(zhì)的氨基酸順序、類型沒有改變，兩組TTR蛋白的pI應(yīng)當(dāng)相同，造成已經(jīng)pI能夠分選TTR蛋白的理論基礎(chǔ)是TTR蛋白發(fā)生化學(xué)修飾，實驗結(jié)果也顯示TTR蛋白存在于不同的pH范圍之內(nèi)，說明TTR蛋白在人機體內(nèi)能夠發(fā)生化學(xué)修飾，以前也有報道TTR蛋白存在2個不同的pI，支持本實驗結(jié)果。

總結(jié)上述實驗發(fā)現(xiàn)SSA患者及健康志愿者血清TTR蛋白均存在化學(xué)修飾，但是SSA患者TTR蛋白在pI 6.42范圍發(fā)生修飾的類型與健康志愿者不同，且淀粉樣變成分含量顯著高于對照組，提示機體代謝過程中TTR蛋白可發(fā)生化學(xué)修飾，其修飾類型與淀粉樣變形成的相關(guān)性有待進一步研究。

（致謝感謝王卓偉在UPLC-MS/MS技術(shù)上的幫助）