朱思潔，吳天祥*，孫世平，朱俊杰

（1.茅臺學(xué)院 食品科學(xué)與工程系，貴州 仁懷564500；2.貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽550025）

灰樹花（Grifola frondosa）在日本稱之“舞茸”（maitake），美國稱之為“林雞”，是一種食用藥用型真菌，隸屬擔(dān)子菌綱，多孔菌目，多孔菌科?；覙浠ㄖ械鞍踪|(zhì)、活性多糖、維生素、微量元素等生物活性物質(zhì)具有豐富的營養(yǎng)價值，尤其是灰樹花多糖具有抗腫瘤[1-2]、增強免疫[3]、抗氧化[4-6]、抗艾滋病毒[7]、清除自由基[8]等生物活性。而天麻作為傳統(tǒng)名貴中藥，蘭科寄生植物，以蜜環(huán)菌的菌絲或菌絲分泌物為營養(yǎng)來源，一直受國內(nèi)外醫(yī)學(xué)研究者青睞[9]。大量研究表明，天麻的主要成分包括天麻素、對羥基苯甲醇（p-hydroxybenzyl alcohol，HA）、香草醇、香蘭素等[10-11]，其中對羥基苯甲醇具有抗炎及抗腦血栓[12]、保護腦缺血引起的腦內(nèi)炎癥損傷[13]、抗血小板凝聚等作用[14]。

近年來，很多研究者在真菌液體發(fā)酵體系中添加一定的誘導(dǎo)物，結(jié)果可以促進菌絲體生長和代謝產(chǎn)物合成。GAO Q L等[15]向靈芝發(fā)酵液中添加乙酸乙酯提取的鱉蟲、蜣螂，實驗證明，靈芝多糖含量增加36%左右。HSIEH C Y等[16]向灰樹花發(fā)酵液中添加1%的橄欖油，研究發(fā)現(xiàn)其菌絲體生物量顯著提高，并且胞外多糖（exopolysaccharides，EPS）由0.70 g/L升至2.24 g/L，同時也減緩了灰樹花細胞的老化。此外，中藥經(jīng)過真菌發(fā)酵，其藥效增強，毒性減弱，同時還會利用生物轉(zhuǎn)化，合成新的活性物質(zhì)。POSTEMSKY P 等[17]利用豬苓固態(tài)發(fā)酵小麥籽粒，研究證明發(fā)酵后的小麥籽?？寡趸钚悦黠@增強。李國紅等[18]用枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）對三七須根進行發(fā)酵，在發(fā)酵液中發(fā)現(xiàn)化合物人參皂苷Rh4，此化合物在三七原料藥材中并未檢測到，證明產(chǎn)生了新的活性物質(zhì)人參皂苷。

本課題組的前期研究結(jié)果表明，天麻醇提物的添加可以促進灰樹花生物量和胞外多糖的產(chǎn)生[19-21]。但天麻中的有效單一成分對灰樹花發(fā)酵產(chǎn)物的影響機理尚不明確，本實驗向灰樹花深層發(fā)酵體系中添加天麻單一成分對羥基苯甲醇（HA），并分析了生物量、胞外多糖及發(fā)酵產(chǎn)物的1,1-二苯基-2-苦肼基（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、羥基、超氧陰離子自由基及過氧化氫清除率、還原力的變化，利用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）分析HA在灰樹花發(fā)酵體系中的利用情況。通過本研究可以闡明天麻部分有效成分在灰樹花深層發(fā)酵體系中的動態(tài)變化情況、代謝產(chǎn)物抗氧化活性以及其轉(zhuǎn)化機理，以此來改善傳統(tǒng)中藥制品“大、黑、多”的問題。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

灰樹花菌株（Grifola frondosa）51616：中國微生物菌種保藏管理中心；對羥基苯甲醇標準品：美國Sigma公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂20 g/L，蛋白胨2 g/L，MgSO·47H2O 1 g/L，KH2PO42 g/L，pH自然，滅菌鍋內(nèi)120 ℃、105 kPa、滅菌30 min。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖30 g/L，蛋白胨2 g/L，酵母膏6 g/L，MgSO·47H2O 1 g/L，KH2PO42 g/L，pH自然，滅菌鍋內(nèi)120 ℃、105 kPa、滅菌30 min。

發(fā)酵（液體）培養(yǎng)基：葡萄糖50 g/L，蛋白胨5 g/L，酵母膏10 g/L，MgSO·47H2O 1 g/L，KH2PO42 g/L，pH自然，滅菌鍋內(nèi)120 ℃、105 kPa、滅菌30 min。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-7502PC紫外可見分光光度計：上海欣茂儀器有限公司；BPCL-2-JZ-TGC微弱發(fā)光測量儀：北京建新力拓科技有限公司；Spectromax190酶標儀：美國Molecular Devices公司；CP114電子天平：奧豪斯儀器（上海）有限公司；pHs-3C pH計：上海鴻蓋儀器有限公司；BXM-30R立式滅菌鍋：上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；TG2-16G低速離心機：上海安亭科學(xué)儀器廠：SW-CJ-1D凈化工作臺：蘇州凈化設(shè)備有限公司；Agilent 1100高效液相色譜儀：美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)方法

斜面培養(yǎng)：從母種試管中取出綠豆般的菌絲，接在斜面中部，在25 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)13～15 d，長勢好的菌種放入4 ℃冰箱保存。

種子活化：取斜面菌種（除去老菌）無菌條件下接到種子培養(yǎng)基中，一支斜面只能接種到一瓶100 mL種子培養(yǎng)基中。放到25 ℃、150 r/min的恒溫搖瓶柜內(nèi)培養(yǎng)3～4 d。發(fā)酵培養(yǎng)：取10 mL（10%）種子液在無菌條件下接種，置于25 ℃、150 r/min的恒溫搖瓶柜內(nèi)培養(yǎng)。

1.3.2 分析方法

（1）菌絲體生物量測定

將發(fā)酵液用濾紙過濾，用蒸餾水沖洗3～5次，60 ℃烘干至質(zhì)量恒定，并稱質(zhì)量。

（2）胞外多糖含量測定

取上述濾液，加入4倍體積分數(shù)95%乙醇，于4 ℃冰箱中靜置24 h。然后離心（4 000 r/min，15 min），去除上清液，再用體積分數(shù)95%乙醇清洗沉淀3次，最后將沉淀在60 ℃下烘干，再加蒸餾水溶解，用苯酚-硫酸法[22]測定胞外多糖含量。

（3）發(fā)酵液還原力、DPPH、羥自由基清除率、超氧陰離子自由基清除率、過氧化氫清除率測定

還原力測定參考OYAIZU M[23]的方法并略有改動。取200μL樣品，稀釋至1mL，加入pH為6.6的磷酸鹽緩沖液與1%鐵氰化鉀溶液各2.5mL混勻，放入50℃水浴鍋中20～30 min，取出加入10%三氯乙酸溶液2.5 mL混勻，3 000 r/min離心10 min，取上清液2.5 mL，加入蒸餾水與0.1%氯化鐵溶液各2.5 mL混勻，靜置10 min后在700 nm處測吸光度值。

DPPH自由基清除率參照SHARMAO P[24]的DPPH法并略有改動。取樣品20 μL稀釋至200 μL，加入2 mol/L DPPH溶液（溶劑：無水乙醇）混勻，室溫下避光反應(yīng)30 min，取200 μL反應(yīng)液放于酶標板中，在波長515 nm下測定其吸光度值。

羥自由基清除率采用鄰菲羅啉—抗壞血酸—H2O2體系，超氧陰離子自由基清除率采用鄰苯三酚—魯米諾—碳酸鹽緩沖液體系，過氧化氫清除率采用H2O2—魯米諾—碳酸鹽緩沖液體系。

（4）高效液相色譜檢測條件

取1 mL發(fā)酵液進行膜過濾用于HPLC檢測，色譜柱：Agilent TC-C1（84.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：0.1%磷酸-水（A）和乙腈（C）。洗脫梯度：0～35 min C：3%～30%；35～45 min，C：30%～70%。流速1 mL/min，柱溫30 ℃，進樣量20 μL，檢測波長221 nm。

（5）HA的利用率計算方法

測定HA含量后，計算HA的利用率，其計算公式如下：

1.3.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel2010進行分析，并用Origin Pro9.0軟件作圖。不同平均值之間利用IBM SPSS Statistics 22.0軟件進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同HA添加量對發(fā)酵產(chǎn)物還原力和生物量的影響

圖1 不同對羥基苯甲醇添加量對灰樹花發(fā)酵產(chǎn)物還原力和生物量的影響Fig. 1 Effect of different p-hydroxybenzyl alcohol addition on reducing capacity and biomass

以未添加HA為對照組，向灰樹花發(fā)酵液體系中添加0.2 g/L的對羥基苯甲醇，每隔2 d對灰樹花發(fā)酵液進行動態(tài)測定分析，HA添加對胞外生物量和胞外多糖的影響如圖2所示。從圖2（A）可知，灰樹花深層發(fā)酵過程中，最初的生物量基本無差別（P＞0.05），說明菌絲體生長緩慢；在4～14 d生物量快速增加，此段時間內(nèi)實驗組生物量一直顯著高于對照組（P＜0.05）；發(fā)酵10 d時，實驗組灰樹花生物量達到（1.98±0.05）g/L，比對照組含量高65.2%，當(dāng)培養(yǎng)14 d后，實驗組灰樹花生物量達到（2.79±0.02）g/L，比對照組高39.5%（P＜0.05），說明HA添加可以促進灰樹花菌絲體生長且在第10天促進效果更好。從圖2（B）中可以看出，灰樹花深層發(fā)酵過程中，最初的EPS產(chǎn)量無很大差別（P＞0.05），實驗組在6～14 d EPS產(chǎn)量迅速增長，顯著高于對照組（P＜0.05）。實驗組在14 d時EPS含量達到最大值（3.51±0.02）g/L，比對照組含量高164.2%（P＜0.05），由此可以看出HA的添加促進了胞外多糖的合成，并能延長胞外多糖的合成時間，這可能是由于HA可以作為碳源供發(fā)酵過程微生物生長。

由圖1可知，灰樹花發(fā)酵液還原力隨HA添加量的不同而呈現(xiàn)差異性。當(dāng)HA添加量在0～0.2 g/L時，發(fā)酵液還原力和生物量隨著HA添加量的增加而增大；當(dāng)添加質(zhì)量濃度為0.2 g/L時，灰樹花生物量達到最大，為（0.65±0.02）g/L，還原力達到0.97±0.01，相比未添加HA時分別提高了133.69%和72.25%，之后隨著HA質(zhì)量濃度的增加，生物量反而有所減少，還原力也在下降說明HA濃度過高會明顯地抑制菌絲體生長和抗氧化活性。結(jié)果表明，當(dāng)HA添加量在0.05～0.25 g/L可以促進菌絲量的產(chǎn)生，HA的最佳添加量為0.2 g/L。

2.2 HA添加對胞外多糖和生物量的影響

圖2 對羥基苯甲醇添加對生物量（A）和胞外多糖（B）的影響Fig. 2 Effect of p-hydroxybenzyl alcohol addition on biomass (A)and exopolysaccharide content (B)

2.3 HA添加對DPPH自由基清除率和還原力的影響

圖3 對羥基苯甲醇添加對DPPH自由基清除率（A）和還原力（B）的影響Fig. 3 Effect of p-hydroxybenzyl alcohol addition on DPPH radical scavenging rate (A) and reducing capacity (B)

以未添加HA為對照組，向灰樹花發(fā)酵液體系中添加0.2 g/L HA，每隔2 d對灰樹花發(fā)酵液進行動態(tài)測定分析HA添加對DPPH自由基清除率和還原力的影響，結(jié)果如圖3所示。圖3A結(jié)果顯示，0～10 d，實驗組和對照組DPPH自由基清除率均隨發(fā)酵時間延長而增大，當(dāng)發(fā)酵到第10天，對照組和實驗組DPPH自由基清除率分別達到最大值，分別為（70.65±0.01）%和（79.85±0.01）%，實驗組相對于對照組提高了13.02%。圖3B結(jié)果顯示，0～4 d實驗組和對照組的還原力均下降，4～10 d，實驗組和對照組還原力均升高，且實驗組還原力顯著高于對照組（P＜0.05），當(dāng)發(fā)酵到第10天，對照組和實驗組還原力達到最大值，分別為0.59±0.01和0.81±0.01，且實驗組相對于對照組提高了37%。由此可知，HA添加不僅可以提高發(fā)酵液DPPH自由基清除率，同時也增強了發(fā)酵液的還原力。

2.4 發(fā)酵液的超氧陰離子自由基、羥自由基以及過氧化氫清除率

添加HA發(fā)酵10 d之后發(fā)酵液的超氧陰離子自由基、羥自由基以及過氧化氫清除率如圖4所示。結(jié)果顯示，實驗組超氧陰離子自由基、羥自由基以及過氧化氫清除率分別提高了41.1%、22.3%以及528%。因此向灰樹花發(fā)酵液中添加0.2 g/L對羥基苯甲醇進行深層發(fā)酵10 d之后的灰樹花發(fā)酵液整體清除自由基能力增強。

圖4 發(fā)酵液的超氧陰離子自由基、羥自由基以及過氧化氫清除率Fig. 4 The superoxide anion free radical, hydroxyl free radical and hydrogen peroxide scavenging rate of fermentation broth

2.5 灰樹花發(fā)酵過程中HA的利用率

利用高效液相色譜測定HA在發(fā)酵液中的剩余含量，從而計算其利用率，結(jié)果如圖5所示。

圖5 灰樹花發(fā)酵過程中pH變化以及對羥基苯甲醇利用率變化Fig. 5 Changes of pH during Grifola frondosa fermentation and utilization of p-hydroxybenzyl alcohol

由圖5可知，0～4 d時，HA利用率近40%，發(fā)酵液pH無明顯變化；4～10 d，HA利用率逐漸升高達到83.1%，發(fā)酵液pH下降至4.81；10～14 d，HA持續(xù)被利用；當(dāng)發(fā)酵到達14 d時，HA幾乎被利用完畢，利用率可達97.27%，此時發(fā)酵液的pH降至4.0以下。這是由于0～4 d菌絲體生長緩慢，次級代謝產(chǎn)物少，所以發(fā)酵液的pH變化不明顯。隨著發(fā)酵的進行，HA逐漸被利用完畢，培養(yǎng)基中氮源、生長因子等營養(yǎng)成分也不足以支撐灰樹花進行次級代謝，此時的灰樹花利用活性物質(zhì)維持基本代謝，有機酸變多，pH降至4.0以下，達到發(fā)酵終點。由此可以看出，HA在灰樹花深層發(fā)酵體系中幾乎可以被完全吸收利用。

3 結(jié)論

本研究利用灰樹花發(fā)酵轉(zhuǎn)化天麻成分HA，測定其轉(zhuǎn)化前后發(fā)酵液抗氧化活性變化及其對生物量和胞外多糖產(chǎn)量的影響動態(tài)分析。試驗結(jié)果表明：當(dāng)HA添加量為0.2 g/L，發(fā)酵時間為10 d，其還原力最強，最大還原力可達到0.81±0.01。動態(tài)分析結(jié)果顯示0.2 g/L的HA可以顯著促進灰樹花生物量和胞外多糖的產(chǎn)生，分別提高了65.2%和164.2%。其次，0.2 g/L的HA的添加可以明顯提高DPPH自由基、羥自由基、超氧陰離子自由基、過氧化氫清除率和還原力，這與HA在灰樹花深層發(fā)酵體系中能夠促進灰樹花胞外多糖、胞外蛋白等抗氧化活性物質(zhì)的生成有關(guān)。在整個發(fā)酵過程中通過HPLC測定HA的利用率高達97.27%，幾乎被完全轉(zhuǎn)化。