朱美飛 江榮林 雷澍 吳建濃

骨髓間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）移植在心肌梗死治療中的安全性和有效性已得到初步證實[1]。但是，移植后的MSCs在心肌組織中的定植率和存活率很低，其中一個重要的原因是年齡問題。有報道證實老年供體來源的MSCs在動物模型中對心肌損傷的修復作用減弱[2]，其增殖、分化潛能及應激抵抗能力等均下降[3-4]。然而臨床上需要接受MSCs治療者仍以老年患者為主[5]，因而提高老年個體來源的MSCs功能是MSCs移植治療未來臨床應用需要解決的重要科學問題。沉默信息調(diào)節(jié)因子（silent information regulator type 1，SIRT1）是一種尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴的組蛋白去乙?；?，已被證實在代謝和年齡相關(guān)的疾病以及細胞存活、凋亡和應激抵抗等方面扮演著重要角色[6-9]。而SIRT1在個體中的表達隨著年齡增加而降低，因此有研究者曾用基因工程方法在老年大鼠MSCs中過表達SIRT1，證明SIRT1對于MSCs的衰老表型有積極的改善作用，對MSCs在心肌梗死中的治療作用也有提升[10-11]。然而基因工程方法由于其倫理及安全性問題，不能在臨床治療中應用。近年來，大量小分子化合物被開發(fā)出來用于增強SIRT1活性，其中效果和特異性最強的是SRT1720[12-13]。有研究證明SRT1720喂養(yǎng)對正常飲食和高脂飲食的小鼠均有延長壽命的作用，并可延緩血流動力學不穩(wěn)定所導致的內(nèi)皮細胞衰老[14-16]。因此，筆者推測SRT1720在老年來源的MSCs中可能同樣發(fā)揮積極作用，可改善其衰老表型及功能，并試圖通過動物實驗來進一步證實。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 老年雄性SD大鼠20只（18月齡）購自浙江省醫(yī)學科學院，所有處理程序均經(jīng)過醫(yī)院實驗動物倫理委員會批準并符合美國國立衛(wèi)生院頒布的《實驗動物照護及使用指南》。

1.2 試劑和儀器 SRT1720（美國Selleck Chemicals公司），DMEM 培養(yǎng)基、FBS、BSA、DMSO、SYBR Green Reaction Mix試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Life Technologies公司），CCK-8試劑盒（日本同仁化學），酶標儀（美國Bio-Rad公司），衰老相關(guān)的β半乳糖苷酶染色試劑盒、RIPA裂解液、活性氧檢測試劑盒、PBS、0.25%胰酶（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），Marker、Gel Doc EZ Imaging System、Nanodrop分光光度計、ABI 7500 Fast聚合酶鏈反應系統(tǒng)（美國Thermo Fisher公司），PVDF膜（美國Merck Millipore公司），ECL液（德國Merck Millipore公司），兔抗大鼠p16單克隆抗體、兔抗大鼠p21單克隆抗體（英國Abcam公司），小鼠抗大鼠 γ-H2A.X單克隆抗體、HRP標記的抗小鼠和抗兔熒光二抗（美國Cell Signaling Technology公司），HRP標記的β-actin小鼠單克隆抗體、孵育羊抗大鼠γ-H2A.X熒光標記二抗（美國BD Biosciences公司），6孔板、96孔板、50ml離心管、15ml離心管（美國 Corning公司），2.5～1 000μl移液器（德國Eppendorf公司），熒光顯微鏡（德國萊卡公司）。

1.3 MSCs的收集、分離和培養(yǎng) 大鼠MSCs的收集和分離步驟參照Chen等[10]所使用的方法。獲取老年雄性SD大鼠雙側(cè)股骨和脛骨，并用DMEM培養(yǎng)基反復沖洗骨髓腔，將沖洗液離心后收集細胞沉淀。用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基重懸細胞后，置于含5%CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。次日，將貼壁細胞同樣條件下繼續(xù)培養(yǎng)，每3d更換細胞培養(yǎng)液。直至細胞鋪滿70%～80%底面積時，以含0.2%EDTA的0.25%胰酶溶液消化細胞，使其脫壁，離心并重懸后以1∶3的比例分配至新的培養(yǎng)皿，恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)傳代擴增，第3～5代的細胞用于后續(xù)實驗。

1.4 細胞應激模型的建立和細胞生存率分析 根據(jù)心肌梗死后缺血缺氧微環(huán)境特點，本研究建立了過氧化應激模型。將老年大鼠MSCs以2 000個/孔的密度分別接種至96孔細胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)1d待生長穩(wěn)定后分別予以含不同濃度（0、125、250、500和1 000μM）過氧化氫（H2O2）的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)不同時間（12、24h），移除培養(yǎng)基，每孔更換含10μl CCK-8的DMEM 100μl。培育2.5h后，將培養(yǎng)板置于酶標儀上讀取450nm處吸光度（OD）值。細胞生存率=各處理組OD值/正常培養(yǎng)基對照組OD值×100%。

1.5 MSCs藥物處理 SRT1720溶解于有機溶劑DMSO中備用。為避免DMSO對細胞的毒性影響，DMSO在細胞培養(yǎng)液中的濃度均低于0.1%體積分數(shù)。各組細胞暴露于含不同濃度（0、0.2、0.5、1、2 和 5μM）SRT1720 的正常細胞培養(yǎng)基以及同濃度SRT1720經(jīng)不同時間（0、3、6、12、24和48h）培養(yǎng)后，置于上述1.4的過氧化應激模型下，采用CCK-8法檢測細胞生存率。

1.6 衰老相關(guān)的β半乳糖苷酶染色 相同代次（第3代）的老年大鼠MSCs以200 000個/孔的密度分別接種于6孔板中，分為兩組，分別經(jīng)SRT1720和溶劑對照DMSO預處理后，分別以3孔細胞用于直接染色，另外3孔更換含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2d后染色。染色方法如下，移除細胞培養(yǎng)基，以4%甲醛固定15min。PBS洗滌后，采用衰老相關(guān)的β半乳糖苷酶染色試劑盒進行染色。37℃恒溫培育箱培育過夜后，在倒置顯微鏡下觀察拍照。

1.7 衰老相關(guān)的p16、p21 mRNA表達水平檢測 采用熒光定量PCR法。以Trizol法提取RNA，按照說明書進行操作，沉淀的RNA溶解于20μl DEPC水，用Nanodrop分光光度計檢測RNA濃度。參照說明書以逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄，得到的cDNA存放于-20℃?zhèn)溆?。應用熒光定量PCR法檢測目的基因表達。以GAPDH為內(nèi)參，以逆轉(zhuǎn)錄而來的cDNA為模板，按照SYBR Green Reaction Mix試劑盒說明添加反應體系，在ABI 7500Fast系統(tǒng)上檢測基因表達強度。反應體系為20μl（含SYBR Green 10μl，Rox 0.4μl，cDNA 2μl，ddH2O 6.8μl，Primer F 0.4μl和 Primer R 0.4μl），反應條件為 95℃預熱 15min，隨后 95℃解鏈 5s，62℃反應 30s，72℃延長 5s，40個循環(huán)。引物序列用Primer 3在線軟件設計，由Invitrogen公司上海引物合成部合成，見表1?；蛳鄬Ρ磉_豐度用ΔΔCt法計算分析。

表1 引物序列

1.8 衰老相關(guān)的p16、p21蛋白表達水平檢測 采用Western blot法。分別經(jīng)SRT1720和溶劑對照DMSO預處理的老年MSCs移除細胞培養(yǎng)基，用含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液使細胞充分裂解25min。之后12 000g，4℃離心25min，留取上清液，用BCA法蛋白定量檢測試劑盒進行蛋白定量，凍存于-80℃冰箱備用。蛋白樣品上樣前先予100℃煮沸5min以使之變性，隨后以SDS-PAGA凝膠在30mA下電泳至分子量Marker到達凝膠底部，后將凝膠中的蛋白質(zhì)在300mA下濕轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。以5%BSA封閉1h后，將蛋白膜孵育于目標蛋白特異性第一抗體（1∶1 000稀釋）中，4℃下孵育過夜。次日取出，以含0.1%Tween的PBST振蕩洗滌3次。以HRP偶聯(lián)的第一抗體特異性第二抗體（1∶3 000稀釋）孵育PVDF膜1h后再次PBST洗滌3次。洗滌后的蛋白膜用ECL液按照說明書在暗室孵育3min，采用Gel Doc EZ Imaging System成像并用Image Lab軟件分析條帶。

1.9 管腔形成試驗 將老年MSCs接種于6孔板，分為兩組，分別以SRT1720和溶劑對照DMSO預處理24h，更換為含2%FBS培養(yǎng)基，1d后留取上清液。用兩組預處理的細胞上清液重懸人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC），接種至預鋪好 Matrigel的 96 孔板中，分別于 1、2、3、4、5h 在光學顯微鏡下觀察HUVEC管腔形成情況并拍攝照片。以Image-Pro Plus軟件測量每個視野的管腔長度，代表血管新生能力。

1.10 活性氧類物質(zhì)含量檢測 將老年MSCs接種于6孔板，經(jīng)SRT1720和相同體積分數(shù)溶劑對照DMSO預件。計量資料以表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Dunnett-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 SRT1720預處理對老年MSCs生存率的影響 當細胞處于含250μM H2O2的無血清培養(yǎng)基中24h后，細胞生存率為50%左右（圖1a），當SRT1720濃度達到5μM時表現(xiàn)出細胞毒性（圖1b），因此選取不超過5μM的 SRT1720進一步研究。細胞生存率隨著SRT1720濃度的升高而增加，當濃度為1μM時達到最高（圖1c），預處理24h的生存率較預處理12h明顯增加，但與預處理48h比較無明顯差異（圖1d）。

2.2 SRT1720預處理對老年MSCs β-半乳糖苷酶染色陽性細胞率和衰老相關(guān)蛋白的影響 經(jīng)SRT1720預處理后的老年MSCs β-半乳糖苷酶染色陽性細胞率與DMSO對照比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），而繼續(xù)生長48h后染色陽性細胞率較DMSO對照明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見圖 2（插頁）和圖3a。經(jīng)SRT1720預處理的老年MSCs生長48h后p16、p21mRNA和蛋白表達水平均明顯下降，以p21下降為主，見圖3b-d。

2.3 SRT1720預處理老年MSCs對HUVEC管腔形成的影響 通過管腔形成試驗發(fā)現(xiàn)，經(jīng)SRT1720預處理的老年MSCs其外分泌液使得HUVEC管腔形成數(shù)量及長度明顯增加，提示促血管新生能力明顯增強，見圖4處理，置于上述1.4的過氧化應激模型下24h，采用活性氧檢測試劑盒檢測活性氧類物質(zhì)含量。簡述如下，移除培養(yǎng)基后每個孔加入200μl以1∶1 000稀釋的DCFHDA，37℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20min。用無血清培養(yǎng)液洗滌細胞3次，在熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.11 細胞內(nèi)DNA損傷免疫熒光法檢測 將老年MSCs接種于24孔板，經(jīng)SRT1720和相同體積分數(shù)溶劑對照DMSO預處理后，置于上述1.4的過氧化應激模型下。移除細胞培養(yǎng)基，用4%甲醛固定15min，洗滌后以0.2%的Triton X-100破膜20min。用5%BSA室溫封閉1h，之后孵育小鼠抗大鼠γ-H2A.X單克隆抗體（1∶500稀釋），4℃孵育過夜。洗滌后孵育羊抗大鼠γ-H2A.X熒光標記二抗（1∶2 000稀釋），室溫1h。用含DAPI（標記細胞核）的熒光封片劑封片。在熒光顯微鏡下觀察，隨機選取5個高倍鏡視野拍照，并計算γ-H2A.X陽性細胞數(shù)占總細胞數(shù)比例。

1.12 統(tǒng)計學處理 采用GraphPad Prism 6.01統(tǒng)計軟（插頁）和圖5。

圖1 SRT1720預處理對老年MSCs生存率的影響（a：老年MSCs在含H2O2無血清培養(yǎng)基中處理12和24h后的細胞生存率；b：老年MSCs經(jīng)不同濃度SRT1720和DMSO處理24h后的細胞生存率；c：經(jīng)SRT1720處理的老年MSCs在無血清+H2O2環(huán)境中的細胞生存率；d：經(jīng)1μM SRT1720預處理不同時間后的老年MSCs在無血清+H2O2環(huán)境中的細胞生存率；與預處理0μM或0h組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；橫線下兩組比較，△△P＜0.01）

圖2 β-半乳糖苷酶染色顯示老年MSCs衰老情況（綠色為染色陽性）

圖3 SRT1720預處理對老年MSCs β-半乳糖苷酶染色陽性細胞率和衰老相關(guān)蛋白的影響（a：SRT1720預處理對老年MSCsβ-半乳糖苷酶染色陽性細胞率的影響；b：熒光定量PCR法檢測細胞內(nèi)衰老相關(guān)的p16、p21 mRNA表達水平；c：衰老相關(guān)的p16、p21蛋白表達的電泳圖；d：Western blot法檢測衰老相關(guān)的p16、p21蛋白表達水平；與DMSO比較，**P＜0.01）

圖4 經(jīng)SRT1720預處理的老年MSCs HUVEC細胞連接形成管腔情況

2.4 SRT1720預處理對活性氧類物質(zhì)產(chǎn)生和γ-H2A.X表達的影響 經(jīng)SRT1720預處理的老年MSCs內(nèi)活性氧類物質(zhì)水平較DMSO對照明顯下降（圖6a，見插頁）。同時，反映DNA損傷水平的γ-H2A.X在未經(jīng)SRT1720預處理的老年MSCs細胞核內(nèi)表達明顯增多，表明其DNA損傷程度較重（圖6b，見插頁）。經(jīng)SRT1720預處理的老年MSCs γ-H2A.X蛋白表達水平明顯低于DMSO對照，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見圖7。

圖5 經(jīng)SRT1720預處理的老年MSCs HUVEC管腔長度比較（與DMSO比較，**P＜0.01）

圖6 SRT1720預處理對活性氧類物質(zhì)產(chǎn)生和γ-H2A.X表達的影響[a：老年MSCs內(nèi)活性氧類物質(zhì)水平（綠色熒光）；b：γ-H2A.X在老年MSCs細胞核內(nèi)表達情況（紅色為γ-H2A.X，藍色為細胞核）]

圖7 SRT1720預處理對γ-H2A.X表達的影響（a：經(jīng)SRT1720預處理的老年MSCsγ-H2A.X陽性率；b：經(jīng)SRT1720預處理的老年MSCsγ-H2A.X蛋白表達的電泳圖；c：經(jīng)SRT1720預處理的老年MSCsγ-H2A.X蛋白表達水平比較；與DMSO比較，**P＜0.01）

3 討論

MSCs移植治療已成為心血管領域的研究熱點，隨著越來越多的臨床試驗的開展和結(jié)果公布，其療效逐漸被肯定，但同時也暴露出一些問題，比如用于移植的細胞可得性低、存在免疫排斥反應等。MSCs因其容易大量獲得、分化和增殖潛能較高、免疫豁免等優(yōu)點被廣泛應用，但其療效仍不能達到理想水平。原因是多方面的，比如低生存率和低定植率，而老年患者群體因老齡化的特點變得尤為突出。已有研究證明，相對于年輕個體來源的MSCs，老年供體來源的MSCs療效進一步減弱[17]。究其原因，一方面隨著個體的衰老，MSCs也表現(xiàn)出衰老相關(guān)分泌特征，導致促炎和促衰老相關(guān)的細胞因子分泌增多[18-19]；另一方面，老年供體來源的MSCs增殖和抗惡劣環(huán)境應激的能力也相應減弱[20-21]。因此，改善MSCs衰老成為提高其療效的關(guān)鍵因素。而目前針對老年供體來源的MSCs處理方法較少，除了基因工程方法以外，尚缺乏切實可行的方案。

基于SIRT1過表達的老年MSCs其衰老表型改善及治療心肌梗死的療效增強的結(jié)論[10-11]，以及小分子化合物在MSCs預處理中的可行性[22]，本研究試圖通過小分子化合物來改善老年MSCs中SIRT1的表達或活性，進而起到與基因過表達相似的效果。用于增強SIRT1活性的小分子化合物有多種，包括天然的如白蘆藜醇，以及人工合成的如SRT1720、SRT2140等[23]，其中以SRT1720效果及特異性最強[24]。因此，SRT1720被選定為本研究中用來提高SIRT1活性的小分子化合物。本研究中，筆者通過模擬心肌梗死后局部內(nèi)環(huán)境缺血缺氧以及再灌注后過氧化損傷的特點，建立過氧化應激模型，通過反映細胞生存情況的CCK-8試劑探索出SRT1720用于預處理的最佳條件。由于存在時間與濃度的雙重條件，而濃度條件易于得到，因此，本研究采取先易后難的策略，分別取得最適宜的處理濃度和時間。在此條件下，經(jīng)SRT1720預處理的老年MSCs，反映其衰老表型的β-半乳糖苷酶表達明顯降低，而隨衰老程度逐漸增加的p16、p21表達明顯下降，意味著細胞衰老表型明顯改善。那么這是否影響了其功能呢？眾所周知，MSCs移植治療心肌梗死效果的發(fā)揮主要依賴于旁分泌作用，通過旁分泌因子起到促血管增生、抗心肌細胞凋亡等作用[25]。因此筆者通過管腔形成試驗證實SRT1720預處理不僅改善老年MSCs衰老表型，并能明顯增加HUVEC連接形成管腔的數(shù)量和總長度，這表明提高其促血管新生的功能。由于實驗條件及技術(shù)成熟度的不足，本研究尚未探究其外分泌液對心肌細胞凋亡的影響，望后續(xù)研究者彌補這一不足之處。

鑒于過氧化應激和DNA損傷在促進細胞衰老機制中的重要地位及其相互作用[26-27]，以及SIRT1抗氧化應激的作用，在對SRT1720作用機制的研究中，筆者將過

氧化應激與DNA損傷同時進行檢測。結(jié)果表明，SRT1720預處理減少了細胞內(nèi)活性氧類物質(zhì)的產(chǎn)生，同時反映DNA損傷的組蛋白γ-H2A.X細胞內(nèi)含量明顯減少。表明在應激條件下，SRT1720預處理致過氧化物產(chǎn)生減少的同時，DNA損傷也減輕，揭示SRT1720似乎通過減少過氧化物的產(chǎn)生而間接減弱DNA損傷反應，從而延緩細胞衰老。但由于技術(shù)限制，本研究未能證實兩者之間的確切關(guān)系，在今后的研究中有望突破這一關(guān)鍵環(huán)節(jié)。