賴 多，曹 旭 ，邵雪花，肖維強，劉傳和，賀 涵，劉 秀 ，匡石滋

（1.廣東省農(nóng)業(yè)科學院果樹研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南亞熱帶果樹生物學與遺傳資源利用重點實驗室/廣東省熱帶亞熱帶果樹研究重點實驗室，廣東 廣州 510640；2.湖南人文科技學院農(nóng)業(yè)與生物技術學院/湖南省農(nóng)藥無害化應用重點實驗室，湖南 婁底 417000）

【研究意義】柑橘黃龍病是一種系統(tǒng)侵染的檢疫性細菌病害，已成為威脅世界柑橘產(chǎn)業(yè)的頭號“殺手”［1-2］。柑橘木虱是黃龍病重要的傳播媒介，防治木虱成為控制或延緩黃龍病發(fā)病和傳播的關鍵［2-3］。目前，防治柑橘木虱主要依靠化學農(nóng)藥，然而殺蟲劑的頻繁使用，不僅造成了靶標害蟲抗藥性的產(chǎn)生，而且引發(fā)了農(nóng)產(chǎn)品質量安全、環(huán)境污染和生物多樣性等諸多問題［4-6］。隨著人們生活水平的提高和農(nóng)藥減量化的要求，在柑橘木虱綜合防治中迫切需要篩選出高效、低毒的環(huán)境友好型替代農(nóng)藥?！厩叭搜芯窟M展】研究表明，柑橘木虱取食黃龍病病株后可終生帶毒，成蟲和若蟲均具有高效獲毒和傳毒能力，在感染黃龍病病樹上刺吸5周，若蟲60%～100%帶毒，成蟲40%帶毒，且成蟲通過飛行攜帶病原進行擴散［7-8］。柑橘木虱的發(fā)生與黃龍病的傳播、擴散密切相關，加之木虱在柑橘的整個生長期都有發(fā)生風險，因此實際生產(chǎn)中柑橘園頻繁使用化學農(nóng)藥。有研究報道我國有些柑橘種植區(qū)每年噴藥防治柑橘木虱的次數(shù)少則12次、多達20次［9］。目前，生產(chǎn)上用于柑橘木虱的殺蟲劑種類繁多，包含各種不同作用機理的化學農(nóng)藥，如有機磷類、新煙堿類、氨基甲酸酯類、阿維菌素類、擬除蟲菊酯類和有機氯類等［4-5,10］。大量多次和不當?shù)氖褂脷⑾x劑都會導致柑橘木虱抗藥性水平增加，而且化學農(nóng)藥對柑橘木虱的防治已有幾十年的應用歷史，目前許多國家的田間種群對多數(shù)傳統(tǒng)化學農(nóng)藥已產(chǎn)生了不同程度的抗性。例如，Vázquez-García等［11］研究發(fā)現(xiàn)，墨西哥 Apatzingan和Michoacan地區(qū)的柑橘木虱種群對吡蟲啉的抗性高達4 265.6倍，對樂果也有106.5倍；Tiwari等［5］報道美國佛羅里達柑橘木虱田間種群對吡蟲啉、毒死蜱、噻蟲嗪、馬拉硫磷和甲氰菊酯均已產(chǎn)生抗藥性，其中La Balle地區(qū)對吡蟲啉和噻蟲嗪的抗性倍數(shù)分別為35.0倍和13.0倍；2012年，我國學者鄧學明等［12-13］也報道廣西地區(qū)柑橘木虱對毒死蜱產(chǎn)生8.8倍的抗藥性，對呋蟲胺產(chǎn)生17.1倍的抗藥性。近年來，柑橘木虱抗藥性不斷增加，而且每年用于防治木虱的殺蟲劑使用量不斷增加。然而，農(nóng)藥減量增效是我國農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要保障，我國政府2015年中央1號文件也明確指出要顯著控制我國農(nóng)藥化肥的使用量，因此，生物農(nóng)藥在柑橘木虱的減量化防控體系中越來越重要?！颈狙芯壳腥朦c】近年來，我國實施到2020年農(nóng)藥零增長行動，大量推廣使用生物農(nóng)藥，減少化學農(nóng)藥的使用。印楝素是目前世界公認的廣譜、低毒、低殘留的生物農(nóng)藥，其作用機制獨特，不易引起害蟲產(chǎn)生抗性，而且對多種害蟲有拒食、觸殺、胃毒和抑制生長發(fā)育作用［14-16］。此外，印楝素具有內吸性，能在植物韌皮部輸導［17-18］，因此在防治取食柑橘韌皮部的木虱中具有良好的優(yōu)勢。【擬解決的關鍵問題】測定并明確印楝素對柑橘木虱幼蟲和成蟲的毒殺活性和拒食活性，為柑橘木虱的生物防治提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試蟲源 于華南農(nóng)業(yè)大學校園的九里香上采集柑橘木虱，帶回實驗室，置于網(wǎng)室中，以九里香幼苗飼養(yǎng)繁殖多代。試驗前，將一批成蟲（約800頭）轉接到長出新葉的九里香上，讓其產(chǎn)卵1 d后移走；待卵孵化后，飼養(yǎng)至三齡若蟲供測試。若蟲羽化后，收集5～7 d的成蟲用于測試。

1.1.2 供試藥劑 印楝素分析標準品（＞90%）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司產(chǎn)品，以無水乙醇配制成濃度為5 000 mg/L的母液，使用時用清水（含0.01%吐溫80，下同）稀釋；0.3%印楝素乳油：成都綠金生物科技有限責任公司產(chǎn)品；25%噻蟲嗪水分散粒劑：安徽省錦江農(nóng)化有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗方法

1.2.1 對若蟲的毒力測定 采用浸葉法［19］測定印楝素對柑橘木虱三齡若蟲的毒殺活性。將印楝素母液稀釋配制成0.375、0.75、1.5、3.0、6.0 mg/L 5個濃度梯度藥液。將大小相近的新鮮柑橘葉片，分別浸漬不同濃度藥液15 s，取出自然晾干后，葉柄處用濕棉花包裹置于1.5 mL離心管后，放入150 mL一次性塑料杯中，再選取大小一致的柑橘木虱三齡若蟲15頭饑餓處理2 h后接入塑料杯內，每個濃度處理3次重復。以清水（含等量乙醇溶劑）為對照。于處理后1、2、3、5、7 d分別檢查若蟲的存活狀態(tài)，以毛刷輕觸若蟲體表，無反應判定為死亡，記錄死亡數(shù)，計算各處理若蟲的死亡率和校正死亡率。

1.2.2 對成蟲的毒力測定 采用浸葉法［19］測定不同濃度（1.0、2.0、4.0、8.0、16.0 mg/L）印楝素藥液對成蟲的毒殺活性。以清水（含等量乙醇溶劑）為對照。藥后2 d和4 d檢查成蟲的存活狀態(tài)，以毛刷輕觸蟲體，無反應判定為死亡，記錄死亡數(shù)，計算各處理成蟲的死亡率和校正死亡率。

1.2.3 田間防效試驗 于2019年8月在廣東省饒平縣錢東鎮(zhèn)朝陽公司貢柑柑橘園進行，選取柑橘木虱為害的植株。試驗設0.3%印楝素乳油800倍液、25%噻蟲嗪水分散粒劑3 500倍液及空白對照（清水）3個處理，每個處理3次重復，隨機排列，每小區(qū)2株柑橘樹。采用背負式電動噴霧器按試驗濃度對柑橘樹冠和內膛均勻噴霧，至葉片有少量藥液下滴為止。于施藥前，在柑橘樹的東、南、西、北、中5個方位選定為害嫩梢，標記并記錄活若蟲數(shù)；藥后1、3、7 d按照相同方式分別調查各小區(qū)柑橘葉片的活若蟲數(shù)，記錄各處理存活若蟲總數(shù)，計算防治效果。

根據(jù)各處理的死亡率和校正死亡率數(shù)據(jù)，用Excel進行毒力回歸計算，得到毒力回歸方程、LC50、置限區(qū)間值和相關系數(shù)；采用GraphPad Prism 8數(shù)據(jù)處理軟件進行差異顯著性分析和作圖。

2 結果與分析

2.1 印楝素對柑橘木虱若蟲的室內毒殺活性

試驗發(fā)現(xiàn)，印楝素對柑橘木虱若蟲的毒殺效果較為緩慢，藥液處理的前2 d死亡率較低，但是部分若蟲出現(xiàn)活動能力下降、身體僵硬等現(xiàn)象，這可能與印楝素抑制昆蟲生長發(fā)育而非直接致死的作用方式有關。從圖1可以看出，印楝素對柑橘木虱若蟲的毒殺活性與藥劑濃度以及作用時間有關，在最低處理濃度0.375 mg/L作用下，藥后2 d內柑橘木虱三齡若蟲死亡率為0，隨著時間延長，若蟲的死亡率增大，藥后3、5、7 d死亡率分別為11.11%、31.11%和44.44%，并且隨著印楝素處理濃度的增大，若蟲的死亡率明顯增高。在最大處理濃度6.0 mg/L作用下，印楝素對柑橘木虱三齡若蟲具有良好的毒殺活性，藥后1、2、3、5、7 d，三齡若蟲死亡率分別為2.22%、13.33%、68.89%、82.22%和91.11%。顯著性分析表明，藥后7 d各藥劑處理與對照死亡率差異顯著。由表1可知，印楝素對柑橘木虱三齡若蟲的毒殺活性隨著作用時間的延長而明顯增加，藥后3、5 d其LC50值分別為2.77、1.14 mg/L；藥后7 d活性最高，其LC50值為0.61 mg/L。

圖1 印楝素對柑橘木虱三齡若蟲的死亡率測定Fig.1 Determination of mortality of the 3rd instar nymphs of D. citri treated with azadirachtin

2.2 印楝素對柑橘木虱成蟲的室內毒殺活性

從圖2可以看出，與若蟲相比，盡管印楝素對柑橘木虱成蟲的處理濃度提高了，藥后2 d各處理成蟲死亡率在2.22%～6.67%之間，與對照無顯著差異；在最大藥液測試濃度（16.0 mg/L）下，印楝素處理藥后4 d成蟲死亡率也僅為13.33%，與清水對照無顯著差異。表明印楝素在低濃度情況下對柑橘木虱成蟲無毒殺活性。

表1 印楝素對柑橘木虱三齡若蟲的室內毒殺活性Table 1 Indoor toxicity activity of azadirachtin against the 3rd instar nymphs of D. citri

圖2 印楝素對柑橘木虱成蟲的死亡率測定Fig.2 Determination of mortality of the adult of D. citri treated with azadirachtin

2.3 印楝素對柑橘木虱若蟲的田間防效

從表2可以看出，0.3%印楝素乳油800倍液藥后1、3、7 d對柑橘木虱若蟲的防效分別為14.35%、49.56%和86.4%，防效隨著時間延長而提高；而對照藥劑25%噻蟲嗪水分散粒劑表現(xiàn)出速效性，藥后1、3 d的防效分別達到99.32%和98.12%，顯著高于0.3%印楝素乳油處理。但藥后7 d，0.3%印楝素乳油對柑橘木虱具有良好的防治效果，可以將若蟲密度控制在較低的水平，與對照藥劑25%噻蟲嗪水分散粒劑的防效無顯著差異。以上結果表明，0.3%印楝素乳油對柑橘木虱若蟲的速效性較差，并且試驗發(fā)現(xiàn)印楝素對柑橘木虱成蟲沒有防治效果，這與室內活性測定結果一致。

表2 0.3%印楝素乳油對柑橘木虱若蟲的田間防效Table 2 Field control effect of 0.3% azadirachtin EC on the nymphs of D. citri (%)

3 討論

本試驗測定了印楝素對柑橘木虱若蟲和成蟲的毒殺活性及田間防治效果，評價了印楝素在柑橘木虱防治工作中的應用潛力。試驗發(fā)現(xiàn)，印楝素對柑橘木虱若蟲具有良好的毒力，但對成蟲沒有毒殺活性。這與印楝素獨特的作用機理有關，印楝素主要通過干擾昆蟲幼蟲的神經(jīng)內分泌系統(tǒng)，降低蛻皮激素滴度進而抑制昆蟲的生長發(fā)育［16,20］。值得注意的是，印楝素對柑橘木虱若蟲的速效性較差，試驗發(fā)現(xiàn)一般藥后3～5 d才能觀察到明顯的死亡現(xiàn)象。在其他害蟲如大豆蚜Aphis glycines、鬧羊花網(wǎng)蝽Stephanitis pyrioides、草地貪夜蛾Spodoptera frugiperda等［21-23］防治中，也發(fā)現(xiàn)印楝素的毒殺作用見效均較慢。這些現(xiàn)象與除蟲脲、滅幼脲、吡丙醚等其他昆蟲生長調節(jié)劑作用效果類似，在使用時不直接殺死昆蟲，而是在昆蟲發(fā)育時期阻礙或干擾其正常發(fā)育，使其活動能力下降、死亡，進而控制種群的密度［24］。因此，印楝素需要在柑橘木虱若蟲低齡期施用，或與低毒的速效殺蟲劑復配使用，既有速效作用又能發(fā)揮印楝素的特異性。

抗藥性是目前柑橘木虱防治中面臨的重要問題之一。柑橘木虱作為黃龍病的田間唯一傳播媒介昆蟲，鑒于黃龍病的破壞性，果農(nóng)在柑橘園中頻繁使用化學農(nóng)藥，長期以來常規(guī)的有機磷類、新煙堿類和氨基甲酸酯類農(nóng)藥單一品種和高劑量的使用，進一步加劇了木虱的抗藥性。與化學農(nóng)藥相比，生物農(nóng)藥尤其是植物源農(nóng)藥往往具有多重作用機制，不易引起昆蟲產(chǎn)生抗藥性，已經(jīng)成為害蟲防治中的重要手段之一［15,25］。印楝素是目前世界上公認的最優(yōu)秀植物源農(nóng)藥，由于其獨特的作用機理，對害蟲無抗藥性，而且低毒、低殘留，對人畜和環(huán)境安全。印楝素在柑橘木虱防治中具有良好的應用潛力。

4 結論

本試驗結果表明，印楝素對柑橘木虱若蟲具有良好的毒力，但對成蟲沒有毒殺活性。6.0 mg/L印楝素對柑橘木虱三齡若蟲藥后7 d的LC50值為0.61 mg/L，0.3%印楝素乳油800倍液對柑橘木虱若蟲藥后7 d的田間防效為86.4%。