柯 旭，趙衛(wèi)東，李 靜，周榮生

自然流產(chǎn)( spontaneous abortion)為孕婦妊娠不滿(mǎn)28周、胎兒體重不足1 kg時(shí)自然終止的妊娠[1]。近年來(lái)，研究[2-3]顯示妊娠早期流產(chǎn)的病因十分復(fù)雜，除了遺傳因素、感染、內(nèi)分泌、生殖器官結(jié)構(gòu)異常等病因外，仍有近半數(shù)的自然流產(chǎn)無(wú)法查出病因。目前，臨床中對(duì)于自然流產(chǎn)的原因尚不十分清晰。病原體感染是自然流產(chǎn)的重要因素之一，有文獻(xiàn)[4-5]報(bào)道主要已知的病原體感染如單純皰疹、人支原體、弓形蟲(chóng)、巨細(xì)胞病毒(cytomegalovirus, cMV))等均與流產(chǎn)有關(guān)。人巨細(xì)胞病毒(human cytomegalovirus, HCMV)是造成宮內(nèi)感染的主要病毒[6]。越來(lái)越多的研究[7]表明，自然流產(chǎn)孕婦的HCMV感染率明顯高于正常孕婦。但目前HCMV導(dǎo)致宮內(nèi)感染及引起自然流產(chǎn)的具體機(jī)制和途徑尚不清楚。已有研究[8]表明，免疫應(yīng)答能夠激活外周血單核細(xì)胞中的HCMV，誘發(fā)自身免疫性疾病的發(fā)生。該研究通過(guò)檢測(cè)62例自然流產(chǎn)孕婦的外周血，探討HCMV活動(dòng)性感染與自然流產(chǎn)關(guān)系機(jī)制，進(jìn)一步為臨床治療預(yù)防流產(chǎn)提供新的思路。

1 材料與方法

1.1病例資料

1.1.1病例組 根據(jù)如下納入和排除標(biāo)準(zhǔn)收集來(lái)合肥市第三人民醫(yī)院就診的自然流產(chǎn)孕婦62例作為病例組，所有研究對(duì)象符合2004年《婦產(chǎn)科學(xué)》的診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]；病例組年齡為21～34(26.47±7.43)歲，孕周為7～14周，平均孕周(10.65±3.62)周；納入標(biāo)準(zhǔn)：① 病例組孕婦經(jīng)臨床檢查，均符合2004年《婦產(chǎn)科學(xué)》的診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]；② 孕婦生殖器結(jié)構(gòu)正常，無(wú)染色體異常和內(nèi)分泌疾?。虎?孕婦和家屬了解本研究?jī)?nèi)容，簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：① 因生殖器結(jié)構(gòu)異常、遺傳因素、內(nèi)分泌因素造成的自然流產(chǎn)患者；② 惡性腫瘤患者；③ 孕期曾使用過(guò)導(dǎo)致胚胎異常的藥物；④ 由于各種原因難以配合研究進(jìn)行的患者。根據(jù)cMV-IgM的檢測(cè)結(jié)果對(duì)自然流產(chǎn)孕婦進(jìn)行分組。其中，cMV-IgM陽(yáng)性患者為HCMV活動(dòng)性感染組，cMV-IgM陰性患者為HCMV非活動(dòng)性感染組。

1.1.2對(duì)照組 選擇同期體檢正常孕婦51例作為對(duì)照組。對(duì)照組年齡為22～34(26.68±7.32)歲，孕周為7～15周，平均孕周(10.73±3.27)周。研究對(duì)象的主要基線(xiàn)指標(biāo)如年齡、孕周等，經(jīng)檢驗(yàn)兩組基本平衡(P>0.05)，具有可比性。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本采集 抽取所有孕婦的清晨空腹靜脈血4 ml，分為兩管，每管2 ml。其中一管加入溶血試劑，待提取全血DNA。另一管，靜置5 min后，進(jìn)行4 ℃離心，2 000 r/min離心15 min，留取上清液保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2檢測(cè)方法

1.2.2.1抽提全血DNA進(jìn)行HCMV-DNA表達(dá)水平檢測(cè) 采用酚氯仿抽提法提取全血DNA，PCR體外擴(kuò)增HCMV-DNA，PCR反應(yīng)采用Tap DNA聚合酶，擴(kuò)增片段430 bp，操作完全按照實(shí)際說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。全血DNA的抽提步驟如下：① 全血1 300 r/min離心15 min；② 將上層白細(xì)胞吸到1.5 ml離心管中，加滅菌過(guò)的純水至1.5 ml刻度，4 ℃、4 000 r/min離心15 min；③ 去上層血清，加無(wú)菌水1 ml溶血；④ 4 ℃、3 500 r/min離心10 min，重復(fù)3次；⑤ 加TES 720 μl，RNAase A 5 μl，室溫靜置20 min(消化RNA)；⑥ 加入蛋白酶K(10 mg/ml)15 μl，56 ℃消化3～4 h，直至沒(méi)有肉眼可見(jiàn)的懸浮物；⑦ 加入等體積(740 μl)酚，翻轉(zhuǎn)10 min混勻；15 000 r/min離心15 min，吸取上層水相640 μl；⑧ 加入等體積(640 μl)酚，翻轉(zhuǎn)10 min混勻；15 000 r/min離心15 min，吸取上層水相520 μl；⑨ 加入等體積(520 μl)酚-氯仿-異戊醇，翻轉(zhuǎn)10 min混勻；17 000 r/min離心15 min，吸取上層水相400 μl；⑩ 加入3 mol/L 乙酸鈉(pH 5.2)40 μl(1/10體積)，加入880 μl(兩倍體積)的無(wú)水乙醇(-20 ℃預(yù)冷)，翻轉(zhuǎn)20次混勻，出現(xiàn)白色絮狀DNA沉淀。4 ℃、15 000 r/min離心10 min，小心倒掉上清液，在吸水紙上扣干殘液；加入70% 乙醇1 ml重懸沉淀，4 ℃、15 000 r/min離心5 min，小心倒掉上清液，在吸水紙上扣干殘液，用無(wú)菌棉簽擦拭離心管內(nèi)壁，勿碰到DNA沉淀；打開(kāi)管蓋，室溫靜置3 min，加純水40 μl，用移液槍吹洗5次混勻，室溫靜置10 min；測(cè)定濃度和A260/A280，-20 ℃保存。

1.2.2.2ELISA法檢測(cè)血清中cMV-IgM、 腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α, TNF-α)、白介素-1(interleukin-1，IL-1)、IL-6的表達(dá)水平 另一管外周血進(jìn)行血清中cMV-IgM、TNF-α、IL-1、IL-6表達(dá)水平檢測(cè)，采用ELISA法進(jìn)行檢測(cè)(試劑盒購(gòu)自美國(guó)Genzyme公司)。ELISA法步驟如下：從4 ℃冰箱中取出人IL-1、IL-6和TNF-α ELISA檢測(cè)試劑盒，放在室內(nèi)待其溫度與室內(nèi)溫度達(dá)到平衡。配置不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品：向試劑盒中凍干標(biāo)準(zhǔn)品的試管加入1 ml的標(biāo)準(zhǔn)品及樣品稀釋液，室溫靜置10 min，待標(biāo)準(zhǔn)品凍干粉充分溶解后，輕輕搖勻即可得到濃度為1 000 pg/ml的標(biāo)準(zhǔn)品。將1 000 pg/ml的標(biāo)準(zhǔn)品在嚴(yán)格滅菌且無(wú)內(nèi)毒素的試管進(jìn)行倍比稀釋。稀釋成濃度依次為0、15.63、31.25、62.5、125、250、500、1 000 pg/ml。將濃縮洗滌液、生物素化抗體和辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合物稀釋成工作液，放置室溫中待用，同時(shí)將血清樣本放置室內(nèi)平衡至室溫。本實(shí)驗(yàn)中設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣本孔、空白孔，待測(cè)樣本孔中加入樣本稀釋液100 μl，標(biāo)準(zhǔn)孔和待測(cè)樣本孔需要添加對(duì)應(yīng)的樣品100 μl，而空白孔中需要加對(duì)照樣品，輕輕搖晃使其混勻。用覆膜將酶標(biāo)板覆蓋，放溫箱中37 ℃孵育60 min。溫箱取出酶標(biāo)板，棄去液體，洗板機(jī)洗板5次，洗板結(jié)束后輕輕拍干使其沒(méi)有殘留的液體。每孔中加入稀釋后的酶結(jié)合物工作液100 μl，然后加上覆膜，恒溫箱37 ℃孵育30 min。溫箱取出酶標(biāo)板，棄去液體，洗板機(jī)洗板5次，結(jié)束后輕輕拍干使其沒(méi)有殘留的液體。TMB底物溶液按每個(gè)孔都要加入100 μl，37 ℃恒溫箱顯色15 min。最后加入反應(yīng)終止液每孔50 μl，停止反應(yīng)，這時(shí)由藍(lán)色立即轉(zhuǎn)化成了黃色，每個(gè)待測(cè)樣本重復(fù)3孔，在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)量每個(gè)樣本對(duì)應(yīng)3孔的吸光度(optical density, OD)值，取平均值并保存數(shù)據(jù)。

1.3病理染色收集組織固定于福爾馬林中，再流水沖洗過(guò)夜，經(jīng)過(guò)脫水包埋，制成石蠟組織塊，再進(jìn)行組織切片、脫蠟水化、染色，最后進(jìn)行脫水、透明、封片、拍照。通過(guò)HE染色觀察組織情況。HE染色步驟如下：① 將已入蒸餾水后的切片放入蘇木精水溶液中染色20 min；② 酸水及氨水中分色，10～15 s；③ 流水沖洗1 h后入蒸餾水2 min；④ 入70%和90%酒精中脫水各10 min；⑤ 入酒精伊紅染色液染色2～3 min；⑥ 純酒精脫水，二甲苯透明，樹(shù)膠封固。

表1 病例組與對(duì)照組HCMV-DNA和cMV-IgM水平比較[n(%)]

與對(duì)照組比較：*P<0.05，***P<0.001

2 結(jié)果

2.1病例組與對(duì)照組HCMV-DNA和cMV-IgM水平比較病例組HCMV-DNA的陽(yáng)性率(16.13%)高于對(duì)照組(3.92%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；cMV-IgM的陽(yáng)性率(37.10%)也高于對(duì)照組(7.84%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。見(jiàn)表1。

2.2病例組與對(duì)照組炎性細(xì)胞因子水平比較病例組與對(duì)照組炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1、IL-6水平水平進(jìn)行比較，結(jié)果顯示：病例組患者的血清TNF-α、IL-1、IL-6水平明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。見(jiàn)表2。

表2 病例組與對(duì)照組炎性細(xì)胞因子水平比較

與對(duì)照組比較：***P<0.001

2.3HCMV活動(dòng)性感染組與非活動(dòng)性感染組炎性細(xì)胞因子水平比較根據(jù)檢測(cè)結(jié)果將流產(chǎn)孕婦分為HCMV活動(dòng)性感染組與非活動(dòng)性感染組，比較兩組炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1、IL-6水平的差異，結(jié)果顯示：活動(dòng)性感染組的血清TNF-α、IL-1、IL-6水平明顯高于非活動(dòng)性感染組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。見(jiàn)表3。

表3 HCMV活動(dòng)性感染組與非活動(dòng)性感染組炎性細(xì)胞因子水平比較

與HCMV非活動(dòng)性感染組比較：***P<0.001

2.4血清TNF-α、IL-1、IL-6水平與HCMV感染相關(guān)性的Logistic回歸分析以?xún)山M孕婦資料為樣本，以是否有HCMV活動(dòng)性感染為應(yīng)變量，并賦值1=有此感染，0=否。建立非條件Logistic回歸模型。以血清TNF-α、IL-1、IL-6水平為自變量，并在回歸前均行兩分類(lèi)轉(zhuǎn)化(轉(zhuǎn)化及賦值方法：1=≥對(duì)應(yīng)指標(biāo)的兩組總均值，0=<對(duì)應(yīng)指標(biāo)的兩組總均值)?；貧w過(guò)程采用后退法(α退出=0.05)，以進(jìn)行自變量的選擇和剔除。回歸結(jié)果顯示：TNF-α、IL-1、IL-6等三指標(biāo)均被保留入回歸方程，其OR值均>1，P<0.05，提示該三指標(biāo)(升高)均為HCMV活動(dòng)性感染的危險(xiǎn)影響因素。回歸結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 血清TNF-α、IL-1、IL-6水平與HCMV活動(dòng)性感染的Logistic回歸分析

2.5HCMV感染表達(dá)陽(yáng)性病理圖示例HCMV感染表達(dá)陽(yáng)性的病理見(jiàn)圖1A～1D。圖1A組織取自蛻膜，可見(jiàn)組織中大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，伴微小膿腫形成；圖1B組織取自絨毛，間質(zhì)纖維組織輕度增生，絨毛間隙見(jiàn)出血，周?chē)甜B(yǎng)層細(xì)胞萎縮；圖1C組織取自蛻膜，可見(jiàn)蛻膜組織退變壞死；圖1D組織取自絨毛，呈現(xiàn)間隙明顯出血，絨毛體積小，周?chē)甜B(yǎng)層細(xì)胞萎縮。HCMV感染表達(dá)陰性的病理見(jiàn)圖1E、1F。圖1E、圖1F組織均取自絨毛，鏡下可見(jiàn)正常絨毛及滋養(yǎng)層細(xì)胞，絨毛間質(zhì)無(wú)水腫及纖維化，間隙無(wú)出血及炎細(xì)胞浸潤(rùn)。

3 討論

HCMV屬于皰疹病毒科β亞科，廣泛存在于人體中并能引起人體的多種疾病[7]。與其他皰疹病毒一樣，HCMV感染會(huì)在宿主體內(nèi)的白細(xì)胞、唾液腺等處建立持續(xù)終身的潛伏感染，然而，該類(lèi)感染對(duì)健康人體并沒(méi)有危害。但是，HCMV感染對(duì)免疫功能低下的個(gè)體，如胎兒、嬰幼兒、器官移植患者、艾滋病患者、干細(xì)胞治療患者以及使用免疫抑制劑的患者均可造成致死性損傷[5,10]。HCMV是目前已知引起孕婦和胎兒宮內(nèi)感染的最常見(jiàn)、危害最大的一種病毒[11]。妊娠婦女感染HCMV是導(dǎo)致妊娠不良結(jié)局的重要因素之一[4-5]。HCMV可通過(guò)胎盤(pán)致使胎兒宮內(nèi)感染，導(dǎo)致胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩、胎兒智力和聽(tīng)力受損、死胎、流產(chǎn)、早產(chǎn)、畸形、新生兒死亡等。目前，HCMV病毒感染引起流產(chǎn)已然引起了廣泛的重視。

圖1 HCMV感染表達(dá)陽(yáng)性病理圖及陰性對(duì)照示例(HE染色)

然而，關(guān)于HCMV活動(dòng)性感染導(dǎo)致孕婦流產(chǎn)的具體機(jī)制尚需不清楚。近年來(lái)，cMV感染作為一類(lèi)全身感染性疾病，已被列為性傳播疾病，HCMV的感染可因妊娠免疫力低下而激活[12]。研究[13]表明，正常妊娠期間，母體機(jī)體處于免疫抑制狀態(tài)，輔助型T細(xì)胞2型(helper T cell 2, Th2)免疫應(yīng)答具有優(yōu)勢(shì)，而HCMV感染可以調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子GATA-3(GATA結(jié)合蛋白3)和T-bet(T- box基因家族轉(zhuǎn)錄因子)的表達(dá)，使GATA-3上調(diào)，T-bet下調(diào)，促進(jìn)Th2型細(xì)胞的分化從而進(jìn)一步抑制免疫功能。TNF-α是HCMV感染的免疫反應(yīng)中的關(guān)鍵因子，可以激活病毒基因轉(zhuǎn)錄，活化HCMV增強(qiáng)子，上調(diào)HCMV基因表達(dá)，繼而促進(jìn)一系列細(xì)胞因子分泌[12]。

本研究通過(guò)收集自然流產(chǎn)孕婦和同期體檢正常孕婦的外周血并進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)，結(jié)果表明：自然流產(chǎn)孕婦的HCMV-DNA和cMV-IgM的陽(yáng)性率顯著高于對(duì)照組；自然流產(chǎn)孕婦血清中的炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1、IL-6的表達(dá)水平均顯著提高，說(shuō)明自然流產(chǎn)孕婦存在著HCMV活動(dòng)性感染。研究[14]顯示，免疫應(yīng)答能夠激活外周血單核細(xì)胞中的HCMV，誘發(fā)自身免疫性疾病的發(fā)生，感染HCMV的孕婦會(huì)出現(xiàn)原因不明的復(fù)發(fā)性流產(chǎn)，誘發(fā)其自身出現(xiàn)免疫性疾病，需要采用免疫治療的方法進(jìn)行治療。在妊娠過(guò)程中，細(xì)胞因子充當(dāng)重要的輔助作用，當(dāng)其含量出現(xiàn)異常時(shí)則表現(xiàn)為病理妊娠。IL-1、IL-6、TNF-α均與感染性疾病相關(guān)，過(guò)量的分泌將導(dǎo)致機(jī)體的免疫損傷。本研究對(duì)比了自然流產(chǎn)患者中HCMV活動(dòng)性感染組與非活動(dòng)性感染組的TNF-α、IL-1、IL-6表達(dá)水平差異，結(jié)果顯示上述炎性細(xì)胞因子在HCMV活動(dòng)性感染組患者的水平明顯高于非活動(dòng)性感染組，證明血清中TNF-α、IL-1、IL-6的表達(dá)水平與自然流產(chǎn)存在密切關(guān)聯(lián)，是HCMV活動(dòng)性/自然流產(chǎn)狀態(tài)的危險(xiǎn)影響因素。

綜上所述，HCMV活動(dòng)性感染會(huì)抑制孕婦免疫功能，促使宮內(nèi)感染，與孕婦自然流產(chǎn)關(guān)系密切。本研究將為闡明HCMV感染引起自然流產(chǎn)提供理論依據(jù)，同時(shí)，為臨床治療預(yù)防流產(chǎn)提供新的視角。